O ensaio baseado em microscopia para estudar e analisar os endossomos de reciclagem usando o tráfico de SNARE

A biossíntese de pigmentos de melanina ocorre em melanósias, uma organela lysosome específica de melanócito (LRO) que coexiste com lysososomes convencionais. O sistema endocítico desempenha um papel fundamental na biogênese dos melanomas, necessário para a cor da pele e fotoproteção contra radiação ionizante1,2,3. Durante esse processo, as enzimas sintetizadoras de melanina são classificadas em endosários precoces/de triagem e depois transportadas para melanomas prematuros através de endosários tubulares ou vesiculares chamados endosários de reciclagem (REs)4,5,6,7,8,9,10. O direcionamento e fusão dessas organelas regulam o amadurecimento de melanosomes pigmentados totalmente funcionais7,11,12,13,14. Defeitos na formação dessas organelas ou triagem de cargas para essas organelas causam albinismo oculocutâneo e outros fenótipos clínicos, observados na síndrome de Hermansky-Pudlak15,16.

Aqui descrevemos uma técnica simples baseada em microscopia para estudar e analisar os REs. Neste método, aproveitamos uma proteína transmembrana, a Rexexina Qa-SNARE (STX)13 que reside na reciclagem de endossolas17 e ciclos entre endossários de triagem e melanócitos12,18. Além disso, a exclusão do domínio regulatório não estruturado n-terminal (ou seja, SynN ou ^STX13Δ129) permite que o SNARE fique preso em melanomas, o que mede o caminho de tráfico para o ^melanosome12. Usamos um marcador endossomal de reciclagem conhecido Rab GTPase (Rab)11 em nossos ^estudos14,19. A imagem de fluorescência das proteínas GFP-STX13WT, GFP-STX13Δ129, mCherry-Rab11 e TYRP1 em melanócitos do tipo selvagem seguidos de quantificação de sua localização relativa fornecerá a natureza e a dinâmica das REs, além de sua segmentação para melanósimos. Assim, esta é uma técnica simples que pode ser usada para visualizar e medir a dinâmica dos REs em melanócitos.

O protocolo envolve a semeadura de melanócitos seguidos pela transfecção dos plasmídeos. Outras etapas incluem fixação, imunostaining, imagem e análise das células para medir o comprimento e o número de REs. A descrição detalhada do protocolo é dada abaixo.

1. Semeadura de melanócitos de rato em tampas pré-tratadas

1. Cubra as tampas de vidro em uma placa de Petri (ou seja, 4 - 5 em uma placa de 35 mm) com meio de matriz de membrana de porão (1:20 em meio RPMI completo: RPMI + 10% de calor inativado FBS + 1x Glutamina + 1x Mistura de antibiótico) e seque-o na capa de cultura tecidual por 15 min. Lave as tampas uma vez com 1x PBS antes de usar.
2. Mantenha os melancias de camundongos do tipo selvagem (melan-Ink4a-Arf-1 de C57BL/6J, a/a, Ink4a-Arf^-/- ratos, descritos em ²⁰ e disponíveis no The Welcome Trust Functional Genomics Cell Bank) em uma placa de Petri (ou seja, 35 ou 60 mm de prato) complementada com meio RPMI completo.
   1. Lave as células duas vezes com 1x PBS e adicione 0,5 ou 1 mL de solução Trypsin-EDTA (0,25%) para células experimentadoras. Incubar as células a 37 °C por 2 - 5 min para o desprendimento da placa de Petri.
   2. Adicione 1 - 2 mL de meio RPMI completo, suspenda e transfira as células para um tubo de centrífuga.
3. Centrifugar a suspensão da célula a 4 °C, 376 x g por 5 min e, em seguida, resuspensar a pelota em 1x PBS.
4. Repita a etapa de centrifugação e resuspense as células em 1 mL de meio RPMI completo.
5. Semear as células na membrana do porão de coberturas de camadas médias revestidas a 50-60% de confluência (aproximadamente 6 x ¹⁰⁵ células em um prato de cultura celular de 35 mm contendo 4 - 5 tampas). Adicione sempre 200 nM de PMA (adicione 5 μL de estoque de trabalho 40 μM phorbol 12-myristate 13-acetato) à suspensão de célula cravada em meio RPMI completo.
6. Após a semeadura, incubar a placa a 37 °C por 12-24 h.

