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Artigo de método

Processamento de amostras de proteômica de espingarda automatizada por um robô de laboratório de código aberto

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DOI:

10.3791/63092

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28 de outubro de 2021

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1Department of Medicine-Cardiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Department of Biochemistry & Molecular Genetics, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Consortium for Fibrosis Research & Translation, School of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Neste artigo

Resumo

Protocolo detalhado e três scripts Python são fornecidos para operar um sistema de manuseio líquido robótico de código aberto para realizar a preparação semi-automatizada de amostras de proteína para experimentos de espectrometria de massa, cobrindo a remoção de detergentes, digestão de proteínas e etapas de desalização de peptídeos.

Resumo

Experimentos de proteômica de espingarda à base de espectrometria em massa requerem múltiplas etapas de preparação de amostras, incluindo digestão e limpeza de proteínas enzimáticas, que podem ocupar horas significativas de trabalho de banco e apresentar uma fonte de variabilidade em lote. A automação de laboratório com robôs de pipetting pode reduzir o trabalho manual, maximizar o throughput e aumentar a reprodutibilidade da pesquisa. Ainda assim, os preços iniciais acentuados das estações de automação padrão as tornam inacessíveis para muitos laboratórios acadêmicos. Este artigo descreve um fluxo de trabalho de preparação de amostras de proteômica usando um sistema de automação de código aberto acessível (The Opentrons OT-2), incluindo instruções para a configuração de redução de proteínas semi-automatizadas, alquilação, digestão e etapas de limpeza; além de acompanhar scripts Python de código aberto para programar o sistema OT-2 através de sua interface de programação de aplicativos.

Introdução

A proteômica da espingarda baseada em espectrometria em massa é uma ferramenta poderosa para medir a abundância de muitas proteínas em amostras biológicas simultaneamente. Experimentos proteômicos com análise bioinformática são rotineiramente empregados para identificar biomarcadores e descobrir complexos biológicos associados e caminhos que sustentam mecanismos patológicos. Com sua alta especificidade de analito e potencial precisão quantitativa, a proteômica da espingarda também tem excelente potencial para ser adotada por instalações de pesquisa e laboratórios de diagnóstico para análise de amostras clínicas sem a necessidade de contar com anticorpos1,2.

Para preparar amostras proteicas para análise de proteômica de espingarda, proteínas extraídas de amostras biológicas (por exemplo, células e tecidos) normalmente precisam ser processadas usando protocolos longos, incluindo medir a concentração de proteínas amostrais, redução de proteínas e alquilação, e digestão enzimática em peptídeos. Além disso, proteínas extraídas em tampões de lise comuns contendo detergentes muitas vezes requerem etapas adicionais de troca de buffer ou remoção de detergente antes da análise, pois o detergente pode interferir na digestão de trippsina e degradar significativamente o desempenho da análise de espectrometria de massa líquida a jusante (LC-MS/MS). Os peptídeos são tipicamente mais dessacados, secos e reconstituídos em solventes compatíveis com LC-MS/MS após a digestão enzimática. Esses procedimentos de bioquímica proteica podem ser intensivos em mão-de-obra e demorados. Assim, continuam a limitar o throughput de fluxos de trabalho proteômicos e contribuem para a variabilidade dos dados adquiridos4,5. Erros e vieses humanos têm sido reconhecidos como fatores cruciais que afetam a variância e a reprodutibilidade dos dados6,7. Para minimizar os erros humanos nos fluxos de trabalho de preparação de amostras de espectrometria de massa, sistemas robóticos automatizados de pipetação têm sido utilizados para melhorar o throughput e a reprodutibilidade da identificação e quantificação de proteínas a partir de proteômica de espingarda e análise de espectrometria de massa direcionada, onde tais avanços têm sido saudados como instrumentais para a continuação da adoção generalizada de tecnologias de proteômica em pesquisas críticas e configurações clínicas8, 9,10,11,12,13. No entanto, a maioria dos protocolos existentes utiliza plataformas robóticas de manuseio de líquidos que requerem investimento e treinamento substanciais, limitando sua utilidade em muitos laboratórios no ambiente acadêmico ou de outra forma com um orçamento limitado.

