A Fabricação e Operação de um Sistema de Micro-Eletroporação de Fluxo Contínuo com Detecção de Permeabilização

Resumo

Este protocolo descreve as técnicas de microfabricação necessárias para construir um dispositivo de eletroporação microfluídica de laboratório em um chip. A configuração experimental realiza transfecções controladas em nível de célula única em um fluxo contínuo e pode ser estendida a rendimentos mais altos com controle de base populacional. Uma análise é fornecida mostrando a capacidade de monitorar eletricamente o grau de permeabilização da membrana celular em tempo real.

Resumo

As inovações terapêuticas atuais, como a terapia com células CAR-T, são fortemente dependentes da entrega de genes mediados por vírus. Embora eficiente, essa técnica é acompanhada por altos custos de fabricação, o que trouxe um interesse em usar métodos alternativos para a entrega de genes. A eletroporação é uma abordagem eletrofísica e não viral para a entrega intracelular de genes e outros materiais exógenos. Após a aplicação de um campo elétrico, a membrana celular permite temporariamente a entrega molecular na célula. Normalmente, a eletroporação é realizada em macroescala para processar um grande número de células. No entanto, essa abordagem requer um extenso desenvolvimento de protocolo empírico, o que é caro quando se trabalha com tipos de células primárias e difíceis de transfectar. O longo desenvolvimento de protocolos, juntamente com a exigência de grandes tensões para alcançar forças de campo elétrico suficientes para permeabilizar as células, levou ao desenvolvimento de dispositivos de eletroporação em microescala. Esses dispositivos de microeletroporação são fabricados usando técnicas comuns de microfabricação e permitem um maior controle experimental com o potencial de manter altas capacidades de rendimento. Este trabalho baseia-se em uma tecnologia de microfluídico-eletroporação capaz de detectar o nível de permeabilização da membrana celular em um nível de célula única sob fluxo contínuo. No entanto, essa tecnologia foi limitada a 4 células processadas por segundo e, portanto, uma nova abordagem para aumentar a taxa de transferência do sistema é proposta e apresentada aqui. Esta nova técnica, denotada como controle de feedback baseado na população celular, considera a resposta de permeabilização celular a uma variedade de condições de pulsação de eletroporação e determina as condições de pulso de eletroporação mais adequadas para o tipo de célula em teste. Um modo de maior rendimento é então usado, onde esse pulso "ideal" é aplicado à suspensão celular em trânsito. As etapas para fabricar o dispositivo, configurar e executar os experimentos microfluídicos e analisar os resultados são apresentadas em detalhes. Finalmente, esta tecnologia de micro-eletroporação é demonstrada através da entrega de um plasmídeo de DNA codificando para proteína fluorescente verde (GFP) em células HEK293.

Introdução

As inovações terapêuticas atuais na pesquisa biomédica, como a terapia celular CAR-T (Chimeric Antigen Receptor Engineered T cell) e a edição genética usando CRISPR (sequências de DNA palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas)/Cas9, dependem fortemente da capacidade de fornecer material exógeno com sucesso e eficiência no espaço intracelular¹. Na terapia CAR-T, o padrão-ouro para realizar a etapa de entrega gênica na fabricação da terapia celular é o uso de vetores virais². Embora a entrega de genes mediada por vírus seja uma modalidade de entrega eficiente, ela também tem várias desvantagens. Estes incl....

Protocolo

NOTA: Os usuários devem revisar todas as MSDS para os materiais e suprimentos usados neste protocolo. Devem ser utilizados EPI adequados em cada etapa e técnica estéril utilizada durante a experimentação. As seções 1-7 discutem a fabricação do dispositivo.

1. Fabricação do dispositivo - Design da máscara

NOTA: Consulte a Figura 2 para obter uma ilustração do processo de microfabricação. As etapas de microfabricação devem ser realizadas em um ambiente de sala limpa. São necessários EPI adicionais (rede de cabelo, rede de pelos faciais, máscara, roupa limpa, capas de sap....

Resultados

A Figura 4 destaca os princípios operacionais por trás da detecção de permeabilização de membrana de nível de célula única para uma única amplitude de pulso. Após o início do experimento de eletroporação, o algoritmo de detecção de células determina um limiar ideal para a detecção de células por meio de um método de detecção ponto a ponto, baseado em inclinação. O sistema então monitora continuamente (1) uma mudança negativa significativa na corrente elétrica medida, o que é indicativo da en.......

