Preparação de Bicamadas lipídicas apoiadas por contas para estudar a saída de partículas de sinapses imunes de células T

Resumo

Aqui apresentamos o protocolo para a reconstituição stepwise de células que apresentam antígenos sintéticos usando Bicamadas lipídicas apoiadas por contas e seu uso para interrogar a saída sináptica de células T ativadas.

Resumo

As células que apresentam antígenos (APCs) apresentam três sinais de ativação para células T envolvidas no contato físico: 1) antígeno, 2) costimulação/corepressão e 3) citocinas solúveis. As células T liberam dois tipos de partículas efeitos em resposta à ativação: vesículas transsintálicas (tSVs) e partículas de ataque supramolecular, que transferem mensageiros intercelulares e mediam a citotoxicidade, respectivamente. Essas entidades são rapidamente internalizadas por APCs engajados no contato físico com células T, tornando sua caracterização assustadora. Este artigo apresenta o protocolo para fabricar e usar bicamadas lipídicas apoiadas por contas (BSLBs) como miméticas de células que apresentam antígenos (APC) para capturar e analisar essas partículas trans-sinápticas. Também são descritos os protocolos para as medições absolutas de densidades proteicas nas superfícies celulares, a reconstituição de BSLBs com tais níveis fisiológicos e o procedimento de citometria de fluxo para rastreamento da liberação de partículas sinápticas por células T. Este protocolo pode ser adaptado para estudar os efeitos de proteínas individuais, misturas complexas de ligantes, determinantes de virulência de patógenos e drogas na saída de células T, incluindo células T auxiliares, linfócitos T citotóxicos, células T regulatórias e células T que expressam receptor de antígeno quimérico (CART).

Introdução

A sinapse imunológica (IS) é uma estrutura molecular fundamental formada na interface de células envolvidas em contato físico que facilita a troca regulada de informações juxtracrinas. Diferentes ISs foram descritos na literatura, e um conjunto crescente de evidências sugere que esses hubs moleculares são uma característica conservada das redes celulares. Várias células imunes, incluindo células B, células assassinas naturais, células dendríticas, macrófagos e células T, trocam informações através da montagem de contatos de curta ^duração1. Estudos multiómicos estão avançando na compreensão de novos subconjuntos de leucócitos e células estromais que conduzem redes celulares patogênicas e expressam proteínas superficiais com funções desconhecidas. Como APCs sintéticos, os BSLBs permitem a investigação direta do papel funcional das proteínas individuais na integração de sinais de ativação, ou seja, antígenos e costimulação/corepressão, por células T e a consequente liberação de partículas de efeitos referidas como sinal quatro.

Este artigo descreve os protocolos e pontos técnicos críticos a serem considerados ao usar BSLBs para imitar a composição superficial dos APCs do modelo. Os protocolos para a medição quantitativa de receptores imunológicos e outras proteínas superficiais em APCs são apresentados juntamente com o protocolo para a reconstituição de APCs sintéticos contendo essas quantidades medidas. Em seguida, as etapas necessárias para coculturar células T e BSLB são apresentadas juntamente com o protocolo para a medição quantitativa da transferência de partículas trans-sinápticas usando citometria de fluxo. Mais notavelmente, os BSLBs facilitam o estudo de uma população derivada de membrana plasmática de tSVs denominadas ectomosse sináptico (ECtos). As SEs enriquecidas com receptor de antígeno de células T (TCR⁺) são lançadas em resposta ao Acionamento ^TCR2 e capturadas eficientemente por BSLBs3, representando uma excelente leitura para avaliar as propriedades agonizantes dos antígenos e a composição da membrana modelada. Exosomos CD63⁺ e partículas de ataque supramolecular (SMAPs) também são liberados por células T estimuladas e capturados por BSLBs. Eles podem ser usados como leituras adicionais da ativação e a secreção de grânulo exolítico e lítico resultante por células T. A mobilização de vesículas exocióticas ao polo interagente da célula T também facilita a liberação direcional de citocinas, como IL-2, IFN-γ e IL-10 em resposta à ativação4,5,6,7,8. Embora citocinas liberadas por células T também possam ser detectadas em BSLBs, um estudo mais dedicado está atualmente em desenvolvimento para validar a análise quantitativa da liberação de citocinas na sinapse imunológica.

Para questionar como as composições de membranas específicas influenciam a saída sináptica das células T requer a definição da densidade fisiológica do componente da membrana alvo. Quantificações baseadas em citometria de fluxo de proteínas superficiais celulares são um passo essencial neste protocolo e exigem: 1) o uso de anticorpos com números conhecidos de fluorochromes por anticorpo (F/P), e 2) contas de referência fornecendo uma referência padrão para interpolar moléculas fluorocromáticas a partir de intensidades de fluorescência média medida (MFIs).

Esses padrões de referência consistem em cinco populações de contas, cada uma contendo um número crescente de fluorocromes solúveis equivalentes (MESFs), que abrangem a faixa dinâmica de detecção arbitrária de fluorescência. Essas populações padrão produzem picos de fluorescência discreta, facilitando a conversão de unidades de fluorescência arbitrária em MESFs por simples regressão linear. Os MESFs resultantes são então usados juntamente com valores de anticorpos F/P para calcular o número médio de moléculas ligadas por célula (ou BSLB em etapas posteriores). A aplicação de áreas estimadas da superfície celular ao número médio de moléculas detectadas permite então o cálculo de densidades fisiológicas como moléculas/^μm2. Este protocolo de quantificação também pode ser adaptado à medição de densidades proteicas em células T e à reconstituição bioquímica de composições de membrana mediando a formação de sinapses celulares T homotípicas (ou seja, sinapses ^T-T). Se necessário, a valência da ligação de anticorpos pode ser estimada usando alvos recombinantes rotulados com números conhecidos de fluorochromes por molécula. Em seguida, a valência de ligação de anticorpos pode ser calculada para a mesma população BSLB, comparando simultaneamente o número de proteínas fluorescentes ligadas e anticorpos de quantificação (usando dois fluorochromes de quantificação diferentes e padrões MESF).

A reconstituição das membranas APC requer a montagem de bicamadas lipídicas suportadas (SLBs) em contas de ^sílica1. Os estoques lipossomos contendo diferentes espécies fosfolipídicas podem ser aproveitados para formar uma versátil matriz lipídica-bicamada, permitindo a ancoragem de proteínas recombinantes com diferentes químicas de ligação (a preparação de lipossomos é detalhada em ¹⁰). Uma vez definida a densidade fisiológica (ou densidades) do ligante relevante "sobre células", o mesmo protocolo de citometria de fluxo é adaptado para estimar a concentração de proteína recombinante necessária para cobrir BSLBs com a densidade fisiológica alvo. Dois sistemas de ancoragem diferentes podem ser usados em combinação ou separadamente.

Primeiro, o SLB contendo 12,5% finais de fosfolipídios contendo ^Ni2+, é suficiente para fornecer aproximadamente 10.000 locais de ligação de sua etiqueta por ^micron10 quadrado e funciona bem para decorar BSLBs com a maioria das proteínas disponíveis comercialmente cujas densidades fisiológicas não excedem essa capacidade máxima de carregamento. O segundo sistema de carregamento aproveita fosfolipídios contendo biotina (como mol) para carregar os monomers anti-CD3e fab biotinilados (ou monômeros HLA/MHC) através de pontes streptavidinas. A combinação desses dois métodos de decoração BSLB permite, então, a alfaiataria flexível de BSLBs como APCs sintéticos. Para composições superficiais APC altamente complexas, o mol% de fosfolipídios e proteínas pode ser aumentado para carregar quantas proteínas a questão em questão exige. Uma vez definidas as concentrações de trabalho de proteínas e mol% de fosfolipídios biotinilados, os BSLBs podem ser montados para interrogar a saída sináptica de células T com citometria de fluxo multiparamétrico.