Este artigo descreve um protocolo que utiliza um sistema de manuseio líquido robótico de baixo custo e de código aberto, o OT-2, para semi-automatizar um típico fluxo de trabalho de preparação de amostras de proteômica de espingarda. O OT-2 tem um custo menor do que muitos outros sistemas robóticos de manuseio líquido, e no momento da escrita, custa aproximadamente US $ 5.000 dólares americanos. Ao considerar os preços de diferentes módulos e labware, o custo total para configurar experimentos neste protocolo no momento da escrita é de cerca de US $ 10.000, o que o torna mais acessível a um conjunto consideravelmente mais amplo de laboratórios sobre opções mais caras. O OT-2 é compatível com a programação de código aberto através de scripts Python e oferece grandes flexibilidades no design do protocolo DIY definido pelo usuário. Usando três scripts desenvolvidos internamente, os protocolos abaixo cobrem a execução de um fluxo de trabalho típico de preparação de amostras de proteômica de espingarda na estação OT-2 com um padrão de proteína arquetípico (albumina de soro bovino; BSA) e uma amostra de proteína complexa de um liseto cardíaco humano normal (Figura 1). Os procedimentos de processamento (1) uma amostra de BSA e (2) uma amostra complexa de liseto cardíaco estão detalhados nas seções de Protocolo 1, 2, 5, 6 e 3, 4, 5, 6, respectivamente. As contas magnéticas modificadas por carboxilato sera-mag são utilizadas na preparação de amostras aprimoradas em fase sólida (SP3) para remover detergentes e sais nas amostras de proteína e peptídeo. Digestões trippticas da albumina de soro bovino e proteínas cardíacas humanas são ainda mais limpas por contas SP3 e submetidas à análise LC-MS/MS. Os espectros de massa são então analisados usando o software MaxQuant para identificação de peptídeos e proteínas. Os resultados representativos realizados por nós mostram que o protocolo alcança excelentes coeficientes técnicos de variação (CV) enquanto economiza tempo de bancada e não é inferior ao digestor manual.

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Protocolo

Os scripts Python desenvolvidos foram depositados no GitHub em: https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons. Uma cópia dos scripts é dada no Arquivo Suplementar 1. Consulte o repositório do GitHub para obter as versões mais recentes.

1. Preparações experimentais

  1. Verifique o hardware necessário antes de iniciar o protocolo.
    NOTA: Os seguintes componentes de hardware são necessários: pipetas OT-2, pontas de pipeta, conjunto de rack de tubo 4 em 1, conjunto de blocos de alumínio, módulo magnético, módulo de temperatura, placas de poço de 2 mL de 96 poços profundos (ver Tabela de Materiais).