Discussão

A metodologia apresentada dentro deste protocolo se concentra principalmente na microfabricação de um dispositivo microfluídico que é então integrado em uma configuração experimental especializada em eletroporação. O termo "receita", que é frequentemente usado ao descrever as especificidades do processo de microfabricação, sugere a importância de seguir / otimizar cada etapa para fabricar com sucesso um dispositivo funcional. No entanto, certas etapas críticas dentro do processo, quando não otimizadas, como tempo/energia.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de Petri de 150 mm de diâmetro	VWR	25384-326	passo 6.1.1 para fixar
placas de cultura de tecidos de 24 poços	VWR	10062-896	passo 10.3.6 para placas de células eletroporadas
33220A Gerador de forma de onda/função	Agilent		passo 9.2.3 gerador de pulsos de eletroporação
4'' Si-wafers	University Wafer		subseção 2.1 para fabricação de canais microfluídicos
Placas de cultura de tecidos de 6 poços	VWR	10062-892	passo 8.1.8 para células de placa
Acetona	Fisher Scientific	A18-4	passo 2.1.2 para limpeza e  passo 5.1 photorresist lift-off
Allegra X-22R Centrifuge	Beckman Coulter		passos 8.1.4 , 8.3.2. e 8.3.3. para girar células
AutoCAD 2018	Autodesk		subseção 1.1. para projetar máscaras de transparência
Corrosão de óxido tamponado 10:1	VWR	901621-1L	subseção 3.1 para gravação HF
CCD Câmera de microscópio monocromática	Hamamatsu	Orca 285 C4742-96-12G04	passo 11.2.3. para
câmera CMOS de imagem - Sensicam QE 1.4MP	PCO		subseção 9.3 parte da configuração experimental
Epóxi	condutorCircuitWorks	CW2400	subseção 7.6. para fixação de fio
Tubos de centrífuga cônicos, 15 mL	Fisher Scientific	14-959-70C	passo 8.1.4. para centrifugação de células
Dektak 3ST Surface Profilometer	Veeco (Sloan/Dektak)		passo 2.1.15 e 5.4 para perfilometria de superfície
Punção de biópsia descartável, 0,75 mm	Robbins Instruments	RBP075	passo 6.2.3 para acesso à entrada
Punção de biópsia descartável, 3 mm	Robbins Instruments	RBP30P	passo 6.2.3 para acesso à saída
DRAQ5	abcam	ab108410	passo 11.2.2. para coloração de células vivas
Dulbecco' s Águia Modificada' s	Medium ThermoFisher Scientific	11885084	etapa 8.1.2. parte da composição da mídia
E3631A Fonte de alimentação bipolar Triple DC	Etapa Agilent		9.2.1.-9.2.2.parte da configuração experimental
Eclipse TE2000-U Inverted  Microscópio	Nikon		subseção 9.3. parte da configuração experimental
EVG620 Sistema de Litografia UV EVG			Etapa 2.1.9. e 2.2.7. para exposição UV
Fetal bovino	Serum Neuromics	FBS001	passo 8.1.2. parte da composição do meio
FS20 Limpador ultrassônico	Fisher Scientific		subseção 5.1. para fotorresistente decolagem
Frasco de mídia de vidro com tampa, 100mL	Fisher Scientific	FB800100	passo 8.2.1. para armazenamento de buffer
Frasco de mídia de vidro com tampa, 500mL	Fisher Scientific	FB800500	passo 8.1.2.para armazenamento de mídia
Linha celular HEK-293	ATCC	CRL-1573	subseção 8.1 para cultura de células
Solução tampão HEPES	Sigma Aldrich	83264-100ML-F	passo 8.2.1 parte da composição do tampão de eletroporação
Hexametildisilazane	Sigma Aldrich	379212-25ML	passo 2.2.3 promotor
de adesão HF2LI Amplificador de bloqueio	Zurique Instrumentos		subseção 9.2 parte da configuração experimental
HF2TA Amplificador de corrente	Zurich Instruments		subseção 9.2 parte da configuração experimental