Protocolo

1. Medição das densidades proteicas da superfície celular com citometria quantitativa de fluxo

1. Prepare 0,22 μm filtrado tampão de citometria de fluxo humano (hFCB) adicionando EDTA (a uma concentração final de 2 mM) e soro AB humano (até 10% final para salina tamponada de fosfato estéril (PBS), pH 7.4 (ver Tabela 1). Filtre a solução usando uma unidade de filtro de poros de 0,22 μm para remover impurezas do soro e armazenar a 4 °C.
2. Recupere as células e os sedimente por centrifugação a 300 × g por 5 min a temperatura ambiente (TR).
3. Lave as células duas vezes com PBS. Em cada etapa de lavagem, resuspenme as células em PBS para o volume original (antes da centrifugação) e gire para baixo a 300 × g por 5 min no RT.
4. Conte suspensões de células manchadas de azul em um hemocitómetro11. Alternativamente, conte células usando exclusão elétrica de corrente. Para este último, siga as instruções do fabricante CASY-TT (consulte a tabela de materiais).
   NOTA: O contador de células CASY-TT permite a determinação de por cento de células viáveis, tamanho celular e volume celular.
5. Calcule o volume de PBS contendo diluição de 1:1.000 de Diluição fixável dilável dilável eFluor 780 ou similar (ver a Tabela de Materiais) necessário para resuspensar as células para uma concentração de coloração de ¹⁰⁷ células/mL.
6. Resuspend as células usando a solução de corante-PBS viabilidade e incubar no gelo por 30 minutos.
7. Remova o corante de viabilidade adicionando um volume de hFCB gelado. Gire a 300 × g para 5 min a 4 °C.
   NOTA: De agora em diante, mantenha a corrente fria ininterrupta.
8. Lave as células com hFCB contendo diluição de 1:50 da Solução de Bloqueio do Receptor fc (ver a Tabela de Materiais). Leve o volume para uma concentração final de ¹⁰⁷ células/mL e incubar por mais 15 minutos para obter um bloqueio FcgR eficiente.
9. Distribua 100 μL da suspensão celular (ou seja, ¹⁰⁶ células) por poço de uma placa de fundo U ou fundo V de 96 poços. Mantenha as células no gelo e protegidas da luz (cubra com papel alumínio).
10. Prepare uma mistura mestre de anticorpos em hFCB definindo as concentrações ideais de anticorpos para cada anticorpo conjugado fluorocromo, e o mais importante, para os anticorpos usados para determinar densidades de proteínas superficiais. Por exemplo, para quantificação da expressão ICAM-1 em populações de células anúnges, como mostrado na Figura 1, prepare uma mistura contendo 1:200 diluições de anti-CD4, anti-CD19 e anti-CXCR5 juntamente com concentrações saturadas de um anticorpo anti-ICAM-1 com fluororomes af647 conhecidos por anticorpo (i.e., 10 μg/mL, que foi definido por experimentos independentes de titulação de anticorpos).
11. Como controles adicionais, prepare uma mistura mestre de anticorpos contendo os controles isótipos de anticorpos relevantes (nas mesmas concentrações eficazes que suas contrapartes conjugadas com os mesmos fluorochromes para subtração de fundo), ou seja, use 10 μg/mL de um controle isótipo AF647 relevante.
    NOTA: No exemplo acima, tal controle de isótipo é usado para subtrair fluorescência de fundo do verdadeiro sinal ICAM-1 nas células.
12. Ao quantificar as densidades proteicas nos subconjuntos celulares presentes em baixas frequências dentro dos tecidos, prepare controles de fluorescência menos um (FMO) contendo todos os anticorpos de coloração, exceto os marcadores de interesse (veja mais detalhes em ¹²).
13. Gire a placa de 96 poços contendo as células a 300 × g por 5 min a 4 °C, descarte o supernatante e resuspenque as células em 50 μL da mistura mestre de anticorpos de quantificação ou da mistura mestre de anticorpos isótipo.
14. Incubar as células por pelo menos 30 min a 4 °C e 400 rpm usando um agitador de placas. Proteja as placas da luz (cubra com papel alumínio).
15. Lave as células três vezes usando hFCB e centrífuga a 300 × g por 5 min a 4 °C.
16. Resuspenncie a pelota celular utilizando 200 μL de PBS (ou seja, para uma concentração final de 5 × ¹⁰⁶ células/mL).
17. Para aquisição:
    1. Se usar um carregador BD FACS padrão, transfira as amostras para tubos de fundo redondo de poliestireno de 5 mL (consulte a tabela de materiais).
    2. Se o uso de Samplers de alto rendimento (HTS, também chamado de leitores de placas), proceda imediatamente para a etapa 1.19.
18. Antes de prosseguir com a aquisição de dados para as normas MESF, verifique os limites máximos e mínimos de intensidade de fluorescência para os canais de quantificação.
19. Antes da compensação, adquira dados para as normas mesf, garantindo que as populações mais fracas e mais brilhantes caiam na faixa linear de medição.
20. Adquira as amostras de compensação. Mantenha os valores de tensão do tubo fotomultiplier (PMT) para os canais de quantificação inalterados para preservar o alcance dinâmico da detecção. Realizar pequenos ajustes na tensão pmt de outros canais antes de calcular as matrizes de compensação.
21. Calcular e aplicar compensação.
22. Adquira e economize um mínimo de 2 × ¹⁰⁴ contas MESF totais para cada um dos canais de quantificação.
23. Selecione a população de células únicas com base em suas áreas de dispersão de luz lateral e dianteira (SSC-A e FSC-A, respectivamente, como mostrado na Figura 1A (i)), seguida pela seleção de eventos dentro do contínuo temporal (Figura 1A (ii)) e baixa para o tempo de voo (W) tanto no FSC quanto no SSC em comparação com suas alturas (ou seja, FSC-W/FSC-H, seguido por SSC-W/SSC-H gating como mostrado na Figura 1A (iii) e (iv), respectivamente. Defina um portão de um único evento final contendo eventos com distribuição proporcional FSC-A versus FSC-H (Figura 1A (v)).
24. Adquirir amostras de controle (controles isótipos e FMO).
25. Adquira amostras e registo até que um mínimo de 10.000 células-alvo tenham sido adquiridas.
    NOTA: a determinação robusta das densidades moleculares médias requer a análise de vários doadores em experimentos independentes. Isso é crucial ao analisar os subconjuntos celulares encontrados em frequências reduzidas ou derivados de material biológico escasso (por exemplo, de biópsias de tecido humano).
26. Lave o cítmetro funcionando por 5 minutos com uma solução de limpeza FACS seguida de 5 min de água ultrapura antes de desligar o instrumento. Se estiver usando o HTS, siga as opções embaixo da guia HTS e do programa Clean Plate.
    NOTA: Para reduzir a transferência amostral para amostra, ative as opções de lavagem do sampler sit (sampler) ou de alta throughput sampler , que lavará automaticamente o citômetro entre tubos ou poços. Antes de iniciar a aquisição, execute a água ultrauso por 10 minutos a uma alta taxa de fluxo para remover quaisquer contaminantes biológicos não lavados da linha de amostragem do citômetro.
27. Exporte os arquivos Padrão de Citometria de Fluxo (FCS).