2. Preparação da amostra de espectrometria de massa (MS) com uma única albumina de soro bovino de proteína (BSA)

  1. Abra o script NoSP3_digestion.py em um editor de texto e especifique as variáveis específicas do experimento conforme necessário na seção PERSONALIZAR AQUI SOMENTE.
    NOTA: As variáveis específicas do experimento incluem o número de amostras e a replicação; a concentração amostral; o volume de reagentes dithiothreitol - DTT, iodoacetamida - IAA, e trippsina; o tempo de incubação DTT e IAA, e a dica inicial para pipeta P20/P50 e P300).
    1. Abra o Aplicativo Opentrons e carregue o script na guia PROTOCOLO no Aplicativo Opentrons.
      NOTA: O Aplicativo Opentrons pode ser baixado do Reference14 para um computador local. No momento da escrita, a pipeta eletrônica Opentrons P50 não está disponível para compra na loja Opentrons. Foi substituído pela pipeta eletrônica P20 de canal único compatível com os volumes especificados no protocolo. Notas e instruções foram feitas no script para substituir a pipeta P50 pela pipeta P20. Os usuários podem precisar testar e verificar a compatibilidade da pipeta em particular com este protocolo seguindo a instrução de API do Opentrons.
  2. Abra a guia ROBOT e execute a calibração do deck do robô Calibrar deck na guia ROBOT seguindo as instruções passo a passo na tela no Aplicativo Opentrons.
    NOTA: Esta etapa só é necessária se não tiver sido implementada anteriormente ou o robô tiver sido recentemente translocado.
  3. Clique no botão MANAGE PIPETTES para realizar a calibração do comprimento da ponta, seguido de calibração offset pipeta para calibrar a posição padrão de combinação de ponta e pipeta.
    NOTA: Esta etapa é necessária se uma pipeta for usada pela primeira vez.
  4. Coloque os labware e pipetas necessários no local correspondente no deck OT-2 especificado no script Python (Figura 2).
    NOTA: Certifique-se de que o módulo de temperatura está conectado e ligado, e o bloco de alumínio é colocado em cima do módulo de temperatura.
  5. Abra a guia CALIBRATE e realize a calibração para a combinação de labware e pipetas necessárias neste script python.
    NOTA: O Aplicativo Opentrons registrará os parâmetros de calibração, o que não é necessário para aplicações futuras com os mesmos labware e pipetas.
  6. Prepare 5 mL de 100 mM de biocarbonato de amônio (ABC) (pH ~8.0) solução dissolvendo 39,53 mg de ABC em água de grau espectrometria de massa para um volume total de 5 mL em um tubo cônico de 15 mL. Coloque o tampão de bicarbonato de amônio no poço A1 do rack de tubo 4 em 1 com a parte superior do suporte do tubo de 15 mL + 50 mL.
  7. Prepare 1 mL de proteína de gérso bovino (BSA) em um tubo de proteína de baixa ligação de 2,0 mL (ver Tabela de Materiais). Coloque a amostra no poço A1 do rack de tubo 4 em 1 com topo do suporte do tubo de 2 mL.
  8. Coloque manualmente tubos de proteína de baixa ligação de 2,0 mL nos poços de A1, B1, C1, D1, E1, F1, A2, etc. no bloco de alumínio em cima do módulo de temperatura.
    NOTA: A pipeta robótica distribuirá amostras na ordem vertical a partir de A1 (primeira amostra) até a última amostra por padrão. A dispensa horizontal pode ser especificada. Consulte 15 para obter detalhes. O número total de tubos que precisam ser preparados deve ser igual ao número total de amostras (ou seja, o número de amostras biológicas multiplicadas pelo número de réplicas técnicas por amostra).
  9. Prepare 1 mL de 60 mM DTT dissolvendo 9,26 mg de sólidos DTT em água de grau espectrometria de massa para um volume total de 1 mL. Coloque o DTT no poço A6 do rack de tubo 4 em 1 com a parte superior do suporte do tubo de 2 mL.
    ATENÇÃO: O DTT é prejudicial aos olhos humanos, à pele e ao sistema respiratório. Use EPI e manuseie-o sob um capuz químico. Consulte a ficha técnica de segurança do fabricante para obter os procedimentos adequados.
  10. Observe enquanto o robô transfere um volume apropriado de tampão ABC para os tubos de amostra no bloco de alumínio.
    NOTA: O volume total de ABC e mistura de proteínas em cada tubo é de 100 μL, e o volume do buffer ABC é calculado no script (V = 100 μL menos o volume de 100 μg de amostra de proteína).
  11. Certifique-se de que o robô transfira 100 μg de proteína BSA para cada tubo com buffer ABC.
    NOTA: Um experimento típico pode usar até 100 μg de proteínas para digestão proteica, ou seja, 50 μL de 2,0 μg/μL para esta amostra de BSA.
  12. Verifique manualmente se o programa do robô está pausado e exibe a mensagem: Certifique-se de que o DTT foi carregado no A6 do rack de tubo de 2 mL localizado no slot 4 antes de retomar o protocolo. Certifique-se de que um tubo DTT seja colocado no poço A6 e abra a tampa. Clique no botão Retomar no aplicativo Opentrons para continuar. Certifique-se de que o robô transfere 10 μL de solução DTT para cada amostra bem, seguido por cinco rodadas de mistura.
  13. Verifique se o programa do robô está pausado e exibe a mensagem: Certifique-se de fechar tampas em tubos de amostra. Feche manualmente as tampas dos tubos e clique em Retomar para continuar. Aguarde até que o módulo de temperatura do robô comece a aquecer o bloco de alumínio até que a temperatura atinja 55 °C, seguido de uma incubação de 5 minutos para permitir que as amostras cheguem a 55 °C.
    NOTA: O robô manterá a temperatura a 55 °C por 30 minutos para permitir a redução de proteínas por DTT durante a incubação.
  14. Durante os 30 min de incubação de DTT, prepare 1 mL de Iodoacetamida (IAA) de 187,5 mM (IAA) dissolvendo 34,68 mg de IAA no buffer ABC para um volume total de 1 mL. Enrole manualmente a solução IAA com papel alumínio para evitar a exposição à luz.
    ATENÇÃO: A IAA pode causar irritação ocular e respiratória grave. Manuseie-o sob um capuz químico usando EPI adequado.
  15. Certifique-se de que o módulo de temperatura do robô esfrie ao completar a etapa de incubação de 30 min DTT.
    NOTA: Depois que a temperatura do módulo atinge 22 °C, o módulo mantém a temperatura por 5 minutos para permitir que as amostras esfriem completamente.
  16. Descarro os tubos de amostra quando o programa do robô for pausado e exibir a mensagem de aviso: Certifique-se de abrir tampas em tubos de amostra. Clique em Retomar para continuar.
  17. Verifique manualmente se o programa do robô está pausado com uma mensagem de aviso: Certifique-se de que o IAA foi carregado no B6 do rack de tubo de 2 mL localizado no slot 4 antes de retomar o protocolo. Confirme a localização do rack do tubo IAA e abra a tampa do tubo. Clique em Retomar para continuar. Certifique-se de que o robô transfira 10 μL de IAA para cada tubo de amostra seguido de cinco rodadas de mistura.
  18. Tampe os tubos de amostra quando o programa do robô for pausado e exiba a mensagem: Feche as tampas dos tubos de amostra e cubra os tubos de amostra com papel alumínio. Cubra todo o bloco de alumínio com um pedaço limpo de papel alumínio. Clique em Retomar para continuar. Aguarde até que as amostras sejam incubadas a 22 °C por 30 min. Certifique-se de que o módulo de temperatura do robô desativa após a conclusão da incubação do IAA.
  19. Prepare uma mistura de solução de trippsina durante a incubação de IAA (etapa 2.19) na concentração final de 0,2 μg/μL: dissolver 20 μg de espectrometria de massa/trippsina de grau de sequenciamento em 100 μL de água de grau MS.
  20. Coloque a solução de trippsina no poço C6 do rack de tubo de 2 mL com a tampa do tubo aberta quando o programa do robô estiver pausado e exibir a mensagem de aviso: Certifique-se de que a trippsina tenha sido carregada em C6 do rack de tubo de 2 mL localizado na ranhura 4 antes de retomar o protocolo. Clique em Retomar para continuar.
  21. Verifique se o programa do robô está pausado e exibe a mensagem de aviso: Abra tampas em tubos de amostra no módulo de temperatura. Descape os tubos de amostra e clique em Retomar para continuar. Aguarde enquanto o robô transfere 10 μL de trippsina para cada tubo de amostra seguido de cinco rodadas de mistura.
  22. Enrole as tampas do tubo de amostra com filme de parafina, transfira todas as amostras para uma batedeira controlada pela temperatura e incubar a 37 °C por 16-20 h com tremor de 600 rpm.
    NOTA: A digestão da trippsina também pode ser realizada diretamente no módulo de temperatura a 37 °C.