2. Transfecção de células com os plasmídeos STX13

1. Use os seguintes reagentes: pEGFP-C1-STX13WT e pEGFP-C1-STX13Δ129 (descrito em ¹²). mCherry-Rab11, foi um gentil presente de Graça Raposo, Institut Curie, Paris (descrito em ^{referência19}). Anticorpo anti-TYRP1 da ATCC (TA99).
2. Após 12 - 24 h de semeadura, transfete as células com plasmídeos usando um reagente de transfecção à base de lipídio. Para um prato de 35 mm, pegue 5 μL do reagente de transfecção em 250 μL de meio OPTI-MEM em um tubo de microcentrifusagem e tome aproximadamente 200 ng de cada plasmídeo em 250 μL de OPTI-MEM.
3. Incubar os tubos contendo DNA e o reagente de transfecção por 5 minutos. Misture sem a pipetação repetida (o volume total será de cerca de 500 μL). Incubar por 30 minutos à temperatura ambiente. Faça toques manuais do tubo a cada 10 minutos por 30 min no RT.
4. Durante a incubação, lave as células duas vezes com 1x PBS, uma vez com OPTI-MEM e, em seguida, adicione 1 mL de OPTI-MEM às células.
5. Após 30 minutos de incubação, adicione a mistura reagente-DNA de transfecção às células de forma dropwise, cobrindo o prato.
6. Incubar as células a 37 °C por 6 h. Aspire o meio OPTI-MEM com reagente de transfecção e adicione meio RPMI completo complementado com 200 nM de PMA.
7. Incubar as células a 37 °C por 48 h.

3. Fixação das células

NOTA: O procedimento a seguir é realizado fora da capa da cultura tecidual.

1. Após 48 h de transfecção, lave as células duas vezes com 1x PBS e, em seguida, fixe as células com 3% de formaldeído (recém-preparado em 1x PBS) por 30 minutos.
2. Após a fixação, lave as células duas vezes com 1x PBS e armazene as tampas em 1x PBS até usar mais. Alternativamente, as células podem ser montadas em lâminas de vidro (veja abaixo) ou armazenadas a 4 °C.

4. Imunostaining das células

1. Prepare uma câmara úmida: coloque peça cortada de filme de parafina em papel filtro úmido em uma placa de Petri, coberta com papel alumínio.
2. Prepare 25 μL de solução de anticorpos primários (0,2% saponina em 1x PBS, 0,1% BSA em 1x PBS e 0,02% azide de sódio em 1x PBS). Adicione anticorpos a uma diluição de 1:200. Adicione esta solução como uma gota em um filme de parafina na câmara úmida.
3. Levante cuidadosamente o deslizamento com fórceps, inverta-o nesta gota de solução primária de coloração de anticorpos e, em seguida, cubra a tampa da câmara úmida. Incubar em temperatura ambiente por 30 minutos.
4. Da mesma forma, prepare a solução de anticorpos secundários em uma diluição de 1:500 e coloque-a em filme de parafina ao lado do deslizamento de tampas na câmara úmida. Para coloração do núcleo, adicione DAPI (1:20.000 a 1:30.000) à solução.
5. Usando fórceps, pegue cuidadosamente o deslizamento de tampas da solução de anticorpos primário e mergulhe-o três vezes em 1x PBS (em um copo de vidro).
6. Toque na tampa no papel de tecido para remover o excesso de PBS na tampa. Coloque-o sobre a solução secundária de coloração de anticorpos na câmara úmida e não exponha à luz devido à presença de anticorpos fluorescentes marcados na solução.
7. Incubar a tampa novamente por 30 minutos em temperatura ambiente. Por favor, sempre observe o lado do deslizamento que tem as células ao longo dessas etapas.
8. Após a incubação, pegue cuidadosamente o deslizamento de tampas da solução de anticorpos secundários e, em seguida, mergulhe-o três vezes em 1x PBS. Além disso, toque a mancha de cobertura no papel de tecido para remover o excesso de PBS na tampa.
9. Coloque 12 μL de reagente de montagem Fluoromount-G em um slide de vidro e coloque cuidadosamente o talo de coberturas manchadas (voltado para o vidro) no reagente de montagem. Inverta o deslizamento de vidro no papel de tecido e, em seguida, pressione suavemente.