2. Análises de regressão da intensidade de fluorescência média (ou mediana) da MESF (MFI)

1. Abra o software de análise de citometria de fluxo e carregue os arquivos FCS do experimento. Selecione a população de contas com base em suas áreas de dispersão de luz lateral e dianteira (SSC-A versus FSC-A), como mostrado na Figura 1A (i).
2. Controle a qualidade dos dados verificando a distribuição de eventos únicos ao longo do tempo, conforme indicado na etapa 1.24.
   NOTA: Bolhas criam lacunas na distribuição de eventos ao longo do tempo; isso normalmente aparece no início da aquisição usando o HTS. Evite selecionar eventos que flanqueam lacunas no tempo de aquisição, pois estes adicionam erros de medição devido a aberrações ópticas.
3. Concentre-se nos eventos únicos.
   1. Células
      1. Identifique células únicas primeiro com base em sua distribuição SSC-A e FSC-A (Figura 1A (i)), seguida por eventos baixos para W nos portões sequenciais FSC-W/FSC-H (singlets-1, Painel Figura 1A (iii)) e SSC-W/SSC-H (singlets-2; Figura 1A painel (iv)). Defina um portão singlets-3 adicional selecionando eventos com FSC-A proporcional e FSC-H (Figura 1A, painel (v)). Finalmente, identifique as células vivas como aquelas negativas para o corante de viabilidade fixável.
   2. Contas MESF
      1. Siga os mesmos singlets-1 para singlets-3 discriminação como na etapa 2.3.1.1 (Figura 1B, painéis (i) a (v)). Identificar cada uma das populações do MESF (em branco, 1, 2, 3 e 4) com base em seus níveis de intensidade de fluorescência (ver Figura 1B, painel (vi)).
4. Extrair o MFI das frações MESF em branco e 1 a 4.
5. Gerar valores de MFI (cMFI) corrigidos para frações mesf 1 a 4 subtraindo os MFIs da população de contas em branco de cada fração.
6. Calcule a linha de melhor ajuste para a relação entre cMFIs e os valores MESF fornecidos pelo fornecedor (variável independente, sendo fração em branco igual a zero).
7. Extrair a inclinação (b na equação abaixo) da regressão linear de MESF sobre cMFI (Painel Figura 1B (viii) mostra uma regressão na qual y = a + bx; com a = 0).
8. Extrair a mediana (para distribuições de fluorescência bimodal) ou média (para distribuições normais ou log-normal de fluorescência) intensidades de fluorescência das populações de interesse (células TFH e B no painel Figura 1A (vii)).
9. Como nas etapas 2.5-2.7, extrair os valores de IM das células de controle rotuladas por isótipo.
10. Se o F/P de controles isótipos for o mesmo que os anticorpos de quantificação, corrija os MFIs das células manchadas subtraindo os MFIs de células rotuladas por Isótipo.
11. Se o F/P dos isótipos difere dos anticorpos de quantificação, extraia o MESF dos isótipos dividindo os MFIs das células rotuladas pelo isótipo com a inclinação calculada na etapa 2.7. Subtrair isótipo MESF da quantificação MESF antes de estimar anticorpos de quantificação vinculados.
12. Divida o MESF pelo F/P dos anticorpos de quantificação para estimar o número de moléculas ligadas por célula (Molec. _célula como mostrado no diagrama de fluxo da Figura 1C).
13. Divida o número de moléculas ligadas com a área estimada da superfície celular (CSA (^μm2)) para extrair a densidade de proteínas como molec./^μm2 (Figura 1C). Consulte a seção de resultados representativos para obter mais detalhes.

3. Espécies fosfolipídicas funcionais para usar na calibração de proteínas que cobrem BSLBs

1. Use 0,4 mM DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholina) como o principal componente da matriz lipídica formando a bicamada lipídica suportada. Diluir todas as outras espécies de lipídios nesta solução DOPC.
2. Use entre 0,2 e 1 mol% de 0,4 mM DOPE (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamina) conjugado a corantes, incluindo ATTO 390, 488 ou 565 (ver a Tabela de Materiais), para gerar BSLBs com fluência intrínseca.
   NOTA: A fluorescência intrínseca dos BSLBs facilita a identificação de BSLBs únicos e células únicas em experimentos de transferência sináptica.
3. Use 12,5 mol% de 0,4 mM DGS-NTA(Ni) (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl) iminodiacetic acid) succinyl]) para ancorar proteínas sua marcadas. Mantenha o mol% de DGS-NTA(Ni) constante e realize titulações 2 vezes das proteínas marcadas com sua marca a partir de 100 nM como a maior concentração. Deixe uma condição sem proteína como controle negativo para quantificações absolutas.
   NOTA: Sinais acessórias e moléculas de adesão, como o ICAM-1, são projetados com uma tag 12-Sua para aumentar a afinidade da proteína para DGS-NTA(Ni).
4. Use Biotinyl Cap PE (1,2-dioleoyl-sn-gliceo-3-fosfoethanolamina-N-(cap biotinyl)) para ancorar proteínas biotiniladas através de pontes biotina-streptavidina-biotina. Use uma titulação serial de 5 vezes de 0,4 mM Biotinyl Cap PE cobrindo entre 10 mol% e 0 mol% (como controle negativo). Mantenha a concentração de proteínas streptavidinas e biotiniladas constantes (200 nM) tanto em experimentos de calibração quanto na reconstituição de APCs sintéticos para experimentos de transferência sináptica.
   NOTA: As análises de regressão das densidades empíricas de proteínas biotiniladas sobre o percentual final de Mol% da Lasca Biotinílica NA matriz lipídica (também contendo DGS-NTA(Ni) para ancorar proteínas marcadas com sua marca) definirão o mol% a ser usado para reconstituir densidades alvo de antígeno.

4. Preparação de soro suplementado HEPES contendo 1% de albumina de soro

NOTA: O soro fisiológico tamponado hepes com suplemento contendo 1% de albumina de soro humano (HBS/HSA) ou 1% de albumina de soro bovino (HBS/BSA) é necessária nas etapas de lavagem e carga de proteínas de BSLBs (Tabela 1). Prepare uma solução de estoque HBS 10x e o buffer de trabalho o mais fresco possível; manter refrigerado e usar dentro de um mês. Embora o BSA seja uma alternativa mais barata ao HSA, ele fornece um bloqueio eficiente de lipídios ^{ni-chelating13} e é recomendado para experimentos de alto rendimento.

1. Prepare uma solução tampão de estoque de 10x de HBS suplementado contendo 200 mM HEPES, 7 mM _Na2HPO4, 1400 mM NaCl, 50 mM KCl, 60 mM de glicose, 10 mM _CaCl2 e 20 mM _MgCl2.
   NOTA: Dissolver _MgCl2 é altamente exotérmico e um risco de queimadura. Adicione este sal lentamente e em um grande volume de solvente. Evite preparar soluções concentradas (ou seja, 1 M) desses sais, pois tendem a precipitar com o tempo, dificultando sua adição precisa ao tampão de trabalho.
2. Filtre a solução de 10x usando uma unidade de filtro de 0,22 μm e mantenha-a estéril a 4 °C.
3. Para 500 mL de HBS/tem, pegue 50 mL da solução HBS de 10x suplementada, ajuste o pH para 7,4 se necessário e compõe o volume para 483,4 mL com água ultrapura.
4. Adicione 16,6 mL de solução HSA de 30% aos 483,4 mL de HBS, pH 7.4.
5. Para 500 mL de HBS/BSA, dissolva 5 g de BSA no HBS e incubar a 37 °C por 30 min. Em seguida, misture suavemente no RT invertendo a garrafa periodicamente até que não haja cristais de proteína visível ou aglomerados.
6. Filtre a solução resultante da etapa 4.5 usando uma unidade de filtro de 0,22 μm (veja a tabela de materiais) e armazene-a a 4 °C.