3. Limpeza de peptídeos usando contas paramagnéticas SP3

  1. No dia seguinte após a digestão da trippsina durante a noite, gire brevemente as amostras usando um microcentrifuuge benchtop (≤2.000 x g) (ver Tabela de Materiais) e coloque as amostras em um rack de tubo magnético. Deixe as amostras ficarem por 2 minutos.
    1. Transfira o supernatante cuidadosamente com uma pipeta para um novo conjunto de tubos de microcentrifuge de baixa ligação proteica. Mantenha as amostras em uma geladeira e prossiga para as etapas 3.2-3.9.
      NOTA: Para armazenamento a longo prazo, armazene as amostras a -80 °C.
  2. Abra o script SP3_peptide_cleanup.py Python em um editor de texto e especifique conforme necessário na seção PERSONALIZAR AQUI SOMENTE.
    NOTA: As variáveis específicas do experimento incluem o número de amostras e réplicas, o volume de peptídeos a serem transferidos, o volume de reagentes (contas, acetonitrilo, DMSO), a ponta inicial para pipetas P20/P50 e P300, e começando bem na placa de poço profundo no módulo magnético. Cada amostra de digestão BSA contém cerca de 120 μL de volume de digestão, que será aliquo em duas réplicas técnicas com 55 μL em cada réplica. Para limpar apenas metade da digestão, altere a variável número de replicação para 1.
  3. Carregue o script na guia PROTOCOLO no aplicativo Opentrons .
  4. Coloque os labware e pipetas necessários no local correspondente no deck OT-2 especificado no script Python (Figura 3). Certifique-se de que o módulo magnético está ligado e conectado ao robô. Coloque uma nova placa de poço de 2 mL de 96 poços profundos (ver Tabela de Materiais) na parte superior do módulo magnético.
  5. Abra a guia CALIBRATE e realize a calibração para a combinação de labware e pipetas necessárias neste script Python.
    NOTA: A calibração para as mesmas combinações de labware e pipeta só precisa ser realizada uma vez, e o Aplicativo Opentrons registrará os parâmetros de calibração.
  6. Coloque as amostras digeridas (supernasce coletadas na etapa 3.1) para o rack de tubo de 2,0 mL na ordem vertical nos poços A1, B1....
  7. Prepare 15 mL de acetonitrilo compatível com LC-MS/MS em um tubo cônico de 50 mL e coloque o tubo no poço A3 no rack de tubo 4 em 1 com a parte superior do tubo de 15 mL + 50 mL.
  8. Prepare 5 mL de DMSO de 2% adicionando 100 μL DMSO com água de grau espectrometria de massa de 4,9 mL em um tubo cônico de 15 mL. Coloque o tubo no poço A1 no rack de tubo de 15mL + 50mL.
  9. Rotule um tubo cônico vazio de 50 mL como Resíduos e coloque-o no poço B3 no rack de tubo de 15mL + 50mL.
  10. Prepare as contas SP3 seguindo o Reference16.
    1. Prepare uma quantidade apropriada de contas mistas em um tubo de microcentrifuuge de 2,0 mL.
      NOTA: Cada reação de limpeza de peptídeo requer 10 μL de contas mistas. Por exemplo, prepare um mínimo de 40 μL de contas mistas para quatro reações de limpeza.
    2. Deixe a mistura de contas sentar no suporte magnético por 2 minutos. Remova o sobrenatante cuidadosamente com uma pipeta e meça o volume do supernatante com uma pipeta.
    3. Calcule o volume restante de contas e adicione 5-10 vezes a água de grau de espectrometria de massa (por exemplo, 100-200 μL de água para 20 μL de contas) e vórtice (velocidade 10) para 10 s. Sente as contas no suporte magnético por 2 minutos.
    4. Repita as etapas de lavagem de água para um total de três lavagens.
    5. Resuspenja as contas finais na água do grau MS para uma concentração final de 50 μg/μL. Coloque as contas magnéticas lavadas no poço A6 no rack do tubo de 2,0 mL.
      NOTA: Recomenda-se que as contas resuspendam a uma concentração de 10 μg/μL16. No esforço de otimização atual, a concentração final foi modificada para 50 μg/μL para minimizar o volume total da mistura de peptídeo-acetonitrilo de contas.
  11. Certifique-se de que o robô transfira 55 μL das amostras digeridas para os poços nas placas de poço profundo no módulo magnético.
  12. Verifique se o protocolo do robô está pausado e exibe a mensagem: Certifique-se de que as contas preparadas foram carregadas no A6 do rack de tubo de 2 mL localizado no slot 4 antes de retomar o protocolo. Vortex as contas, e, em seguida, gire brevemente para baixo por 5 s em uma centrífuga mini bancada e coloque as contas no poço A6 do rack de tubo de 2 mL com a tampa aberta. Aguarde enquanto o robô mistura as contas 10 vezes por cinco rodadas, pipetting para cima e para baixo.