5. Microscopia de fluorescência das células

1. Imagem das células manchadas sob filtros de campo brilhante (BF) e fluorescência (IF) usando um microscópio de fluorescência invertido equipado com uma câmera CCD usando objetivo apocromático de 60x (óleo) ou qualquer outro microscópio com uma configuração semelhante.

6. Quantificação da sobreposição entre as proteínas localizadas re e os melanomas:

NOTA: As seguintes etapas são seguidas para a quantificação do coeficiente de sobreposição de Mander entre as proteínas usando o software Fiji (livremente baixado do link: https://imagej.net/software/fiji/). Use a imagem TIFF com vários canais.

1. Abra a imagem bruta. Vá para a opção Imagem, selecione Cores | Divida os canais e utilize os dois canais para análise.
2. Abra o plugin JACoP na opção Plugin.
3. Defina o limite para ambos os canais, de tal forma que todos os pontos brilhantes sejam selecionados e o plano de fundo seja eliminado.
4. Vá para a opção Análise, selecione coeficientes M1 e M2 para obter o coeficiente de sobreposição de Mander.
5. Pressione a opção Analisar no Plugin JACoP e veja o resultado que exibe o coeficiente de sobreposição de Mander.

7. Quantificação do número e comprimento tubulares da reciclagem de endosomes:

NOTA: As seguintes etapas são seguidas para a quantificação do número e comprimento dos túbulos usando o software Fiji.

1. Abra a imagem bruta Vá para a imagem, selecione Cores | Divida os canais e utilize o canal desejado para análise.
2. Vá para imagem novamente, selecione Tipo | Converta-se em imagem de 8 bits.
3. Em seguida, vá para Plugins, selecione Analisar | Tubeness. Definir o valor sigma em 0,1075 . Pressione Ok.
4. Vá para Imagem novamente, selecione Tipo | Converta-se em imagem de 8 bits.
5. Vá para | de Imagem Ajuste | Limiar (Use os mesmos valores de limiar para todas as imagens. As imagens devem ter uma intensidade aproximadamente igual).
6. Vá para Process | | binário Converta-se em máscara.
7. Vá para Processar, selecione Binário e selecione Skeletonize.
8. Vá para Analisar, selecione Esqueleto e escolha Analisar esqueleto. Em resultado e saída | selecionar ( a) Calcular o maior caminho mais curto | (b) mostrar informações detalhadas | (c) exibir o esqueleto rotulado. Pressione Ok.
   NOTA: O resultado será aberto no formato tabulado. A coluna de comprimento médio do ramo mostra o comprimento de todos os diferentes túbulos da célula selecionada (escala definida para obter valores em micrometos).
9. Para obter o número de túbulos na célula, vá para Analisar e selecione Analisar a opção Analisar partículas . Pressione Ok.
   NOTA: Nos resultados obtidos, a coluna de contagem mostra o número de túbulos naquela célula específica.
10. Salve os dados e analise.

Quantificação da localização mutante STX13Δ129 para os melanomas
A microscopia de imunofluorescência de STX13 em melanócitos do tipo selvagem do rato mostrou GFP-STX13WT localizado como estruturas vesiculares e tubulares e GFP-STX13Δ129 localizado como estruturas semelhantes a anéis, além da superfície celular (Figura 1A). Além disso, o anel intracelular GFP-STX13Δ129 mostrou colocalização com a proteína melanósia TYRP1 (Figura 1A) e melanósias de campo brilhante (dados não mostrados)12. Como mostrado anteriormente, uma coorte de GFP-STX13WT superexpresso é observada em melanosolas12. Para medir a localização relativa de GFP-STX13WT e GFP-STX13Δ129 para melanomas, usamos Fiji e analisamos com plugin JACoP. O coeficiente de sobreposição (MOC) medido de Mander entre GFP-STX13Δ129 com TYRP1 é aproximadamente 1,5 dobras maior em comparação com GFP-STX13WT com TYRP1 (Figura 1B). Curiosamente, o TYRP1 mostrou 2,9 dobras mais altas de valores moc com GFP-STX13Δ129 em comparação com GFP-STX13WT (Figura 1B). Esses dados indicam que a localização de GFP-STX13Δ129 para melanomas é relativamente maior em comparação com o GFP-STX13WT em um estado estável.

