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Artigo de método

Estabelecimento de um modelo de pancreatite aguda grave do rato usando injeção retrógrada de taurocholate de sódio no ducto biliopancreático

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DOI:

10.3791/63129

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1 de abril de 2022

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1Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Soochow University, 2MOE Engineering Center of Hematological Disease, Soochow University, 3Cyrus Tang Hematology Center, Soochow University, 4National Clinical Research Center for Hematologic Diseases, the First Affiliated Hospital of Soochow University, 5MOH Key Lab of Thrombosis and Hemostasis, Jiangsu Institute of Hematology, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 6Collaborative Innovation Center of Hematology, Soochow University

Neste artigo

Resumo

Um modelo de rato de pancreatite aguda grave é descrito aqui. O procedimento aqui apresentado é muito rápido, simples e acessível, permitindo, assim, potencialmente o estudo dos mecanismos moleculares e diferentes intervenções terapêuticas na pancreatite aguda de forma conveniente.

Resumo

A prevalência de pancreatite aguda (AP), especialmente pancreatite aguda grave (SAP), está aumentando anualmente em faixas etárias mais jovens. No entanto, faltam tratamentos eficazes na prática clínica atual. Com a fácil acessibilidade das cepas transgênicas e eliminatórias e seu pequeno tamanho, que permite doses mínimas de medicamentos necessários para avaliação in vivo , um modelo experimental bem estabelecido em camundongos é preferido para a pesquisa ap. Além disso, a SAP induzida através de taurocholate de sódio (TC) é atualmente um dos modelos mais utilizados e caracterizados. Este modelo tem sido investigado para novas terapias e possíveis eventos moleculares durante o processo de AP. Aqui, apresentamos a geração de um modelo de mouse AP usando taurocholate de sódio e uma simples microsinga caseira. Além disso, também fornecemos a metodologia para a histologia subsequente e testes sorológicos.

Introdução

Pancreatite aguda (AP) é uma inflamação aguda do pâncreas caracterizada pela obstrução do duto pancreático principal com distensão ductal subsequente e autogestão do pâncreas por suas enzimas anormalmente ativadas. Suas manifestações clínicas incluem inflamação local ou sistêmica, dor abdominal e elevação do amilase sérico1,2. De acordo com a classificação de gravidade3, a AP pode apresentar-se em formas leves, moderadas e graves, e entre elas, a pancreatite aguda grave (SAP) é a condição mais preocupante devido à sua alta taxa de mortalidade superior a 30%4. Nos Estados Unidos, a AP é uma das razões mais comuns para a internação, afetando mais de 200.000 pacientes5. Além disso, a AP, especialmente a SAP, está aumentando anualmente e afetando as faixas etárias mais jovens6. No entanto, faltam opções de tratamento eficazes na prática clínica atual6,7. Portanto, é necessário explorar os mecanismos moleculares envolvidos na AP, facilitando assim a melhoria do tratamento.

Modelos experimentais de animais bem estabelecidos são necessários para estudar os mecanismos envolvidos na AP e avaliar a eficácia de diferentes modalidades de tratamento. Com a fácil acessibilidade das cepas transgênicas e eliminatórias e seu pequeno tamanho, o que minimiza as doses de medicamentos necessários para avaliação in vivo, os camundongos são preferidos para a pesquisa ap. Portanto, vários modelos de AP foram desenvolvidos em camundongos8,9.

Trabalhando a partir de um modelo leve de rato de pancreatite induzido através da administração intravenosa de caerulein10, Niederau et al. desenvolveram um modelo de rato SAP apresentado com necrose celular acinar induzida usando a mesma droga e rota de injeção11. Embora este modelo possua várias vantagens, incluindo invasividade, indução rápida, reprodutibilidade ampla e aplicabilidade, a maior desvantagem é que apenas uma forma leve de AP é desenvolvida na maioria dos casos, limitando assim sua relevância clínica. O álcool é considerado um dos principais fatores etiológicos da AP; no entanto, Foitzik et al. relataram que causa lesão pancreática apenas quando combinado com outros fatores, como hiperestimulação exócrina12. Além disso, embora os modelos ap induzidos pelo álcool tenham sido desenvolvidos através de diferentes rotas de administração, e as doses de drogas tenham sido relatadas13,14,15, sua maior desvantagem é a dificuldade em reproduzi-los. A administração intraperitoneal de L-arginina também pode induzir AP em camundongos16; no entanto, sua baixa relevância clínica dificulta sua aplicação. Taurocholate, um sal bile, foi proposto pela primeira vez por Creutzfeld et al. em 1965 por induzir uma condição semelhante à AP humana através da infusão de ducto pancreático17. Embora existam controvérsias quanto à sua relevância clínica na fisiopatologia18,19, a pancreatite induzida por taurocolato continua sendo um modelo indispensável para a SAP.