    NOTA: O robô transfere 10 μL de contas para cada amostra digerida nas placas de poço profundo seguido por cinco vezes de mistura.
  13. Certifique-se de que o robô transfira 1.292 μL de acetonitrilo para cada poço e se misture imediatamente 10 vezes por pipetação para cima e para baixo para facilitar a ligação de peptídeos e contas.
    NOTA: Cada transferência é concluída ao longo de várias rodadas porque a pipeta P300 só pode transferir até 300 μL por vez.
  14. Certifique-se de que o robô mistura todas as amostras cinco vezes, pipetando para cima e para baixo na placa de poço profundo.
  15. Espere até que o módulo magnético esteja ativado e as amostras são incubadas no módulo por 2 minutos.
  16. Aguarde enquanto a aspiração de pipetação e as velocidades de distribuição são definidas para diminuir a 25 μL/s a partir do padrão de 150 μL/s.
    NOTA: O robô remove lentamente o supernasal de cada poço e o descarta no tubo resíduo enquanto o módulo magnético é acionado.
  17. Aguarde até que a aspiração de pipetting e as velocidades de distribuição sejam devolvidas à configuração padrão. Observe que o módulo magnético se desengata.
  18. Verifique se o programa do robô está pausado e exibe a mensagem: Certifique-se de que a tampa do tubo ACN está desligada. Despreze manualmente o tubo de acetonitrila e coloque-o de volta no rack do tubo. Clique em Retomar para continuar. Certifique-se de que o robô transfira 1 mL de acetonitrilo para lavar cada amostra e se misture imediatamente 10 vezes.
  19. Certifique-se de que o robô mistura todas as amostras 10 vezes para lavar as amostras.
  20. Fique de prontidão enquanto o módulo magnético é acionado e incuba as amostras por 2 minutos.
  21. Espere até que o robô mude a velocidade de aspiração de pipetting para diminuir e lentamente remove o supernatante e o dispensa no tubo Resíduo.
  22. Observe enquanto o robô incuba as amostras no módulo magnético para 60 s para permitir que a acetonitrila residual evapore, em seguida, muda as velocidades de aspiração pipetting de volta ao padrão. Observe que o módulo magnético fica desengatado.
  23. Verifique se o programa do robô está pausado e exibe a mensagem: Vortex DMSO novamente e abra as tampas. Vórtice manualmente o DMSO de 2% para 10 s e coloque-o de volta no poço A1 no rack de tubo de 15 mL-50 mL. Clique em Retomar para continuar.
  24. Certifique-se de que o robô transfira 80 μL de 2% DMSO para cada poço e se misture imediatamente 10 vezes.
  25. Certifique-se de que o robô mistura todas as amostras 10 vezes para mais cinco rodadas.
  26. Fique de prontidão enquanto o módulo magnético é acionado e incuba as amostras por 2 minutos.
  27. Observe enquanto o robô muda a velocidade de aspiração da pipeta para retardar (25 μL/s) e transfere lentamente o supernatante para poços vazios na placa de poço profundo.
  28. Espere até que o robô incuba amostras no módulo magnético por 2 minutos para remover contas residuais nas amostras.
  29. Verifique se o programa do robô está pausado e exibe a mensagem: Coloque novos tubos de 2 mL no rack do tubo de 2 mL e certifique-se de que o número de tubos corresponda ao número total de amostras.
  30. Coloque o primeiro tubo de microcentrifuuagem de 2 mL no poço logo após a amostra final de digestão BSA. Clique em Retomar para continuar.
    NOTA: Por exemplo, as seis amostras de digestão BSA testadas neste protocolo estão nos poços A1, B1, C1, D1, A2 e B2. Portanto, o novo conjunto de tubos de 2,0 mL é colocado nos poços B3, C3, D3, ... e assim por diante.
  31. Observe enquanto o robô transfere 88 μL de amostras dos poços na placa de poço profundo para o novo conjunto de tubos de 2,0 mL.
    NOTA: O volume transferido (1,1 x 80 μL) no protocolo é otimizado para garantir que todo o volume da amostra seja aspirado em pontas de pipeta.
  32. Fique de prontidão enquanto o robô altera a velocidade de aspiração da pipeta para padrão e desengatar o módulo magnético.
  33. Seque manualmente os peptídeos limpos em um evaporador a vácuo (ver Tabela de Materiais) e prossiga para a seção 5 ou armazene amostras secas a -20 °C.