5. Calibrações de densidade de proteínas em BSLBs

1. Antes de tomar as contas de sílica não funcionalizadas de 5,00 ±,05 μm de diâmetro, misture bem a solução de estoque e resuspenque qualquer grande aglomerado de contas sedimentadas na parte inferior dos frascos.
   NOTA: As contas de sílica tendem a sedimentar rapidamente, o que pode levar à contagem de erros. Misture vigorosamente por pipetar para cima e para baixo metade do volume máximo de uma micropipette P1000.
2. Diluir 1 μL de solução de contas em 1.000 μL de PBS, contar as contas usando uma câmara hemócica e calcular sua concentração por mL.
   NOTA: A coloração azul trypan não é necessária para visualizar contas de sílica.
3. Calcule o volume de contas de sílica necessárias para 5 × ¹⁰⁵ BSLBs finais por ponto da titulação.
4. Transfira o volume necessário de contas de sílica para um tubo de microcentrifutura de 1,5 mL estéril.
5. Lave as contas de sílica três vezes com 1 mL de PBS estéril, centrifugar as contas por 15 s em uma microcentrifuagem de bancada em RT (em rpm fixo).
   NOTA: Ao remover a solução de lavagem, evite perturbar a pelota de contas. Uma pequena coluna tampão não afetará a disseminação dos lipossomos que compõem a mistura de mestre liposomino, pois estes também estão na PBS.
6. Prepare três volumes da mistura principal lipossosome para montar o BSLB nas contas de sílica lavadas (por exemplo, se o volume total inicial de contas de sílica for de 20 μL, prepare um mínimo de 60 μL da mistura master lipossosome).
7. Para titulações de mol% de Biotinyl Cap PE
   1. Prepare as misturas de mestre lipídicos contendo diluições de 5 vezes da Tampa Biotinílica PE.
      1. Diluir a 0,4 mM Biotinyl Cap PE mol% em uma matriz 100% DOPC.
      2. Misture cada ponto de titulação de mol% biotinyl Cap PE em uma proporção de 1:1 (vol:vol) com uma solução de 0,4 mM 25% DGS-NTA(Ni) de tal forma que um 12,5% final de lipídios contendo Ni esteja presente em todas as titulações.
         NOTA: Os 12,5 mol% (vol:vol%) dos lipídios contendo Ni representam a composição lipídica mista de BSLBs nas quais as proteínas sua marcadas também podem ser testadas em calibrações paralelas. Por exemplo, uma vez que todos os estoques de lipossomo são preparados na mesma concentração molar, para alcançar a mistura de mol% alvo em 200 μL de mix lipossomo final, basta misturar 100 μL de 25 mol% de DGS-NTA contendo Ni com 100 μL de 100% DOPC.
   2. Transfira 5 × ¹⁰⁵ contas de sílica lavadas para tubos de microcentrífugo de 1,5 mL, de tal forma que um ponto de titulação de mol% de Biotinyl Cap PE seja montado por tubo.
   3. Adicione as misturas mestres de titulação de mol% biotinyl Cap PE às contas de sílica lavadas e misture suavemente por pipetar para cima e para baixo metade do volume total. Evite formar bolhas, que em excesso destroem a bicamadas lipídicas.
   4. Adicione gás de argônio (ou nitrogênio) no tubo contendo os BSLBs agora formadores para deslocar o ar e proteger os lipídios da oxidação durante a mistura.
   5. Adicione Argon aos estoques lipídides de 0,4 mM antes de armazenar e manipule usando uma técnica estéril.
      NOTA: Conecte uma pequena tubulação ao cilindro de gás Argon/Nitrogênio. Antes de adicionar gás aos tubos, ajuste o regulador do cilindro de gás para que a pressão não seja superior a 2 psi. Conecte uma ponta de pipeta estéril à tubulação de saída para direcionar o fluxo de gás para dentro do caldo lipossomo por 5 s e feche rapidamente a tampa. No caso de estoques lipídicos, sele a tampa do tubo com filme de parafina antes de armazená-lo a 4 °C.
   6. Mova os BSLBs para uma batedeira de laboratório vertical de ângulo variável (ver a Tabela de Materiais) e misture por 30 minutos no RT usando uma mistura orbital de 10 rpm.
      NOTA: Esta etapa evitará a sedimentação de contas durante a formação da bicamada lipídica suportada.
   7. Gire as contas por centrifugação para 15 s em RT em uma minicentrifutura de bancada e, em seguida, lave três vezes com 1 mL de HBS/HSA (BSA) para remover o excesso de lipossomos.
   8. Bloqueie os BSLBs formados adicionando 1 mL de 5% de caseína ou 5% de BSA contendo 100 μM de NiSO4 para saturar os locais NTA e 200 nM streptavidin para cobrir todos os locais de ancoragem de biotinas nos BSLBs uniformemente. Misture suavemente por pipetar para cima e para baixo metade do volume total e incubar na batedeira vertical por não mais do que 20 min no RT e 10 rpm.
   9. Gire os BSLBs por centrifugação para 15 s em RT em uma minicentrifutura de bancada e, em seguida, lave três vezes com 1 mL de tampão HBS/HSA (BSA).
      NOTA: Mantenha as contas lavadas verticalmente com um pequeno volume de tampão de lavagem cobrindo os BSLBs. Evite a desidratação dos BSLBs, pois o ar destruirá a bicamadas lipídica.
8. Para a titulação de proteínas sua marcadas em 12,5 mol% de BSLBs contendo NTA DGS-(Ni
   1. Prepare três volumes de mix de mestre lipossomo contendo um final de 12,5 mol% de DGS-NTA(Ni).
   2. Use a mistura de mestre lipososome para resuspensar as contas de sílica lavadas e misturar suavemente por pipetar para cima e para baixo metade do volume total. Evite formar bolhas, que em excesso danificam a bicamadas lipídicas.
   3. Adicione gás de argônio (ou nitrogênio) no tubo contendo os BSLBs agora formadores para deslocar o ar e proteger os lipídios da oxidação durante a mistura.
   4. Adicione Argon aos estoques lipídides de 0,4 mM antes de armazenar e manipule usando uma técnica estéril.
   5. Mova os BSLBs para a batedeira vertical e misture por 30 minutos no RT usando mistura orbital a 10 rpm.
   6. Gire as contas por centrifugação para 15 s em RT em uma minicentrifutura de bancada e, em seguida, lave três vezes com 1 mL de HBS/HSA (BSA) para remover o excesso de lipossomos.
   7. Bloqueie os BSLBs formados adicionando 1 mL de caseína de 5% (ou 5% BSA) contendo 100 μM de _NiSO4 para saturar os locais NTA nos BSLBs. Misture suavemente e incubar na batedeira vertical por não mais do que 20 min em RT e 10 rpm.
   8. Lave três vezes usando HBS/HSA (BSA) para remover a solução de bloqueio em excesso.
   9. Em uma nova placa U-bottom 96-well prepare diluições em série de 2 vezes das proteínas.
      1. Prepare uma concentração inicial de 100 nM para a proteína de interesse em um volume total de 200 μL de tampão HBS/HSA (BSA), distribua 100 μL desta solução na primeira coluna e os 100 μL restantes em cima da coluna n2 contendo 100 μL de hbs/hsa (BSA) tampão.
      2. Continue transferindo em série 100 μL da coluna #2 para a coluna #3 e repita conforme necessário para cobrir todos os pontos de titulação. Deixe a última coluna da série sem proteína, pois esta será usada como referência em branco para quantificação.
   10. Resuspenda os BSLBs preparados em um volume de tal forma que 5 × ¹⁰⁵ BSLB estão contidos em 100 μL de tampão HBS/HSA (BSA).
   11. Transfira 100 μL da suspensão BSLB para poços de uma segunda placa de 96 poços, de modo que cada poço receba 5 × ¹⁰⁵ BSLBs.
   12. Gire a segunda placa contendo BSLBs por 2 min a 300 × g e RT e descarte o supernasce.
   13. Transfira os volumes de 100 μL da placa de titulação proteica para a placa contendo os BSLBs sedimentados. Misture suavemente, evite o excesso de geração de bolhas durante a pipetação e incubar por 30 minutos na RT e 1.000 rpm usando um agitador de placas. Proteja-se da luz com papel alumínio.
   14. Lave a placa três vezes com tampão HBS/HSA (BSA) utilizando etapas de sedimentação de 300 × g por 2 min em RT.
   15. Se a proteína recombinante utilizada na calibração for diretamente conjugada a fluorochromes e tiver valores conhecidos de F/P, proceda à etapa 5.8.20.
   16. Se a proteína recombinante usada na calibração não for rotulada ou conjugada a fluorochromes ou nenhum padrão de contas MESF estiver disponível, use anticorpos Alexa Fluor 488 ou 647 conjugados com valores conhecidos de F/P para manchar o BSLB revestido de proteína.
   17. Mancha com concentrações saturadas de anticorpos de quantificação.
       NOTA: Dependendo do nível de expressão do alvo, estes variam entre 5 e 10 μg/mL.
   18. Mancha por 30 min no RT e 1.000 rpm usando um agitador de placas. Proteger contra a luz usando papel alumínio.
   19. Lave duas vezes com tampão HBS/HSA (BSA) e uma vez com PBS usando etapas de sedimentação de 300 × g por 2 min na RT.
       NOTA: Use PBS, pH 7.4 para resususpensar os BSLBs lavados antes da aquisição. Não utilize tampões contendo proteína, pois isso leva à formação de bolhas durante a mistura automática de amostras com amostradores de alto rendimento.
   20. Adquira os padrões MESF, certificando-se de que os picos mais brilhantes permaneçam na faixa de detecção linear para o detector de quantificação (canal), como mostrado na Figura 1B (vii).
   21. Adquira as amostras manualmente ou usando HTS. Se usar este último, resuspenque BSLBs em 100 μL de PBS e adquira 80 μL usando uma taxa de fluxo entre 2,5 e 3,0 μL/s, um volume de mistura de 100 μL (ou 50% do volume total se o volume de ressuspensão for menor), uma velocidade de mistura de 150 μL/s e cinco misturas para garantir que os BSLBs sejam monodispersados.
   22. Exporte os arquivos FCS.
   23. Concentre-se em eventos únicos para as análises (Figura 2A), pois doublets ou trigêmeos introduzirão erro na determinação. Use a identificação aninhada de eventos únicos conforme indicado na etapa 1.2.3 do protocolo.
   24. Meça o MFI de cada fração MESF (1-4) e subtraia o MFI de contas em branco para extrair MFIs corrigidos (cMFI).
   25. Realize uma análise de regressão linear para extrair a inclinação (b) do MESF sobre o cMFI calculado para as normas MESF, que será utilizada na etapa 5.33.
   26. Extrair o IMfi de cada ponto de titulação e subtrair o MFI de contas sem proteína para obter cMFIs.
   27. Divida os cMFIs com a inclinação calculada na etapa 5.31 para extrair o MESF vinculado aos BSLBs para cada ponto de titulação.
   28. Divida o MESF vinculado aos BSLBs pelo valor F/P do anticorpo de quantificação para extrair o número médio de moléculas ligadas por BSLB.
   29. Utilizando o diâmetro das BSLBs (5,00 ± 0,05 μm), extraia a área da superfície das contas (SA = ^4pr2) para calcular as densidades finais de proteína (molec./^μm2) por ponto de titulação (concentração proteica).
   30. Realize uma nova análise de regressão da concentração proteica sobre a densidade proteica para calcular a inclinação (b) da linha de melhor ajuste.
       NOTA: A concentração de 12,5% de DGS-NTA(Ni) confere uma capacidade máxima de ancoragem de aproximadamente 10.000 molec./^μm210 sem induzir a ativação inespecífica das células T ou afetar a mobilidade lateral dos SLBs.