Como este modelo é simples de perceber e também é eficaz em camundongos, é hoje um dos modelos AP mais utilizados para pequenos estudos in vivo. Perides et al. empregaram taurocholate de sódio (TC) para induzir SAP em camundongos20, fornecendo insights para entender sua patologia. Combinado com técnicas de modificação genética, este modelo nos permitiu confirmar vários genes específicos envolvidos na AP. Por exemplo, Bicozo et al. mostraram que um nocaute do gene CD38 protegeu contra um modelo de pancreatite de infusão TC e atribuiu os mecanismos a alterações na sinalização intracelular Ca2+21. Fanczal et al. investigaram a implicação fisiológica da expressão TRPM2 na membrana plasmática do acinar pancreático do rato e células ductais, e demonstraram gravidade reduzida da SAP induzida por TC em camundongos nocautes TRPM222. Além disso, este modelo também fornece uma maneira simples e eficaz de testar muitas drogas novas in vivo. Por exemplo, este método permitiu a validação dos efeitos terapêuticos da cafeína23, ácido desiddrocólico24, e vários antioxidantes e anticoagulantes25,26. Esta evidência demonstra a versatilidade do modelo SAP induzido por TC. Embora Wittel et al. tenham descrito um modelo semelhante de mouse27, a falta de detalhes sobre os procedimentos de implementação poderia resultar em uma incapacidade de reproduzir os achados. Neste artigo, focamos em métodos utilizando uma simples microsinga caseira e estudamos SAP induzida por TC, fornecendo assim uma possível orientação não apenas para um estudo mais aprofundado da patogênese e tratamento da AP, mas também para um método experimental perfeitamente adaptável para muitas outras substâncias.

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Protocolo

Todos os experimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Soochow. Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados sob anestesia total. Os analgésicos não foram utilizados para evitar interferências no curso natural da doença segundo as literaturas anteriores28,29. A aprovação da falta de analgesia também foi concedida pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Soochow.

1. Preparação

  1. Acelere um rato C57BL/6 tipo selvagem 8-12 h antes da cirurgia.
  2. Prepare 5% (p/v) solução TC (93 mM) diluída em cloreto de sódio de 0,9%. Filtre a solução através de um filtro de 0,22 μm.
  3. Autoclave os instrumentos e materiais cirúrgicos, incluindo fórceps, tesoura, porta-lâminas, porta-agulhas, clipe hemostático, grampos vasculares e cortinas estéreis, utilizando um esterilizador de pressão a uma temperatura de 121 °C por 30 min.
  4. Prepare uma micro-seringa caseira. Para isso, instale manualmente uma ponta de insulina descartável e uma ponta de pipeta de plástico prolongada sobre uma seringa microliter de ponta plana de 25 μL. Esterilizar através da irradiação.

2. Anestesia e preparação pré-operatória

  1. Pese camundongos machos de 6 a 8 semanas de idade C57BL/6 (aproximadamente 21-23 g). Induzir anestesia geral com uma injeção intraperitoneal de 1% de solução de sódio pentobarbital a uma dose de 50 mg/kg.
  2. Fixar o mouse na posição supina na placa plana anirradiatedfoam com a fita.
  3. Prepare a região de operação de cada animal removendo sua pele com um creme de depilação do nível do processo xifoide até a linha de conexão da coluna ilíca superior bilateral, com os lados esquerdo e direito paralelos à linha axilar frontal.
  4. Prepare um campo cirúrgico estéril com foco especial na área cirúrgica, consistindo na área preparada no animal e na frente do cirurgião.
    1. Desinfete o banco.
    2. Limpe o local de incisão com múltiplas aplicações de solução de esfoliação cirúrgica. Limpe a pele duas a três vezes com iodophor de 0,5% e deixe secar por 1-2 min cada vez.
    3. Cubra o mouse com cortinas estéreis.