4. Preparação da amostra de MS com lise de proteína do coração humano (5 mg/mL) com contas paramagnéticas SP3

  1. Abra o script SP3_digestion.py Python e especifique valores de variáveis na seção PERSONALIZAR AQUI SOMENTE.
    NOTA: As variáveis incluem o número de amostras e a replicação, a concentração amostral, o volume de reagentes (DTT, IAA, trippsina, contas, 100% e 80% de etanol), tempo de incubação DTT e IAA, dica inicial para pipetas P20/P50 e P300, e começando bem na placa de poço profundo no módulo magnético.
  2. Siga os passos 2.2-2.23 na seção 2 para preparação da amostra de MS com uma única albumina de soro bovino de proteína para incubação DTT e IAA. Consulte a Figura 1 para a configuração do deck robô nessas etapas.
  3. Prepare uma mistura fresca de contas SP3 (20 contas de μL por reação de limpeza) para limpeza de proteínas (conforme especificado na etapa 3.10) durante as etapas de incubação DTT e IAA (etapas 2.15 e 2.19). Coloque bem as contas no D6 no rack do tubo de 2 mL.
  4. Verifique se o programa do robô está pausado com a mensagem: Tampas de tubo abertas. Descapear manualmente os tubos de amostra no bloco de alumínio em cima do módulo de temperatura e clique em Retomar para continuar.
  5. Certifique-se de que o robô transfira todas as amostras de tubos de 2,0 mL para uma nova placa de poço profundo em cima do módulo magnético.
  6. Verifique se o programa do robô está pausado e exibe a mensagem: Certifique-se de que as contas preparadas foram carregadas em D6 do rack de tubo de 2 mL localizado no slot 4 antes de retomar o protocolo. Abra a tampa do tubo das contas e clique em Retomar para continuar.
  7. Observe enquanto o robô transfere 20 μL de contas para cada poço na placa de poço profundo com cinco rodadas de mistura das contas e cinco rodadas de mistura da mistura de contas de amostra.
  8. Verifique se o programa do robô está pausado e exibe a mensagem: Certifique-se de que 100% de etanol tenha sido carregado no A3 do rack de tubo de 15 mL-50 mL localizado no slot 5 antes de retomar o protocolo. Prepare 10-20 mL de 100% etanol (ou seja, 200 etanol à prova, veja Tabela de Materiais) em um tubo cônico de 50 mL e coloque-o no poço A3 do rack. Clique em Retomar para continuar.
  9. Aguarde enquanto o robô transfere 140 μL de 100% de etanol para cada poço na placa imediatamente seguido por 10 rodadas de mistura para facilitar a ligação dos peptídeos às contas.
  10. Certifique-se de que o robô mistura cada amostra por pipetting para cima e para baixo 10 vezes por rodada para um total de cinco rodadas de mistura.
  11. Fique de prontidão enquanto o módulo magnético é acionado e incuba as amostras no módulo por 2 minutos.
  12. Observe enquanto o robô altera a velocidade de pipetação para retardar (25 μL/s) e aspira o sobrenante de cada poço e o distribui no tubo Resíduo.
  13. Aguarde até que o robô mude a velocidade de pipetação de volta ao padrão e desengaja o módulo magnético.
  14. Verifique se o programa do robô está pausado e exibe a mensagem: Certifique-se de que 80% do etanol tenha sido carregado no A4 do rack de tubo de 15 mL-50 mL localizado no slot 5 antes de retomar o protocolo. Prepare manualmente 20 mL de 80% de etanol misturando 4 mL de água de grau MS com 16 mL de 100% etanol (ou seja, 200 à prova). Coloque o etanol de 80% no poço A4 no rack do tubo. Clique em Retomar para continuar. Certifique-se de que o robô transfira 1 mL de 80% de etanol para cada poço e se misture imediatamente 10 vezes.
  15. Observe enquanto o robô altera a velocidade de pipetação para diminuir (25 μL/s), aspira o sobrenante de cada poço e distribui para o tubo de resíduos. Aguarde até que o robô mude a velocidade de pipetação de volta ao padrão e desengaja o módulo magnético.
  16. Abra a tampa da solução ABC quando o programa do robô for pausado e exibir a mensagem: Tampa aberta no tubo ABC. Clique em Retomar para continuar. Aguarde enquanto o robô desengata o módulo magnético, transfere 250 μL de ABC para cada poço, e imediatamente se mistura por 10 vezes.
    NOTA: Este passo é lavar as amostras com a ABC.
  17. Certifique-se de que o robô acione o módulo magnético e incuba amostras no módulo por 2 minutos.
  18. Observe enquanto o robô muda a velocidade de pipetação para retardar (25 μL/s) e transfere o supernatante de cada poço para o tubo resíduo. Aguarde até que o robô transfira 100 μL de buffer ABC para cada poço e se misture imediatamente por 10 vezes.
  19. Verifique se o programa do robô está pausado e exibe a mensagem: Certifique-se de que novos tubos de coleta foram colocados em bloco de alumínio de 2,0 mL antes de retomar o protocolo. Coloque um novo conjunto de tubos de microcentrifusagem de baixa retenção de proteínas no bloco de alumínio imediatamente após o último tubo de amostra inicialmente no bloco. Clique em Retomar para continuar. Aguarde enquanto o robô transfere cada amostra no buffer ABC para os novos tubos de 2,0 mL.
    NOTA: Examine os poços e transfira manualmente qualquer amostra residual para os tubos, se necessário.
  20. Prepare uma quantidade apropriada de trippsina de grau MS (10 μL por amostra) dissolvendo 20 μg de trippsina de grau MS na água do grau MS para uma concentração final de 0,2 μg/μL quando o programa do robô é pausado e exibe a mensagem: Certifique-se de que a trippsina (0,2 μg/μL) tenha sido carregada em C6 do rack de tubo de 2 mL localizado no slot 4 antes de retomar o protocolo. Certifique-se de que o robô transfira 10 μL de trippsina para cada tubo de amostra, seguido por cinco rodadas de mistura.
  21. Enrole as tampas do tubo de amostra com filme de parafina, transfira todas as amostras para uma batedeira controlada pela temperatura e incubar a 37 °C por 16-20 h com 1.000 rpm tremendo.
    NOTA: A realização da digestão com tremor de 1.000 rpm é recomendada para minimizar a precipitação das contas durante a incubação durante a noite.