6. Realizando experimentos de transferência sináptica entre células T e BSLBs

1. Antes de executar o experimento de transferência sináptica
   1. Adquira BSLBs não fluorescentes, BSLBs com lipídios fluorescentes, células não manchadas (ou contas de compensação; consulte a Tabela de Materiais) e células manchadas de cor única (ou contas de compensação) para identificar as interações de espectro de fluorescência do instrumento. Concentre-se nesses detectores com alta disseminação de respingos para redesenhar o painel policromático, aumentar a sensibilidade e reduzir o erro de medição em detectores críticos (ver ¹⁴).
   2. Titular os anticorpos de detecção para encontrar a concentração ideal, permitindo a detecção de eventos positivos sem comprometer a detecção de negativos.
      NOTA: Repita esta etapa sempre que houver uma alteração do lote de anticorpos, pois os valores f/P e o brilho variam de lote para lote.
   3. Opcional: Otimize as tensões pmt adquirindo a amostra em diferentes faixas de tensão (ou seja, uma voltagem caminha) para encontrar os PMTs levando a sinal ideal sobre ruído (ou seja, separação de negativos e positivos, garantindo que o sinal da população mais brilhante permaneça na faixa linear).
2. Medição da transferência de saída de célula T para BSLBs
   1. Prepare rpmi suplementado 1640 (aqui em meio R10) contendo 10% de soro bovino fetal inativado térmico (FBS), 100 μM aminoácidos não essenciais, 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamina, 1 mM piruvato de sódio, 100 U/ml de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina. Use r10 médio para cultura e expanda células T.
   2. No primeiro dia, isole as células T das câmaras periféricas do sistema de sangue ou leucoreducção (LRS). Use kits de isolamento e separação de células de imunodensidade (ver a Tabela de Materiais) para enriquecimento das células CD4⁺ e CD8⁺ T humanas.
   3. Semear as células em uma concentração final variando entre 1,5 e 2,0 × ¹⁰⁶ células/mL, utilizando placas de 6 poços com não mais de 5 mL no total por poço.
   4. Ative as células T usando uma proporção de 1:1 de células T humanas (anti-CD3/anti-CD28) contas magnéticas (veja a Tabela de Materiais) e adicione 100 UI de IL-2 humano recombinante para suportar a proliferação e sobrevivência celular.
   5. No dia 3, remova as contas magnéticas ativantes usando colunas magnéticas (veja a Tabela de Materiais). Certifique-se de que as contas magnéticas permaneçam presas às laterais do tubo antes de recuperar as células para etapas adicionais de lavagem.
   6. Lave as contas magnéticas mais uma vez com 5 mL de meio R10 fresco, misture bem e coloque-as de volta no ímã . Recupere este volume e misture com as células recuperadas na etapa 6.2.5.
   7. Resuspengem as células para 1,5-2 × ¹⁰⁶ células/mL em R10 fresco contendo 100 U/mL de IL-2. Reabastecer o meio após 48 h, certificando-se de que a última adição de IL-2 seja de 48 h antes do dia da experimentação (dias 7 a 14 de cultura).
   8. No dia do experimento de transferência sináptica, prepare o meio de ensaio de transferência sináptica (ver Tabela 1) suplementando o meio RPMI 1640 sem fenol com 10% de FBS, 100 μM aminoácidos não essenciais, 2 mM L-glutamina, 1 mM piruvato de sódio, 100 U/ml de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina. Não inclua il-2 humano recombinante.
   9. Conte as células usando manchas azuis de tripano ou exclusão de corrente elétrica e resuspensá-las a uma concentração final de 2,5 × ¹⁰⁶ células/mL em média. Se for observada morte celular excessiva (>10%), remova células mortas/moribundas usando uma mistura de polissacarídeo e diatrizoato de sódio (veja a Tabela de Materiais) da seguinte forma:
      1. Camada 15 mL de cultura celular em cima de 13 mL da solução de diatrizoato polissacarídeo-sódio.
      2. Centrifugar por 1.250 × g por 20 min em RT com aceleração mínima e desaceleração. Colete a camada celular (nuvem) na interface entre o meio e a solução de diatrizoato polissacarídeo-sódio.
      3. Lave as células pelo menos duas vezes com o meio de ensaio de transferência sináptica pré-armado (preparado na etapa 6.2.7).
      4. Conte e resuspenge as células para uma concentração final de 2,5 × ¹⁰⁶/mL usando o meio de ensaio de transferência sináptica. Cocultura 100 μL desta suspensão celular com BSLBs (ver passo 6.2.15).
   10. Calcular o número de BSLBs necessários para o experimento; considere todas as diferentes misturas mestres de proteínas e titrtações de antígeno a serem testadas (monômeros de HLA/MHC biotinilatos ou anti-CD3ε Fab monogratinilados).
   11. Monte os BSLBs seguindo os mesmos passos da seção 5 do protocolo, mas desta vez, combine todas as titulações de proteínas e lipídios necessários para reconstituir uma membrana APC complexa (Figura 3A). Mantenha o mesmo vol: as relações vol entre o volume inicial de contas de sílica e o volume de mistura de proteínas utilizada durante as calibrações, bem como os tempos e temperaturas utilizados no carregamento de BSLBs. Por exemplo, se 0,5 μL de contas de sílica/bem e 100 μL/bem de mistura de proteína foram usados para a calibração inicial, mantenha as relações de 5:1.000 vol:vol para preparar os BSLBs a serem coculturados com células T.
   12. Uma vez que os BSLBs tenham sido carregados com o mix de proteínas de interesse, lave os BSLBs duas vezes com HBS/HSA (BSA) para remover o excesso de proteínas não ligadas. Use velocidades de sedimentação de 300 × g por 2 min em RT em cada etapa de lavagem e descarte os sobrenantes.
   13. Resuspend os 5 × ¹⁰⁵ BSLBs por poço em 200 μL.
   14. Transfira 100 μL por poço para uma nova placa U-bottom de 96 poços para fazer uma duplicata, de tal forma que a quantidade final de BSLB por poço seja de 2,5 × ¹⁰⁵.
   15. Gire os BSLBs a 300 × g por 2 min e RT e descarte o supernasce.
   16. Resuspend os BSLBs usando 100 μL de suspensão celular T; misture suavemente para evitar a formação de bolhas.
   17. Incubar as coculturas por 90 min a 37 °C.
       NOTA: Alternativamente, as células e as contas podem ser resuspended no buffer HBS/HSA (BSA) em vez de RPMI livre de Fenol-Vermelho para a cocultura. Neste caso, a incubação deve ser realizada em uma incubadora _não-CO2 , pois este gás irá acidificar rapidamente o tampão na ausência de bicarbonato.
   18. Esfrie as coculturas de células BSLB-T incubando as células em RT por um mínimo de 15 minutos. Proteja-os da luz.
   19. Centrifugar as células por 5 min a 500 × g e RT; descartar o supernatante.
   20. Resuspende as células em RT 2% BSA-PBS (^Ca2+ e ^Mg2+-free) para bloqueio. Coloque as células no gelo por 45 minutos. Proteja-se contra a luz.
   21. Ao incubar as células, prepare a mistura mestre de anticorpos usando 0,22 μm filtrado 2% BSA no PBS como um tampão de coloração, que fornecerá um bloqueio extra.
       NOTA: Alguns lotes de anticorpos conjugados a corantes violeta brilhantes tendem a se ligar a BSLBs de forma inpecífica. O bloqueio com 5% de BSA-PBS ajuda a reduzir esse ruído. De agora em diante, certifique-se de manter a corrente fria ininterrupta.
   22. Gire as coculturas a 500 × g para 5 min e 4 °C. Antes de descartar os supernantes, certifique-se brevemente de que a pelota está presente inspecionando a parte inferior da placa de 96 poços usando uma luz de fundo.
   23. Usando uma pipeta multicanal, resuspende as células na mistura mestre de coloração contendo concentrações otimizadas de anticorpos.
       NOTA: Use pontas de pipeta sem filtro para evitar a geração de bolhas e erros na distribuição de volumes de coloração.
   24. Inclua células com rótulo de isótipo e BSLBs, BSLBs fluorescentes e não fluorescentes, e células e BSLBs manchadas sozinhas. Respeite o número total de eventos por poço para todos os controles (ou seja, apenas BSLBs contendo 5 × ¹⁰⁵ BSLB/well, e apenas controles celulares contendo 5 × ¹⁰⁵ células/poço para evitar um aumento relativo de anticorpos por evento manchado).
   25. Misture suavemente por tubos para cima e para baixo metade do volume e incubar por 30 minutos no gelo. Proteja-se contra a luz.
   26. Lave as células e os BSLBs duas vezes usando 2% de BSA-PBS gelado, pH 7,4 e etapas de sedimentação de 500 × g por 5 min a 4 °C. Resuspentures lavadas em 100 μL de PBS e adquira imediatamente.
   27. Se for necessária a fixação, fixe usando 0,5% c/v de PFA no PBS por 10 minutos, lave uma vez e mantenha em PBS até a aquisição. Proteja-se contra a luz.
   28. Antes da compensação, adquira padrões mesf, garantindo que as populações mais fracas e mais brilhantes caiam na faixa linear de medição.
   29. Adquira amostras de compensação, calcule a compensação e aplique a matriz de compensação (link) ao experimento.
   30. Adquira e economize um mínimo de 2 × ¹⁰⁴ padrões totais de MESF para cada um dos canais de quantificação.
   31. Para aquisição usando amostradores de alto rendimento, definir a aquisição do instrumento para o padrão, definir a aquisição de amostra para 80 μL (ou 80% do volume total), taxa de fluxo amostral entre 2,0 e 3,0 μL/s, volume de mistura amostral de 50 μL (ou 50% do volume total para evitar a formação de bolhas durante a mistura), mistura de amostras de 150 μL/s, e mistura por poço entre 3 e 5.
   32. Adquira um mínimo de 1 × ¹⁰⁴ BSLBs únicos por amostra (consulte os painéis figura 3B (i)-(vi) para a estratégia de gating de referência).
   33. Lave o cítmetro funcionando por 5 min de uma solução de limpeza seguida de 5 min de água ultrapura antes de desligar o instrumento. Se estiver usando o HTS, siga as opções embaixo da guia HTS e da opção Limpar .
   34. Exportar arquivos FCS.

