Padronização de Microrganismos e Micropartículas através da Montagem Sequencial assistida pela Capilaridade

Summary

Apresentamos uma tecnologia que utiliza o conjunto assistido pela capilaridade em uma plataforma microfluida para padronizar objetos microdimensionados suspensos em um líquido, como bactérias e coloides, em matrizes prescritas em um substrato de polidimetilsiloxano.

Abstract

A padronização controlada de microrganismos em arranjos espaciais definidos oferece possibilidades únicas para uma ampla gama de aplicações biológicas, incluindo estudos de fisiologia microbiana e interações. No nível mais simples, a padronização espacial precisa dos microrganismos permitiria imagens confiáveis e de longo prazo de um grande número de células individuais e transformaria a capacidade de estudar quantitativamente interações micróbios dependentes da distância. Mais exclusivamente, acoplamento preciso da padronização espacial e controle total sobre as condições ambientais, como oferecido pela tecnologia microfluida, forneceria uma plataforma poderosa e versátil para estudos unicelulares em ecologia microbiana.

Este artigo apresenta uma plataforma microfluidica para produzir padrões versáteis e definidos pelo usuário de microrganismos dentro de um canal microfluido, permitindo acesso óptico completo para monitoramento de longo prazo e de alto rendimento. Esta nova tecnologia microfluida é baseada na montagem de partículas assistidas pela capilaridade e explora as forças capilares decorrentes do movimento controlado de uma suspensão evaporando dentro de um canal microfluido para depositar objetos microsized individuais em uma matriz de armadilhas microfabricadas em um substrato polidimetilsiloxano (PDMS). Deposições sequenciais geram o layout espacial desejado de objetos únicos ou múltiplos de micro-tamanho, ditados unicamente pela geometria das armadilhas e pela sequência de enchimento.

A plataforma foi calibrada usando partículas coloidais de diferentes dimensões e materiais: provou ser uma ferramenta poderosa para gerar diversos padrões coloidais e realizar a funcionalidade superficial de partículas presas. Além disso, a plataforma foi testada em células microbianas, utilizando células Escherichia coli como bactéria modelo. Milhares de células individuais foram padronizadas na superfície, e seu crescimento foi monitorado ao longo do tempo. Nesta plataforma, o acoplamento da deposição unicelular e da tecnologia microfluidica permite tanto a padronização geométrica de microrganismos quanto o controle preciso das condições ambientais. Assim, abre uma janela para a fisiologia de micróbios únicos e a ecologia das interações micróbios-micróbios, como mostrado por experimentos preliminares.

Introduction

A padronização espacial de microrganismos únicos, particularmente dentro de arenas experimentais que permitem o controle total sobre as condições ambientais, como dispositivos microfluidos, é altamente desejável em uma ampla gama de contextos. Por exemplo, organizar microrganismos em matrizes regulares permitiria a imagem precisa de um grande número de células individuais e o estudo de seu crescimento, fisiologia, expressão genética em resposta a estímulos ambientais e suscetibilidade de medicamentos. Também permitiria estudar interações célula-células de particular interesse em pesquisa em comunicação celular (por exemplo, sensoriamento de quórum), alimentação cruzad....

Protocol

1. Preparação do mestre do silício

NOTA: Os modelos PDMS com as armadilhas microfráricas que formam o modelo de padronização coloidal e microbiana foram fabricados de acordo com o método introduzido por Geissler et al. ^{17 anos}. O mestre de silício foi preparado por litografia convencional em uma sala de limpeza. Veja as etapas a seguir para o procedimento e a Tabela de Materiais para o equipamento.

1. Projete os recursos usando o software CAD (Computer-Aided Design, design auxiliado por computador).
2. Prepare a máscara de vidro cromado com uma camada ....

Results

Uma plataforma microfluida que explora o conjunto assistido pela capilaridade para padronizar partículas coloidais e bactérias em armadilhas microfíbridas em um modelo PDMS foi desenvolvida. Duas geometrias de canais diferentes foram projetadas para otimizar a padronização de coloides e bactérias através do conjunto assistido pela capilaridade. A geometria do primeiro canal (Figura 1B) consiste em três seções paralelas de 23 mm de comprimento sem barreira física entre eles. As duas seções na.......