5. Limpeza de peptídeos usando contas paramagnéticas SP3

  1. Siga as instruções stepwise na etapa 2, limpeza de peptídeos usando contas paramagnéticas SP3.

6. Cromatografia líquida e espectrometria de massa

  1. Resuspende o BSA (passos 2-3) e peptídeos de lisato cardíaco (passo 4) em ácido fórmico de 0,1% adicionando 1 mL LC-MS grau 99% de ácido fórmico na água ms a um volume total de 1 L.
    ATENÇÃO: O ácido fórmico é um ácido forte. É altamente corrosivo para os olhos, pele e sistema respiratório. Manuseie com cuidado sob um capuz químico usando EPI.
  2. Quantifique a concentração de peptídeo pós-digestão usando um kit de ensaio de peptídeo quantitativo17 e injete 0,5 μg de digestão BSA e 1,5 μg de digestão cardíaca para análise de LC-MS/MS.
  3. Configure o programa de cromatografia líquida para análise de LC-MS/MS.
    NOTA: Em uma configuração típica, os digestores de peptídeos podem ser carregados em uma coluna C18 de fase invertida (partícula de 3 μm; 100 poros; 75 μm x 150 mm; ver Tabela de Materiais) utilizando os parâmetros fornecidos no Arquivo Suplementar 2.
  4. Adquira dados de proteômica de espingarda usando um espectrômetro de massa (ver Tabela de Materiais) utilizando os parâmetros fornecidos no Arquivo Suplementar 3.
  5. Procure no banco de dados de proteínas para identificação de proteínas.
    1. Baixe e instale o software necessário, MaxQuant.
      NOTA: O software MaxQuant (v.1.6.10.43) foi utilizado aqui para as seguintes etapas (ver Tabela de Materiais).
    2. Baixe o banco de dados de proteome humano curado de um banco de dados de sequência de proteínas de alta qualidade (UniProt/SwissProt) (ver Tabela de Materiais). Clique no botão Baixar e escolha FASTA (canônico).
      NOTA: Opcionalmente, baixe FASTA (não canônico) para incluir isoformas proteicos de cada gene no banco de dados, se desejar.
    3. Na interface de software MaxQuant, especifique o arquivo FASTA a ser usado como um banco de dados de proteínas navegando para o painel Parâmetros Globais e clique na guia Sequências ; em seguida, clique no botão Adicionar para especificar o caminho do arquivo para o arquivo FASTA.
    4. Na interface de software MaxQuant, especifique os arquivos de espectro de massa bruta adquiridos a serem analisados indo ao painel Dados Brutos e clicando no botão Carregar e selecione os arquivos brutos.
    5. Configure parâmetros de pesquisa conforme mostrado na Tabela 1. Habilite a quantificação sem rótulo (LFQ) se necessário.
    6. Aguarde a busca para concluir e localize o número de partidas de espectro de peptídeos (PSMs) que passam os limites de FDR de 1% nos msms.txt arquivo na pasta /combinado/txt.
      NOTA: Nas comparações realizadas aqui para a seção de resultados representativos, PSMs mapeados para múltiplas proteínas foram filtrados, e PSMs mapeados para uma proteína única foram retidos para contar o número de PSMs, peptídeos e proteínas (Figura 4 e Figura 5).

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Resultados

São fornecidos três scripts Python aqui compatíveis com o robô OT-2, e que realizam a preparação da amostra para proteômica de espectrometria de massa com uma única proteína padrão de soro bovino albumina (réplicas técnicas n = 5 digestões) e uma amostra de liseto cardíaco humano contendo detergente (n = 5 digestões). Cada produto digesto é particionado em duas reações de limpeza de peptídeos. O número de correspondências identificadas de espectro de peptídeos (PSMs), peptídeos e proteínas em cada execução da BSA e amost...