7. Medindo a transferência sináptica de partículas para BSLB

1. Abra os arquivos FCS de experimento. Selecione a população de células e BSLBs com base em suas áreas de dispersão de luz lateral e dianteira (SSC-A versus FSC-A), como mostrado na Figura 3B (i).
2. Selecione os eventos dentro da janela de aquisição contínua (Figura 3B (ii)).
3. Foco nos eventos únicos de ambas as células e BSLB; identificar células únicas primeiro com base no baixo W nos portões sequenciais FSC-W/FSC-H (singlets-1, painel Figura 3B (iii)) e SSC-W/SSC-H (singlets-2; Painel figura 3B (iv)). Defina um portão singlets-3 adicional selecionando eventos com FSC-A proporcional e FSC-H (Figura 3B, painel (v)).
4. Extrair o MFI de frações MESF em branco e 1 a 4 e de células únicas e MESF para cada amostra de experimento.
5. Gerar valores de MFI (cMFI) corrigidos para frações mesf 1 a 4 subtraindo o MFI da população de contas em branco de cada fração.
6. Gerar cMFIs para BSLBs e células únicas (consulte o painel Figura 3C (i)).
7. Use o sinal da BSLB manchado com anticorpos de controle de isótipo para corrigir o MFI de BSLB manchado com anticorpos contra os marcadores de células T relevantes. Use cMFI para calcular a porcentagem de transferência sináptica normalizada (NST%) utilizando a equação mostrada no painel Figura 3C (ii).
8. Se interessados, em vez disso, nas partículas especificamente transferidas em resposta ao acionamento do TCR, subtraia o sinal de BSLBs nulos do MFI de BSLBs agonizantes. Use este cMFI para calcular o NST% orientado pelo TCR usando a equação mostrada no painel Figura 3C (ii).
9. Se estiver interessado em determinar o número total de moléculas transferidas como carga de partículas através da interface T cell-BSLB, adquira contas de referência MESF usando as mesmas configurações de instrumentos e sessão de aquisição para coculturas T cell-BSLB.
10. Analisar as populações de contas do MESF e extrair seus CMFIs conforme indicado nas etapas do protocolo 5.8.15 a 5.8.17. Calcule a inclinação da linha de melhor ajuste para a análise de regressão do MESF sobre cMFI.
11. Use a inclinação calculada para extrair o número de MESF depositado em BSLBs. Use cMFIs calculados usando controles de isótipo ou BSLB nulo como espaços em branco para extrair o número de MESF transferido especificamente para BSLBs estimulantes.
12. Calcule o número de moléculas de marcadores transferidos para BSLBs dividindo os MESFs calculados (médios) por BSLB pelo valor F/P do anticorpo de quantificação.

Resultados

FCM para quantificação absoluta de proteína na superfície celular
A reconstituição de BSLBs apresentando densidades fisiológicas de ligantes requer a estimativa de densidades proteicas totais no subconjunto celular modelado. Para reconstituir os BSLBs, inclua qualquer ligante relevante esperado para desempenhar um papel no eixo de sinalização de interesse ao lado de proteínas que suportem a adesão e interação funcional entre bslb e células, como ICAM-1 e moléculas costimulatórias, por exemplo, recepto...