Quantificação da localização do STX13WT para os endosses de reciclagem
A microscopia de imunofluorescência de GFP-STX13WT mostrou colocalização com proteína endossomal de reciclagem conhecida Rab11 (expressa como mCherry-Rab11) (Figura 2A,B). O MOC medido entre GFP-STX13WT com mCherry-Rab11 é aproximadamente 1,4 vezes maior em comparação com mCherry-Rab11 com GFP-STX13WT (Figura 2B). Para medir o número e o comprimento dos túbulos endosomais positivos do GFP-STX13WT, usamos o software Fiji como descrito na seção de protocolo. mCherry-Rab11 é usado como um controle positivo nos experimentos (Figura 2). Os melanócitos transfectados com GFP-STX13WT apresentaram maior número de túbulos por célula em comparação com células expressas mCherry-Rab11 (gráfico superior figura 2C, compare a barra A com a barra B). No entanto, os números dos túbulos são reduzidos após a co-expressão de GFP-STX13WT e mCherry-Rab11 nas células (Gráfico superior figura 2C, compare a barra A com C e a barra B com D). Curiosamente, o comprimento médio do túbulo (μm) tanto para GFP-STX13WT quanto para mCherry-Rab11 é comparável entre si em células expressas individual ou em conjunto (gráfico inferior da Figura 2C). Juntos, esses dados sugerem que o GFP-STX13WT localiza-se em REs como semelhante ao Rab11.

Figura 1: Localização de melan-STX13WT e GFP-STX13Δ129 para melanócitos de tipo selvagem. (A) Melan-Ink4a-Arf-1 melan-1 melan-1 melan-1 foram transfectados com GFP-STX13WT e GFP-STX13Δ129. As células foram fixadas, manchadas com anticorpo anti-TYRP1 e depois analisadas por microscopia de fluorescência. Os insets são uma visão ampliada das áreas brancas encaixotados. As setas apontam para a localização de REs GFP-STX13WTto e GFP-STX13Δ129 para melanomas. Barras de escala, 10 μm. (B) Quantificação da colocalização entre STX13 e TYRP1. O coeficiente de sobreposição (M) de Mander entre GFP-STX13WT ou GFP-STX13Δ129 com TYRP1 e vice-versa está representado (média ± S.E.M.) separadamente na trama. N=3. *p ≤0,05 e ****p ≤0.0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: A localização dos melan-stx13WT para reciclagem de endosários em melanócitos do tipo selvagem. (A) Melan-Ink4a-Arf-1 melan-arf-1 melan-1 foram transfectados com GFP-STX13WT e mCherry-Rab11. As células foram fixadas e analisadas por microscopia de fluorescência. Os insets são uma visão ampliada das áreas brancas encaixotados. As setas apontam para a localização de compartimentos GFP-STX13WT para mCherry-Rab11-positive. Barras de escala, 10 μm. (B) Quantificação da colocalização entre STX13 e Rab11. O coeficiente de sobreposição de Mander (M) entre GFP-STX13WT com mCherry-Rab11 e vice-versa é representado (média ± S.E.M.) separadamente na trama. N=3. p ≤0.001. C. Quantificação de número e comprimento (em μm) de REs STX13 ou Rab11 positivos. O número médio de túbulos/células e o comprimento médio do túbulo de GFP-STX13WT e mCherry-Rab11 são representados (média ± S.E.M.) separadamente na trama. N=3. Observe que as células são transfeinadas com GFP-STX13WT e mCherry-Rab11 em (C) e (D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores declaram que não têm conflito de interesses.