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Artigo de método

Um chip microfluídico simples para crescimento a longo prazo e imagem de Caenorhabditis elegans

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DOI:

10.3791/63136

⸱

11 de abril de 2022

 ,  , 
1National Centre for Biological Sciences, TIFR, 2Department of Biological Sciences, TIFR, 3InSTEM, 4Manipal Academy of Higher Education, 5Department of Mechanical Engineering, The University of Texas at Austin

Neste artigo

Resumo

O protocolo descreve um projeto de chip microfluídico simples e metodologia de microfabricação usada para cultivar C. elegans na presença de um suprimento contínuo de alimentos por até 36 h. O dispositivo de crescimento e imagem também permite imagens intermitentes de alta resolução a longo prazo de processos celulares e subcelulares durante o desenvolvimento por vários dias.

Resumo

Caenorhabditis elegans (C. elegans) provou ser um valioso sistema modelo para o estudo de processos biológicos de desenvolvimento e celular. Compreender esses processos biológicos geralmente requer imagens de longo prazo e repetidas do mesmo animal. Longos tempos de recuperação associados a métodos convencionais de imobilização feitos em almofadas de ágar têm efeitos prejudiciais sobre a saúde animal, tornando inadequado fotografar repetidamente o mesmo animal por longos períodos de tempo. Este artigo descreve um projeto de chip microfluídico, método de fabricação, protocolo de cultivo de C. elegans em chip e três exemplos de imagens de longo prazo para estudar processos de desenvolvimento em animais individuais. O chip, fabricado com polidimetilsiloxano e ligado em um vidro de cobertura, imobiliza os animais em um substrato de vidro usando uma membrana elastomérica que é desviada usando gás nitrogênio. A imobilização completa de C. elegans permite imagens robustas de lapso de tempo de eventos celulares e subcelulares de maneira livre de anestésico. Uma geometria do canal com uma grande seção transversal permite que o animal se mova livremente dentro de duas membranas de isolamento parcialmente seladas, permitindo o crescimento no canal com um suprimento contínuo de alimentos. Usando este chip simples, a imagem de fenômenos de desenvolvimento, como o crescimento do processo neuronal, o desenvolvimento vulvar e a arborização dendrítica nos neurônios sensoriais PVD, à medida que o animal cresce dentro do canal, pode ser realizada. O chip de crescimento e imagem a longo prazo opera com uma única linha de pressão, sem válvulas externas, consumíveis fluídicos baratos e utiliza protocolos padrão de manuseio de vermes que podem ser facilmente adaptados por outros laboratórios usando C. elegans.

Introdução

Caenorhabditis elegans provou ser um poderoso organismo modelo para estudar biologia celular, envelhecimento, biologia do desenvolvimento e neurobiologia. Vantagens como seu corpo transparente, ciclo de vida curto, fácil manutenção, número definido de células, homologia com vários genes humanos e genética bem estudada levaram C. elegans a se tornar um modelo popular tanto para descobertas de biologia fundamental quanto para pesquisas aplicadas 1,2. Compreender os processos biológicos e de desenvolvimento das células a partir de repetidas observações a longo prazo de animais individuais pode revelar-se benéfico. Convencionalmente, C. elegans é anestesiado em almofadas de ágar e fotografado ao microscópio. Os efeitos adversos dos anestésicos sobre a saúde dos animais limitam o uso de animais anestesiados para imagens intermitentes prolongadas e repetidas do mesmo animal 3,4. Avanços recentes em tecnologias microfluídicas e sua adaptação para aprisionamento sem anestesia de C. elegans com riscos insignificantes para a saúde permitem imagens de alta resolução do mesmo animal em um curto e longo período de tempo.

Os chips microfluídicos foram projetados para triagem de alto rendimento de C. elegans'5 6,7,8, aprisionamento e dispensação9, triagem de drogas10,11, estimulação de neurônios com imagens de alta resolução 12 e imagens de alta resolução do animal12,13,14. Folhas microfluídicas ultrafinas para imobilização em lâminas também foram desenvolvidas15. Estudos de longo prazo de C. elegans têm sido realizados utilizando imagens de baixa resolução de animais crescendo em cultura líquida para observar crescimento, dinâmica de cálcio, efeitos de drogas sobre seu comportamento16,17,18,19, sua longevidade e envelhecimento20. Estudos de longo prazo utilizando microscopia de alta resolução têm sido realizados para avaliar o desenvolvimento sináptico21, a regeneração neuronal22 e a adição mitocondrial23. Imagens de alta resolução de longo prazo e rastreamento do destino celular e diferenciação têm sido realizados em dispositivos multicanais24,25. Vários eventos celulares e subcelulares ocorrem ao longo das escalas de tempo de várias horas e requerem aprisionar o mesmo indivíduo em diferentes pontos de tempo durante o seu desenvolvimento para caracterizar todas as etapas intermediárias do processo para entender a dinâmica celular in vivo. Para visualizar processos biológicos, como organogênese, desenvolvimento neuronal e migração celular, o animal precisa ser imobilizado na mesma orientação em vários pontos de tempo. Publicamos anteriormente um protocolo para imagens de alta resolução de C. elegans por mais de 36 h para determinar onde as mitocôndrias são adicionadas ao longo dos neurônios receptores de toque (TRNs)23.