Discussão

Os BSLBs são ferramentas versáteis para estudar a saída de partículas de células T estimuladas com membranas modelo APC. A flexibilidade do método permite a reconstituição de composições complexas e reducionistas da membrana para estudar os efeitos dos ligantes e seus sinais sobre a secreção de tSVs e partículas de ataque supramolecular e seus componentes. Testamos esta tecnologia em várias células T, incluindo TH pré-ativado, CTL, Tregs e ^CART15. Este protocolo também funciona para a medição da l...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-[(N-(5-amino-1-carboxipentil)ácido iminodiacético)succinil] (sal de níquel)	Avanti Polar Lipids	790404C-25mg	18:1 DGS-NTA(Ni) em clorofórmio
PIPETMAN L Multicanal P8x200L, 20-200 µ L	Gilson	FA10011
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina	Avanti Lipídios Polares	850375C-25mg	18:1 (Δ 9-Cis) PC (DOPC) em clorofórmio
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE) ATTO 390	ATTO-TEC	AD 390-165	DOPE ATTO 390
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE) ATTO 488	ATTO-TEC	AD 488-165	DOPE ATTO 488
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE) ATTO 565	ATTO-TEC	AD 565-165	DOPE ATTO 565
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(cap biotinyl) (sal de sódio)	Avanti Polar Lipids	870273C-25mg	18:1 Biotinyl Cap PE em clorofórmio
200 µ L pontas amarelas 10 x 96 Pontas, Empilhamento	Starlab	S1111-0206
5 mL tubos de poliestireno de fundo redondo	Falcon®
5.00 ± 0.05 µ m grânulos de sílica não funcionalizados	Bangs Laboratories Inc.
Placa de Cultura de Células de 96 Poços com Fundo em U com Tampa, Tratamento de cultura de tecidos, não pirogênico.	Costar®	3799	Para coloração FCM e co-cultura de BSLB e células.
Placa de cultura celular de 96 poços com fundo em V com tampa, tratamento de cultura de tecidos, não pirogênico.	Costar®	3894	Para coloração FCM de células ou grânulos em suspensão.
Alexa Fluor 488 NHS Ester (Éster Succinimidílico)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	A20000
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Éster Succinimidílico)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	A37573 e A20006
Allegra X-12R Centrífuga	Beckman Coulter		Para coloração normal em tubo de amostras biológicas para
FCM Folha de alumínio	Qualquer marca		Para proteger células e BSLBs da luz
anti-humana CD154 (CD40L), clone 24-31	BioLegend	310815 e 310818	conjugados Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 647, respectivamente.
CD185 anti-humano (CXCR5) Violeta Brilhante 711, clone J252D4	BioLegend	356934	Para análise quantitativa de FCM de células tonsilares, conforme mostrado na Fig. 1E
anti-CD19 humano Violeta Brilhante 421, clone HIB19	BioLegend	302234	Para análise quantitativa de FCM de células tonsilares, conforme mostrado na Fig. 1E
anti-CD2 humano, clone RPA-2.10	BioLegend	300202	Rotulado internamente com Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD2, clone TS1/8	BioLegend	309218	conjugado Brilliant Violet 421.
CD252 anti-humano (OX40L), clone 11C3.1	BioLegend		Alexa Fluor 647 conjugado
anti-CD28 humano, clone CD28.2	eBioscience	16-0289-85	Rotulado internamente com Alexa Fluor 647 NHS Ester (Éster Succinimidil)
anti-CD317 humano (BST2, PDCA-1), clone 26F8	ThermoFisher Scientific, invitrogen	53-3179-42	Alexa Fluor 488 conjugado, descobrimos que este clone é mais limpo que o clone RS38E.
CD38 anti-humano, clone HB-7	BioLegend	356624	conjugado Alexa Fluor 700
CD38 anti-humano, clone HIT2	BioLegend	303514	conjugado Alexa Fluor 647
CD39 anti-humano, clone A1	BioLegend		Marcado internamente com Alexa Fluor 647 NHS Ester (Éster Succinimidílico)
anti-humano CD4 Bright Violet 650, clone OKT4	BioLegend	317436	Para análise quantitativa de FCM de células tonsilares, conforme mostrado na Fig. 1E
CD4 anti-humano, clone A161A1	BioLegend	357414 e conjugados 357421	PerCP / Cyanine5.5 e Alexa Fluor 647, respectivamente
CD4 anti-humano, clone OKT4	BioLegend	317414 e conjugados 317422	PE / Cy7 e Alexa Fluor 647, respectivamente
CD40 anti-humano, clone 5C3	BioLegend	334304	Marcado internamente com Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidil Ester)
anti-humano CD40, clone G28.5	BioLegend		Marcado internamente com Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-humano CD45, clone HI30	BioLegend	304056 e 368516	Alexa Fluor 647 e APC/Cy7 conjugados
anti-humano CD47, clone CC2C6	BioLegend	323118	Alexa Fluor 647 conjugado
CD54 anti-humano (ICAM-1), clone HCD54	BioLegend	322702	Marcado internamente com Alexa Fluor 647 NHS Ester (Éster Succinimidílico)
anti-CD63 humano (LAMP-3), clone H5C6	BioLegend	353020 e 353015	conjugados PerCP/Cyanine5.5 e Alexa Fluor 647, respectivamente
anti-CD73 humano, clone AD2	BioLegend	344002	Marcado internamente com Alexa Fluor 647 NHS Ester (Éster Succinimidílico)
CD80 anti-humano, clone 2D10	BioLegend	305216	conjugado Alexa Fluor 647 conjugado
CD81 anti-humano, clone 5A6	BioLegend	349512 e conjugado 349502	PE/Cy7 e rotulado internamente com Alexa Fluor 647 NHS Ester (Éster Succinimidílico), respectivamente.
CD82 anti-humano, clone ASL-24	BioLegend	342108	conjugado Alexa Fluor 647
CD86 anti-humano, clone IT2.2	BioLegend	305416	conjugado Alexa Fluor 647
CD8a anti-humano, clone HIT8a	BioLegend	300920	Alexa Fluor 700 conjugado
anti-humano CD8a, clone SK1	BioLegend	344724	Alexa Fluor 700 conjugado
anti-humano HLA-A/ B/C/E, clone w6/32	BioLegend	311414 e conjugado 311402	Alexa Fluor 647 e marcado internamente com Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-humano HLA-DR, clone L243	BioLegend	307656 e conjugados 307622	Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 647, respectivamente.
anti-humano ICAM-1, clone HCD54	BioLegend	322702	Rotulado internamente com Alexa Fluor 647 NHS Ester (Éster Succinimidil)
anti-humano ICOS, clone C398.4A	BioLegend	313516	Hamster armênio IgG
anti-humano ICOSL, clone MIH12	BioLegend	329611	Alexa Fluor 647 conjugado
anti-humano ICOSL, clone MIH12	eBioscience	16-5889-82	Rotulado internamente com Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidil Éster)
anti-humano LFA-1, clone TS1/22	BioLegend	Produzido internamente	Rotulado internamente com Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidil Éster)
anti-humano OX40, clone Ber-ACT35 (ACT35)	BioLegend	350018	Alexa Fluor 647 conjugado
anti-humano PD-1, clone EH12.2H7	BioLegend	135230 e 329902	Alexa Fluor 647 conjugado e marcado internamente com Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidil Éster)
anti-humano PD-L1, clone 29E.2A3	BioLegend	329702	Marcado internamente com Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidil Éster)
anti-humano PD-L2, clone 24F.10C12	BioLegend	329611	Alexa Fluor 647 conjugado
anti-humano PD-L2, clone MIH18	BioLegend	345502	Rotulado internamente com Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-humano TCRab, clone IP26	BioLegend	306712 e 306714	conjugados Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 647, respectivamente.
CD156c anti-humano (ADAM10), clone SHM14	BioLegend	352702
CD317 anti-humano (BST2, Tetherin), clone RS38E	BioLegend	348404	Alexa Fluor 647 conjugado
hamster armênio IgG Alexa Fluor 647 Controle de isotipo, clone HTK888	BioLegend	400902	Rotulado internamente com Alexa Fluor 647 NHS Ester (Éster Succinimidil)
BD Cytometer Setup and Tracking beads	Becton Dickinson & Empresa (BD)	641319	Trilha de desempenho de instrumentos antes quantitativo FCM