Álcool isopropílico	Fisher Scientific	A459-1	etapa 2.1.2 para limpeza, etapa 2.1.14 para enxágue do wafer após o desenvolvimento do SU-8 e etapa 6.3.1 para limpeza do
microscópio de fluorescência PDMS IX81	Olympus		etapa 11.2.3 para imagem de
solução de L-glutamina	Sigma Aldrich	G7513-20ML	etapa 8.1.2. parte da composição da mídia
M16878 / 1BFA fio de bitola	22 AWC	B22-1	subseção 7.5 para fabricação de dispositivos
Cloreto de magnésio	Sigma Aldrich	208337-100G	etapa 8.1.2 parte da composição do buffer de eletroporação
MF 319 Desenvolvedor	Kayaku Advanced Materials	10018042	passo 2.2.9. revelador de fotorresiste
Microposit S1818 fotorresiste	Kayaku Advanced Materials	1136925	passo 2.2.4 fotorresiste positivo para padronização de elétrodos
Lâminas de microscópio, 75 x 25 mm	VWR	16004-422	passo 2.2.1 elétrodo substrato de vidro sodo-cálcico
Modelo 2350 Amplificador de alta tensão	TEGAM	2350	passo 9.2.5. parte da configuração experimental
National Instruments LabVIEW	de aquisição de dados	da National Instruments
, 30G x 1 in	BD Scientific	305128	passo 10.1.1. parte do sistema de escorva
PA90 IC OPAMP Circuito de potência	Digi-key	598-1330-ND	Parte do circuito personalizado
Penicilina-Estreptomicina	Sigma Aldrich	P4458-20ML	passo 8.1.2. parte da composição do meio
Plasmídeo pMAX-GFP	Lonza	VCA-1003	passo 8.3.4. para entrega intracelular
Tubo de plástico, 0,010'' x 0,030"	VWR	89404-300	passo 10.1.2. para escorva
do sistema Alvos de platina	Kurt J. Lesker		subseção 4.2. para deposição física de vapor
Cloreto de potássio Sigma	Aldrich	P9333-500G	Etapa 8.2.1. parte da composição do tampão de eletroporação
Bomba 11 Bomba de seringa microfluídica PicoPlus	Harvard Apparatus	MA1 70-2213	passo 10.1.4. para escorva do sistema
PVD75 Sistema de deposição física de vapor	Kurt J. Lesker		subseção 4.1. para deposição física de vapor
PWM32 Sistema Spinner	Headway Etapas de pesquisa		2.1.6 e 2.2.2. para revestimento de substrato com fotorresistente
PX-250 Sistema de tratamento de plasma	Instrumentos		subseção 7.2 para PDMS e colagem de substrato de vidro
SDG1025 Gerador de função/forma de onda	Siglent		etapa 9.2.2. parte da configuração experimental
Hidróxido de sódio	Sigma Aldrich	S8045-500G	etapa 8.2.1. parte da composição do tampão de eletroporação
SU-8 2010 fotorresistente negativo	Kayaku Advanced Materials	Y111053	passo 2.1.7. para padronização de canais microfluídicos
SU-8 revelador	Microchem	Y010200	passo 2.1.12. para desenvolvimento fotorresistente
Sacarose	Sigma Aldrich	S7903-1KG	passo 8.2.1. parte da composição do tampão de eletroporação
Kit de elastômero Sylgard 184	Dow Corning	3097358-1004	passo 6.2.1  10 : 1 mistura de polímero PDMS e agente endurecedor
Seringa, 1 ml	BD Scientific	309628	passo 8.3.4. parte do sistema de escorva
SZ61 Sistema de estereomicroscópio	Olympus		subseção 7.3. para alinhamento de canais e eletrodos
Frascos T25 tratados com cultura de tecidos	Falcon	353108	passo 8.1.2 para cultura de células
Alvos de titânio	Kurt J. Lesker		subseção 4.2. para deposição física de vapor
Máscaras de transparência	CAD/ART Serviços		etapas 2.1.9. e 2.2.7. para fotolitografia
Tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctil)silano	Sigma Aldrich	448931-10G	etapa 6.1.2. para silanização de wafer
Solução de tripsina-EDTA	Sigma Aldrich	T4049-100ML	etapas 8.1.3. e 8.3.1. para coleta de células

Agulha de março