Processamento de amostras de proteômica de espingarda automatizada por um robô de laboratório de código aberto

Summary

Protocolo detalhado e três scripts Python são fornecidos para operar um sistema de manuseio líquido robótico de código aberto para realizar a preparação semi-automatizada de amostras de proteína para experimentos de espectrometria de massa, cobrindo a remoção de detergentes, digestão de proteínas e etapas de desalização de peptídeos.

Abstract

Experimentos de proteômica de espingarda à base de espectrometria em massa requerem múltiplas etapas de preparação de amostras, incluindo digestão e limpeza de proteínas enzimáticas, que podem ocupar horas significativas de trabalho de banco e apresentar uma fonte de variabilidade em lote. A automação de laboratório com robôs de pipetting pode reduzir o trabalho manual, maximizar o throughput e aumentar a reprodutibilidade da pesquisa. Ainda assim, os preços iniciais acentuados das estações de automação padrão as tornam inacessíveis para muitos laboratórios acadêmicos. Este artigo descreve um fluxo de trabalho de preparação de amostras de proteômica usando um sistema de automação de código aberto acessível (The Opentrons OT-2), incluindo instruções para a configuração de redução de proteínas semi-automatizadas, alquilação, digestão e etapas de limpeza; além de acompanhar scripts Python de código aberto para programar o sistema OT-2 através de sua interface de programação de aplicativos.

Introduction

A proteômica da espingarda baseada em espectrometria em massa é uma ferramenta poderosa para medir a abundância de muitas proteínas em amostras biológicas simultaneamente. Experimentos proteômicos com análise bioinformática são rotineiramente empregados para identificar biomarcadores e descobrir complexos biológicos associados e caminhos que sustentam mecanismos patológicos. Com sua alta especificidade de analito e potencial precisão quantitativa, a proteômica da espingarda também tem excelente potencial para ser adotada por instalações de pesquisa e laboratórios de diagnóstico para análise de amostras clínicas sem a necessidade de contar com ^anticor....

Protocol

Os scripts Python desenvolvidos foram depositados no GitHub em: https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons. Uma cópia dos scripts é dada no Arquivo Suplementar 1. Consulte o repositório do GitHub para obter as versões mais recentes.

1. Preparações experimentais

1. Verifique o hardware necessário antes de iniciar o protocolo.
   NOTA: Os seguintes componentes de hardware são necessários: pipetas OT-2, pontas de pipeta, conjunto de rack de tubo 4 em 1, conjunto de blocos de alumínio, módulo magnético, módulo de temperatura, placas de poço de 2 mL de 96 poços profundos (ver Tab....

Results

São fornecidos três scripts Python aqui compatíveis com o robô OT-2, e que realizam a preparação da amostra para proteômica de espectrometria de massa com uma única proteína padrão de soro bovino albumina (réplicas técnicas n = 5 digestões) e uma amostra de liseto cardíaco humano contendo detergente (n = 5 digestões). Cada produto digesto é particionado em duas reações de limpeza de peptídeos. O número de correspondências identificadas de espectro de peptídeos (PSMs), peptídeos e proteínas em cada execução da BSA e amost.......

Discussion

Passos críticos dentro do protocolo
Para o melhor desempenho, devem ser utilizados labware, módulos e consumíveis compatíveis com OT-2. O labware personalizado pode ser criado seguindo as instruções do Opentrons no ^Reference14. Certifique-se de calibrar o deck OT-2, pipetas e labware quando usado pela primeira vez. Também é fundamental seguir as diretrizes do fabricante de contas SP3 para preparar contas para peptídeos e limpeza de proteínas. Notavelmente, durante a reação de l.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
300 µ L ponteiras de pipeta	Opentrons
Conjunto de rack de tubo 4 em 1	Opentrons		Cada conjunto inclui 2 suportes de base e 4 suportes de tubo de 1,5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL e 50mL. Usamos tops de 2mL e 15 mL + 50 mL neste estudo.
Acclaim PepMap 100 C18 Coluna HPLC	Thermo Scientific	#164568	3 μ partícula m; 100 & poro; 75 μ m x 150 mm
Acetonitrila LC-MS grau	VWR
Conjunto de blocos de alumínio	Opentrons		Este conjunto de blocos inclui 3 tampos que são compatíveis com tubos de 96 poços e 2,0 mL e uma tira PCR para utilizar com o módulo de temperatura OT-2. Usamos o suporte do tubo de 2,0 mL neste manuscrito.
Bicarbonato de amônio	Sigma-Aldrich	# A6141
Albumina de soro bovino padrão, 2 mg/mL	Thermo Scientific	#23210
Dimetilsulfóxido (DMSO) LC-MS grau	Thermo Scientific	#85190
Ditiotreitol	Sigma-Aldrich	#D5545
EASY-Spray HPLC Colunas	Thermo Scientific	#ES800A
EasynLC 1200 Nano LC	Thermo Scientific	#LC140
Prova de Etanol 195-200	Fisher	#04-355-720
Ácido Fórmico LC-MS grau	Thermo Scientific	#85178
Lisado de coração humano	Novus Biologicals	NB820-59217
Iodoacetamida	Sigma-Aldrich	#I1149
Rack	de tubo magnéticoThermo Scientific	#MR02
MAXQuant v.1.6.10.43			Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/)
mySPIN 6 Mini Centrífuga Mini Centrífuga	Thermo Scientific	#75004061	para rotação rápida
NEST 2 mL Placa de poço profundo de 96 poços, módulo	Opentrons
OT-2	em V Opentrons		GEN1
Pipeta de canal único OT-2 P300	Opentrons		GEN1
OT-2 P50 pipeta de canal único	Opentrons		GEN1
OT-2 robô de pipetagem	Opentrons	OT-2
OT-2 módulo de temperatura	Opentrons		GEN1
Pierce Ensaio de Peptídeo Colorimétrico Quantitativo	Thermo Scientific	#23275
Tubos de proteína LoBind 2,0 mL	Eppendorf	#022431102
Banco de dados de sequências de proteínas	UniProt/SwissProt		https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 20revisado:sim
Partículas magnéticas modificadas com carboxilato Sera-Mag SpeedBead, Cytiva hidrofóbica		#65152105050250
Partículas magnéticas modificadas com carboxilato, Evaporador a vácuo hidrofílico	Cytiva	#45152105050250
	SpeedVac Thermo Scientific
Espectrômetro de massa HF exativo Thermo	Scientific	#IQLAAEGAAPFALGMBFZ
Tripsina MS Grau	Thermo Scientific	#90057
Água LC-MS grau	VWR	#BDH83645.400