Discussion

A plataforma microfluida descrita aqui permite a padronização de objetos micro-tamanhos, como coloides e bactérias, em arranjos espaciais prescritos em um substrato PDMS. O controle total sobre as condições ambientais oferecidos pelos microfluidos e a capacidade de padronizar células com precisão micrométrica concedida pela tecnologia sCAPA torna-a uma plataforma muito promissora para futuros estudos de fisiologia e ecologia.

Nos experimentos apresentados neste trabalho, o mestre de silício fo.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcatel AMS 200SE I-Speeder	Alcatel Micro Sistema		Usinagem Sistema de troca iônica reativa profunda Detergente
Alconox
AZ400K desenvolvedor	MicroChemicals	AZ400K
BD Seringa de 10 mL (Luer-Lock)	BD	300912	usado para lavar caldo de lisogenia fresco no canal microfluídico
Box Incubator	Life Serviços de imagem	usados para garantir uma temperatura uniforme e constante no canal
m (vermelho)	microParticles GmbH	PS-FluoRed-Fi267
Partículas PS fluorescentes de diâmetro 1,08 µ m (verde)	microParticles GmbH	PS-FluoGreen-Fi182
Partículas PS fluorescentes de diâmetro 2,07 µ m (verde)	microParticles GmbH	PS-FluoGreen-Fi183
Partículas PS fluorescentes de diâmetro 2,08 µ m (vermelho)	microParticles GmbH	PS-FluoRed-Fi180
Gigabatch 310 M	PVA TePla		usado para tratar a plasma um wafer de silício de 10 cm
H401-T-CONTROLLER	Okolab		controlador da placa de vidro aquecida
H601-NIKON-TS2R-GLASS	Okolab		placa de vidro aquecido
Heidelberg DWL 2000	Heidelberg Instruments		UV laser direto escritor
Seringas de insulina, U 100, com luer	Codan Medical ApS	CODA621640	seringa de 1 mL usada para retirar a suspensão líquida durante o processo de padronização
Klayout	Opensource		usado para projetar os recursos do mestre de silício
LB Broth, Miller (Luria-Bertani)	Fisher Scientific	244610	Caldo de lisogenia lavado no canal microfluídico
Masterflex tubo de transferência	Masterflex	HV-06419-05	0.020'' ID, 0.06'' OD
MOPS (10x)	Teknova	M2101	diluído dez vezes com água milliQ e usado para substituir o meio noturno
Nikon Eclipse Ti2	Nikon Instruments		microscópio
openSCAD	Opensource		usado para projetar o molde
OPTIspin SB20	ATM group	51-0002-01-00	revelador de rotação
Câmara de plasma Zepto	Diener Electronic	ZEPTO-1	usado para tratar o plasma do modelo e do microcanal para ligá-los
Fotorresistente positivo AZ1505	MicroChemicals	AZ1505
Fosfato de potássio dibásico	Sigma Aldrich	P3786	adicionado ao MOPS 1x
Máquina de cura e lavagem Prusa CW1S	Prusa		usado para garantir que todo o polímero seja curado e o polímero não curado seja removido do molde
Prusa Resin - Tough	Prusa Research a.s.		Resina líquida fotossensível UV 405nm para impressão 3D
Prusa SL1 impressora 3D	Prusa		usada para imprimir o molde
Balança	VWR-CH	611-2605	usada para pesar a mistura PDMS
Wafer de silício (10 cm)	Silicon Materials Inc.		N/Phos < 100> 1-10 e ômega; cm
Sü alinhador de máscara ss MA6	SUSS MicroTec Group		usado para alinhar a máscara de cromo-vidro e o substrato e expor o substrato
elastômero de silicone	Sylgard 184	Dow Corning
Techni Etch Cr01	Technic		cromo gravante
Tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil) silano	Sigma Aldrich	448931	usado para silianizar o molde impresso em 3D
TWEEN 20	Sigma Aldrich	P1379	usado para garantir um ângulo de contato de recuo ideal durante o processo de padronização
Veeco Dektak 6 M	Veeco		profilômetro
VTC-100 Vacuum Spin Coater	MTI corporation		revestidor de rotação a vácuo