3. Procedimento cirúrgico

NOTA: A Figura 1 retrata a anatomia e a morfologia do pâncreas do rato antes e depois da injeção retrógrada de TC no ducto biliopancreático por microinjeção.

  1. Faça uma incisão abdominal mediana de aproximadamente 2 a 3 cm de comprimento.
  2. Localize o duodeno da esquerda para a direita ao longo do estômago. Puxe suavemente o duodeno para fora e para o lado esquerdo usando fórceps cirúrgicos e um cotonete encharcado de desinfetante para expor o pâncreas, o ducto biliopancreático e a papila duodenal. Tome cuidado para não ferir a parede intestinal ou vasos relacionados.
  3. Use 8-0 suturas para passar através da conexão entre o duodeno e pâncreas ao redor da papila, e puxá-los para o lado esquerdo do corpo do rato para corrigir o duodeno.
  4. Puxe suavemente a pele e a borda inferior do fígado de lado. Fixar o ducto hepático comum, certificando-se de não fixar a veia do portal ou pâncreas. Aperte o ducto biliopancreático proximal.
  5. Fure o microinjetor no duto biliopancreático distal retrógrado. Fixar a ponta da agulha perto da papila duodenal com um grampo. Infundir 10 μL de 5% TC no duto pancreático a uma taxa de 5 μL/min.
  6. Mantenha o duto biliopancreatic fechado por 5 minutos para alcançar uma pressão estável. Em seguida, retire o microinjetor e remova os grampos.
  7. Restaure o duodeno na posição anatômica original e verifique o sangramento.
  8. Feche a ferida com suturas 6-0 e desinfete com 0,5% de iodophor.

4. Recuperação e gestão pós-operatória

  1. Recupere os animais da anestesia em uma almofada térmica de 37 °C. Não envie os animais operados para a sala pós-operatória temporal até que todos os animais tenham acordado.
  2. Administre 0,8 mL de 0,9% de soro fisiológico subcutâneo e lentamente para suplementação de fluidos.
  3. Monitore os animais no pós-operatório para sua condição geral e sinais de infecções ou doenças.

5. Teste sorológico e avaliação histologia

  1. Às 24 horas após a operação, anestesia os camundongos com sódio pentobarbital usando a mesma dose e rota de injeção.
  2. Coletar todo o sangue da aorta abdominal (cerca de 0,8 mL por rato) e girar a 1.500 x g por 15 minutos para isolar o soro para novos testes.
  3. Pegue os tecidos do pâncreas.
  4. Abra a cavidade torácica para coletar os tecidos pulmonares.
  5. Meça os índices de função bioquímica do soro, incluindo amilase, lipase, função hepática (alanina transaminase (ALT) e transaminase aspartate (AST)), e função renal (ureia e creatina), utilizando kits comerciais de acordo com as instruções dos fabricantes.
  6. Homogeneize os tecidos pulmonares e pâncreas e meça o nível de mieloperoxidase (MPO) utilizando um kit comercial de acordo com as instruções do fabricante.
  7. Abra a cavidade torácica e perfuse com 20 mL de soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) duas vezes, depois colete o pâncreas. Mergulhe em solução de paraformaldeído de 4% por 24 h. Desidratar em uma série de concentrações de álcool e incorporar em parafina.
  8. Use um microtome para preparar seções de tecido de pâncreas de 5 μm de espessura.
  9. Realizar coloração de H&E para avaliação histológica do pâncreas.
  10. Avaliar os escores patológicos de acordo com os critérios propostos por Schmidt et al.30.

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Resultados

Seguindo cuidadosamente as instruções acima, obtivemos uma duração média da cirurgia de aproximadamente 40 min. Os camundongos estavam ligeiramente inativos e perderam aproximadamente 0,5-1,75 g, 0,85-1,85 g e 0,5-4,73 g de peso em 24 h, 48 h e 72 h pós-operação, respectivamente (Figura 2).