Este artigo fornece um protocolo para estabelecer uma metodologia baseada em microfluídica para imagens repetidas de alta resolução. Este dispositivo, com um único canal de fluxo, é mais adequado para imagens repetidas de um único animal por dispositivo. Para melhorar a produtividade e a imagem de muitos animais de uma só vez, vários dispositivos podem ser conectados à mesma linha de pressão, mas com conectores de três vias separados, controlando um único animal em cada dispositivo. O design é útil para estudos que exigem imagens de lapso de tempo de alta resolução, como processos de desenvolvimento pós-embrionários, migração celular, transporte de organelas, estudos de expressão gênica, etc. A tecnologia pode ser limitante para algumas aplicações, como estudos de tempo de vida e envelhecimento, que exigem crescimento paralelo e imagens de muitos animais em estágio avançado. O elastômero polidimetilsiloxano (PDMS) foi utilizado para a fabricação deste dispositivo devido à sua bioestabilidade26, biocompatibilidade 27,28, permeablilidade gasosa 29,30 e módulo elástico ajustável 31. Este dispositivo de duas camadas permite o crescimento de animais com suprimento contínuo de alimentos em um canal microfluídico e o aprisionamento de C. elegans individuais via compressão de membrana PDMS usando gás nitrogênio. Este dispositivo é uma extensão do dispositivo publicado anteriormente com a vantagem de cultivar e fotografar o mesmo animal no microcanal sob um suprimento contínuo de alimentos3. A rede de membrana de isolamento adicional e uma membrana de aprisionamento de 2 mm de largura permitem a imobilização eficiente de animais em desenvolvimento. O dispositivo tem sido usado para observar o desenvolvimento neuronal, o desenvolvimento vulvar e a arborização dendrítica em neurônios sensoriais PVD. Os animais crescem sem efeitos adversos à saúde no dispositivo e podem ser repetidamente imobilizados para facilitar a imagem de eventos subcelulares no mesmo animal durante o seu desenvolvimento.

Todo o protocolo é dividido em cinco partes. A Parte 1 descreve a fabricação do dispositivo para o chip de crescimento e imagem. A Parte 2 descreve como configurar um sistema de pressão para a deflexão da membrana PDMS para imobilizar e isolar C. elegans individuais. A Parte 3 descreve como sincronizar C. elegans em uma placa de meio de crescimento de nematoides (NGM) para imagens de dispositivos. A Parte 4 descreve como carregar um único animal no dispositivo e cultivar o animal dentro do dispositivo microfluídico por vários dias. A Parte 5 descreve como imobilizar um animal individual em vários pontos de tempo, capturar imagens de alta resolução usando diferentes objetivos e analisar as imagens usando Fiji.