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Discussão

Passos críticos dentro do protocolo
Para o melhor desempenho, devem ser utilizados labware, módulos e consumíveis compatíveis com OT-2. O labware personalizado pode ser criado seguindo as instruções do Opentrons no Reference14. Certifique-se de calibrar o deck OT-2, pipetas e labware quando usado pela primeira vez. Também é fundamental seguir as diretrizes do fabricante de contas SP3 para preparar contas para peptídeos e limpeza de proteínas. Notavelmente, durante a reação de l...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos para declarar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado em parte pelos prêmios NIH F32-HL149191 para YH; R00-HL144829 para EL; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 para MPL. Figura 1, Figura 2, Figura 3 são criadas com o auxílio de uma ferramenta de ilustração científica baseada na Web, BioRender.com.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
300 µ L ponteiras de pipetaOpentrons
Conjunto de rack de tubo 4 em 1OpentronsCada conjunto inclui 2 suportes de base e 4 suportes de tubo de 1,5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL e 50mL. Usamos tops de 2mL e 15 mL + 50 mL neste estudo.
Acclaim PepMap 100 C18 Coluna HPLCThermo Scientific#1645683 μ partícula m; 100 & poro; 75 μ m x 150 mm
Acetonitrila LC-MS grauVWR
Conjunto de blocos de alumínioOpentronsEste conjunto de blocos inclui 3 tampos que são compatíveis com tubos de 96 poços e 2,0 mL e uma tira PCR para utilizar com o módulo de temperatura OT-2. Usamos o suporte do tubo de 2,0 mL neste manuscrito.
Bicarbonato de amônioSigma-Aldrich# A6141
Albumina de soro bovino padrão, 2 mg/mLThermo Scientific#23210
Dimetilsulfóxido (DMSO) LC-MS grauThermo Scientific#85190
DitiotreitolSigma-Aldrich#D5545
EASY-Spray HPLC ColunasThermo Scientific#ES800A
EasynLC 1200 Nano LCThermo Scientific#LC140
Prova de Etanol 195-200Fisher#04-355-720
Ácido Fórmico LC-MS grauThermo Scientific#85178
Lisado de coração humanoNovus BiologicalsNB820-59217
IodoacetamidaSigma-Aldrich#I1149
Rackde tubo magnéticoThermo Scientific#MR02
MAXQuant v.1.6.10.43Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/)
mySPIN 6 Mini Centrífuga Mini CentrífugaThermo Scientific#75004061para rotação rápida
NEST 2 mL Placa de poço profundo de 96 poços, móduloOpentrons
OT-2em V OpentronsGEN1
Pipeta de canal único OT-2 P300OpentronsGEN1
OT-2 P50 pipeta de canal únicoOpentronsGEN1
OT-2 robô de pipetagemOpentronsOT-2
OT-2 módulo de temperaturaOpentronsGEN1
Pierce Ensaio de Peptídeo Colorimétrico QuantitativoThermo Scientific#23275
Tubos de proteína LoBind 2,0 mLEppendorf#022431102
Banco de dados de sequências de proteínasUniProt/SwissProthttps://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640%
20revisado:sim
Partículas magnéticas modificadas com carboxilato Sera-Mag SpeedBead, Cytiva hidrofóbica#65152105050250
Partículas magnéticas modificadas com carboxilato, Evaporador a vácuo hidrofílicoCytiva#45152105050250
SpeedVac Thermo Scientific
Espectrômetro de massa HF exativo ThermoScientific#IQLAAEGAAPFALGMBFZ
Tripsina MS GrauThermo Scientific#90057
Água LC-MS grauVWR#BDH83645.400
#JT9829 de bancada magnético de fundo

Referências

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  2. Coscia, F., et al. A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis. The Journal of Pathology. 251 (1), 100-112 (2020).
  3. Yeung, Y. -G., Neives, E., Angeletti, R., Stanley, E. R., et al. Removal of detergents from protein digests for mass spectrometry analysis. Analytical Biochemistry. 382 (2), 135-137 (2008).
  4. Addona, T. A., et al. Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma. Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).
  5. Lowenthal, M. S., Liang, Y., Phinney, K. W., Stein, S. E. Quantitative bottom-up proteomics depends on digestion conditions. Analytical Chemistry. 86 (1), 551-558 (2014).
  6. Elliott, K. C., Resnik, D. B. Scientific reproducibility, human error, and public policy. Bioscience. 65 (1), 5-6 (2015).
  7. Brown, A. W., Kaiser, K. A., Allison, D. B. Issues with data and analyses: Errors, underlying themes, and potential solutions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (11), 2563-2570 (2018).
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  13. Liang, Y., et al. Fully automated sample processing and analysis workflow for low-input proteome profiling. Analytical Chemistry. 93 (3), 1658-1666 (2021).
  14. Web URL. , Available from: https://opentrons.com/ot-app/ (2021).
  15. Web URL. , Available from: https://docs.opentrons.com/v2/ (2021).
  16. Web URL. , Available from: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry (2021).
  17. Web URL. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275 (2021).
  18. Han, Y., Wright, J. M., Lau, E., Lam, M. P. Y. Determining alternative protein isoform expression using RNA sequencing and mass spectrometry. STAR Protocols. 1 (3), 100138(2020).

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