Desde o momento da conclusão da cirurgia até 24 horas após a operação, à medida que a doença se desenvolveu, os camundongos ficaram inativos e apresentaram respostas e ações le...

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Discussão

O modelo SAP induzido pelo TC é uma excelente ferramenta de pesquisa. Como mostrado neste estudo, este modelo é muito facilmente realizado em laboratórios gerais sem empregar dispositivos específicos. Quando usado em combinação com histologia e análise bioquímica, fornece uma abordagem de custo (reagentes baratos) e economia de tempo (24h de janela de tempo) para induzir e avaliar AP. Ajustar a concentração de TC também oferece a possibilidade de produzir ap. Perides et al. também empregaram TC para induzir SAP em

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Agradecimentos

Somos gratos pelo apoio das seguintes bolsas: uma Bolsa de Pesquisa Translacional da NCRCH [2020WSA01], uma Bolsa Científica KJXW da Comissão de Saúde para Jovens Acadêmicos de Suzhou [KJXW2020002], um Plano de Ciência e Tecnologia da Cidade de Suzhou (SKY2021038 e SKJY2021050), uma bolsa do Programa Acadêmico Prioritário de Desenvolvimento das Instituições de Ensino Superior de Jiangsu (PAPD) e um Plano de Pesquisa Primária & Desenvolvimento Social da Província de Jiangsu (BE2018659).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,5% iodóforoShanghai Likang Desinfetante3101024 mL / mouse
0,9% cloreto de sódioSinopharm Group Co., Ltd.100193180,8 mL / camundongo
1% Pentobarbital sódicoSigmaP37610,2 -0,25 mL / camundongo
25 μ Seringa de microlitro de ponta plana LGaoge, XangaiA124019
4% ParaformaldeídoBeyotime, Nantong, ChinaP0099-500ml
Taurocolato de sódio a 5% (TC)AladdinS100834-5g10 μ L / SAP mouse
6-0 Microssutura de nylon estéril com agulha rosqueada (1/2 círculo)Cheng-He20093
75% álcoolSinopharm Group Co., Ltd.100092184 mL/mouse
8-0 Microssutura de nylon estéril com agulha rosqueada (círculo 3/8)Cheng-He19064
ALT Kit de ensaio de atividadeEPNK, Anhui, ChinaALT0012
Kit de ensaio de amilaseEPNK, Anhui, ChinaAMY0012
Braçadeira de buldogue pequena angular com mandíbula de 12 mm (3 cm)Cheng-HeHC-X022
aparas de álamo ou fragmentos para cama de camundongoBeijing Vital River Laboratory Animal TechnologyVR03015
AST Activity Assay KitEPNK, Anhui, Chinade ensaio de
BUN)EPNK, Anhui, ChinaBUN0011
camundongo C57BL/6 BeijingVital River Laboratory Animal Technology213
Kit de ensaio de creatinaEPNK, Anhui, China
Característica lâmina de micrótomoBeyotime, Nantong, ChinaE0994
Fórceps hemostático (9,5 cm, curvo)JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd.JC3901
Lipase Assay KitJiancheng, Nanjing, ChinaA054-2-1
micrótomoLeica biosystem, AlemanhaRM2245
Mindray analisador bioquímicoMindray, Shenzhen, ChinaBS-420
MPO Assay KitJiancheng, Nanjing, ChinaA044-1-1
Ração de rato normaltrófica, Nantong, ChinaLAD 1000
Fosfato tamponado solução salinaBeyotime, Nantong, ChinaC0221A
Braçadeira micro-bulldog reta com mandíbula de 5 mm (1,5 cm)JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd.W40130
Pinça reta ou curva (11,0 cm)Tesoura reta Cheng-HeHC-X091A ou HC-X090A
(10,0 cm)Cheng-He, Ningbo, ChinaHC-J039102
Centrífuga Thermo ScientificThermo Scientific, EUAMultifuge X1R
Kit nitrogênio ureico no sangue AST0012 (CRE0012

Referências

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