BD FACSDiva	Becton Dickinson & Empresa (BD)	23-14523-00	Software de aquisição
Albumina de Sémen Bovino	Merck, Sigma-Aldrich	A3294
CaCl2, Cloreto de cálcio	Merck, Sigma-Aldrich	C5670	anidro, BioReagent, adequado para cultura de células de insetos, adequado para cultura de células vegetais, ≥ 96,0%
Caseína de leite bovino, adequado para substrato para proteína quinase (após desfosforilação), pó purificado	Merck, Sigma-Aldrich	C5890
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28	ThermoFisher Scientific, Gibco	11132D
DynaMag-2	ThermoFisher Scientific, Invitrogen™	12321D	Para a remoção do Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 em volumes inferiores a 2 mL
DynaMag™-15	ThermoFisher Scientific, Invitrogen™	12301D	Para a remoção de Dynabeads™ Ativador T humano CD3/CD28 em volumes inferiores a 15 mL
Soro bovino fetal qualificado, dose única	ThermoFisher Scientific, Gibco	A3160801	Precisa de inativação de calor por 30 min a 56 oC
Ficoll-Paque PLUS	Cytiva, GE Healthcare	GE17-1440-02	Solução estéril de polissacarídeo e diatrizoato de sódio para isolamento de linfócitos
Corante de viabilidade fixável eFluor 780	eBiosciences	65-0865-14	Para a exclusão de células mortas durante as análises
FlowJo	Becton Dickinson & Empresa (BD)	Versão 10.7.1	Software de análise
Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker	Keison Products	MPS-1	Para a mistura de células durante as colorações ou BSLBs durante o carregamento de proteínas (como alternativa à agitação orbital)
Solução tampão HEPES (1 M)	ThermoFisher Scientific, Gibco	15630-056
HEPES, N-(2-hidroxietil)piperazina-N′-(ácido 2-etanossulfónico), ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanossulfónico	Merck, Sigma-Aldrich	H4034	Para preparação de tampão HBS/HAS ou HBS/BSA. Certificado BioPerformance, ≥ 99,5% (titulação), adequado para cultura de células
HERACell 150i CO2 incubadora, 150 L, Aço Inoxidável Electropolido	ThermoFisher Scientific	51026282	Para cultura e expansão de células T CD4+ e CD8+ purificadas.
Misturador de Hula® Misturador de amostras	ThermoFisher Scientific, Life Technologies	15920D	Misturador de laboratório vertical de ângulo variável usado para a mistura de BSLBs e mistura principal de lipídios, soluções de bloqueio, mistura mestre de proteínas e colorações de anticorpos em pequena escala.
Albumina sérica humana, solução aquosa a 30%	Merck, Sigma-Aldrich	12667-M
Solução de bloqueio do receptor humano TruStain FcX Fc		Solução de bloqueio do receptor BioLegend 422302 Fc para bloqueio de receptores Fc de amostras biologicamente relevantes
Contador e analisador de células Innovatis CASY TT	Biovendis Products GmbH		Para a contagem de células e a determinação do tamanho e volume da célula com base na exclusão da corrente elétrica.
KCl, cloreto de potássio	Merck, Sigma-Aldrich	P5405	Powder, BioReagent, adequado para cultura de células
L-Glutamina 200 mM (100x)	ThermoFisher Scientific, Gibco	25030-024
MgCl2, cloreto de magessium	Merck, Sigma-Aldrich	M2393	BioReagent, adequado para cultura de células, adequado para cultura de células de insetos
Inserção de microtubo para 24 x 1,5/2,0 mL tubos	Keison Products	P-2-24	Microtube insert para Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker
Mini Incubator	Labnet International	I5110A-230V	Para a incubação (co-cultura) de BSLB e células na ausência de CO2
Meio essencial mínimo Aminoácidos não essenciais	ThermoFisher Scientific, Gibco	11140-035
Controle de anticorpos policlonais IgG de camundongo	Merck, Sigma-Aldrich	PP54	Usado como controle positivo para a medição de anticorpos ligados aos padrões
de esferas de captura de IgG de camundongoCamundongo IgG1, k Isotipo, clone MOPC-21	BioLegend	400129, 400112, 400130, 400144, 400128 e 400170	Alexa Fluor 488, PE, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, APC/Cyanine7 e Bright Violet 785  conjugados, respectivamente.
Rato IgG1, k Isotipo, clone X40	Becton Dickinson & Empresa (BD), Horizon	562438	Violeta Brilhante 421 conjugado.
IgG1 de camundongo, κ Controle de isotipo, clone P3.6.2.8.1	eBioscience	14-4714-82	Marcado internamente com Alexa Fluor 647 NHS Ester (Éster Succinimidílico)
Camundongo IgG2a, k Isotipo, clone MOPC-173	BioLegend	400240	Alexa Fluor 647 conjugado
Camundongo IgG2b, k Isotipo, clone MPC-11	BioLegend	400330 e 400355	conjugados Alexa Fluor 647 e Violeta Brilhante 785, respectivamente
Cultura de tecidos multipoços de 6 poços tratada com plasma gasoso	a vácuo Falcon	353046	Para cultura e expansão de células T CD4+ e CD8+
Na2HPO4, Fosfato Dissódico	Merck, Sigma-Aldrich	S7907
NaCl, Cloreto de sódio	Merck, Sigma-Aldrich	S5886	BioReagent, adequado para cultura de células, adequado para cultura de células de insetos, adequado para cultura de células vegetais, etc; 99%
NiSO4, sulfato de níquel (II)	Merck, Sigma-Aldrich	656895	Para saturar locais NTA; adicionado durante o processo de bloqueio
Penicilina Estreptomicina [+]10.000 unidades Penicilina; [+] 10.000 µ g/mL de Estreptomicina	ThermoFisher Scientific, Gibco	15140-122
Tamponamento com Fosfato Salino pH 7.4, estéril	ThermoFisher Scientific, Gibco	10010	Sem Ca2+ ou Mg2+ unidade de
filtro de polietersulfona (PES)	Thermo Scientific Nalgene	UY-06730-43	Membrana PES hidrofílica com baixa ligação a proteínas facilita a filtragem de soluções com alto teor de proteína
PURESHIELD argônio ISO 14175-I1-Ar	BOC Ltd.	11-Y	Para a proteção dos estoques de lipídios armazenados a +4 °C.
Estreptavidina Purificada	BioLegend	280302
Quantum Alexa Fluor 488 Contas MESF	Bangs Laboratories Inc.	488	grânulos de referência para a interpolação de moléculas Alexa Fluor 488 ligadas a células e/ou
grânulos BSLB Quantum Alexa Fluor 647 MESF	Bangs Laboratories Inc.	647	Grânulos de referência para a interpolação de moléculas Alexa Fluor 647 ligadas a células e/ou BSLB
Cadeia leve IgG Kappa anti-rato de rato, clone OX-20	ThermoFisher Scientific, invitrogen	SA1-25258	Marcado internamente com Alexa Fluor 647 NHS Ester (Éster Succinimidílico)
Humano recombinante IL-2	Peprotech	200-02-1MG
RMPI Medium 1640 (1x); [-] L-Glutamina	ThermoFisher Scientific, Gibco	31870-025
Coquetel de Enriquecimento de Células B Humanas Rosette	STEMCELL Technologies	15064	Isolamento de células B para medir densidades de proteínas em populações de células purificadas
Coquetel de Enriquecimento de Células T CD4+ Humanas	Rosette STEMCELL Technologies	15022C.1
Coquetel de Enriquecimento de Células T CD4+CD127low Rosette	STEMCELL Tecnologias	15361	Pré-enriquecimento de células T CD4+ CD127Low para o isolamento a jusante de Tregs por FACS.
Coquetel de Enriquecimento de Células T CD8+ Humanas Rosette	STEMCELL Technologies	15063
RPMI Medium 1640 (1x); [-] Vermelho de fenol	ThermoFisher Scientific, Gibco	11835-063	Para a incubação (co-cultura) de BSLB e células na ausência de CO2. O meio sem vermelho de fenol reduz a autofluorescência das células em medições baseadas em citometria de fluxo e microscopia.
Piruvato de Sódio (100 mM)	ThermoFisher Scientific, Gibco	11360-070
Sprout mini centrífuga	FisherScientific, Heathrow Scientific LLC	120301	Microcentrífuga de bancada usada para lavar esferas de sílica e BSLB em tubos Eppendorf de 1,5 mL.
Tubos de fundo redondo de poliestireno estéril cappeed 5 mL Falcon		352058
UltraComp eBeads Contas de compensação	ThermoFisher Scientific, invitrogen	01-2222-42
Colunas de Dessalinização Zeba Spin 7K MWCO	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	Rolamento 89882