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Protocolo

1. Fabricação de crescimento e dispositivo de imagem

  1. Fabricação de moldes SU8
    1. Projete os padrões 1 (camada de fluxo) e 2 (camada de controle) usando formas retangulares em um software de processamento de texto (ou um software CAD de projeto auxiliado por computador) e imprima as fotomáscaras com a ajuda de um plotter a laser com um tamanho mínimo de recurso de 8 μm em filme à base de poliéster (Figura 1).
    2. Corte as bolachas de silício em pedaços de 2,5 cm × 2,5 cm e limpe-as com 20% KOH durante 1 min. Lave as bolachas em água deionizada (DI). Use uma bolacha cada para o fluxo e a camada de controle.
      CUIDADO: KOH é corrosivo e deve ser manuseado com cuidado.
    3. Secar as peças com gás nitrogênio comprimido de 14 psi seguido de desidratação em placa quente a 120 °C por 4 h. Antes de prosseguir para a próxima etapa, resfrie as duas peças até a temperatura ambiente.
    4. Pegue uma das peças de silício e coloque-a no mandril de um revestidor de fiação e ligue o vácuo para manter a bolacha no lugar. Na peça de silício, coloque ~20 μL de hexametildisilano (HMDS) e cubra-a usando o revestidor de rotação a 500 rotação por minuto (rpm) por 5 s seguido por 3.000 rpm por 30 s.
      CUIDADO: Esta etapa deve ser realizada em luz amarela. Não use luz branca na sala.
    5. Para obter uma espessura fotorresistente uniforme de ~40 μm (específica para a camada de fluxo; adequada para a imagem de animais do estágio larval inicial 1 ao estágio 3 (L1 - L3), cubra a bolacha de silício com ~1,5 mL de fotorresistência negativa-1 usando um revestidor de spin a 500 rpm por 5 s seguido por 2.000 rpm por 30 s.
    6. Repetir os passos 1.1.4 e 1.1.5 com a segunda bolacha para obter uma espessura fotorresistente uniforme de ~40 μm específica para a camada de controlo.
    7. Alternativamente, para aumentar a espessura da camada de fluxo para ~80 μm para animais mais velhos, cubra bolachas de silício com ~1,5 mL de fotorresist-2 negativo usando o revestidor de spin a 500 rpm por 5 s seguido por 2.000 rpm por 30 s. Esta espessura é adequada para o estágio L3 para animais adultos.
      CUIDADO: Segure as bolachas de silício ao lado para evitar qualquer dano às camadas revestidas por spin. Mantenha as luzes brancas apagadas durante esta etapa.
    8. Asse as peças de silício revestidas com fotorresistência (para as camadas de fluxo e controle) em uma placa quente a 65 °C por 1 min, seguida de 95 °C por 10 min. Arrefecer os pedaços cozidos à temperatura ambiente.
      NOTA: Os pedaços de silício cozido podem ser armazenados por um dia antes de prosseguir para a próxima etapa. Armazenar no escuro e não expor à luz branca.
    9. Coloque peças de silicone macias no estágio de exposição do iluminador UV com a superfície revestida de fotorresistência voltada para a lâmpada UV. Exponha as duas peças separadamente ao UV por 15 s, usando uma lâmpada de 200 W, através de uma fotomáscara com os padrões 1 e 2 para obter camadas de fluxo e controle, respectivamente.
      CUIDADO: Use óculos de segurança e evite a exposição direta à luz UV. Não acenda a luz branca na sala durante esta fase.
    10. Assar as duas peças de silício expostas com camada revestida voltada para cima, a 65 °C, seguidas de 95 °C durante 1 min e 10 min, respectivamente. Arrefecer as peças à temperatura ambiente antes de avançar para o passo seguinte.
    11. Desenvolver os padrões por imersão das peças de silício na solução reveladora fotorresistente (diluição 1:3 do revelador em isopropanol) por 20 min. Uma vez que o padrão esteja visível, lave as peças com álcool isopropílico puro (IPA) e seque suavemente usando gás nitrogênio (14 psi).
      CUIDADO: Use um ambiente bem ventilado para este tratamento químico para evitar a exposição humana. Use luz branca somente depois que os recursos forem desenvolvidos e enxaguados com IPA.
    12. Mantenha as peças de silício em um exsicador com a superfície revestida voltada para cima. Expor as peças a vapores de silano derramando 50 μL de silano tricloro puro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil) em um pequeno copo de plástico ou em uma lâmina de vidro. Coloque o copo/lâmina dentro de um exsicador e incube por 2 h.
      CUIDADO: Evite a exposição direta ao vapor de silano. Use sempre uma câmara selada para o tratamento de vapor de silano.
      NOTA: Se necessário, as peças de silício desenvolvidas podem ser armazenadas por 1-2 dias antes de prosseguir para a próxima etapa.
  2. Fabricação de chips PDMS
    1. Faça PDMS em um copo de plástico misturando a base de elastômero com o agente de cura em uma proporção de 10:1. Misture bem o conteúdo mexendo constantemente por 3 min. A mistura criará muitas bolhas de ar na mistura PDMS.
    2. Degaseifique a mistura PDMS em um exsicador por 30 minutos para remover todas as bolhas de ar.
      CUIDADO: Certifique-se de que as bolhas de ar sejam removidas da mistura PDMS antes que ela seja derramada nos recursos, pois as bolhas podem causar dispositivos defeituosos e não funcionais.
    3. Coloque as bolachas de silício com a camada de controle (padrão 2) em uma placa de Petri. Despeje suavemente uma camada de mistura PDMS de 5 mm de espessura sobre a peça de silício evitando qualquer formação de bolhas.
    4. Desgaseifique a mistura PDMS em um exsicador para remover bolhas adicionais que são formadas durante o processo de derramamento PDMS.
    5. Coloque a bolacha de silício com camada de fluxo (padrão 1) no mandril giratório aplicando pressão de vácuo de 200-500 mTorr para segurar a bolacha. Despeje ~1 mL de PDMS na bolacha de silício e cubra-a usando um revestidor de rotação a 500 rpm por 5 s seguido por 1.000 rpm por 30 s para obter uma camada de ~80 μm de espessura.
    6. Asse as duas bolachas de silício com o PDMS revestido por rotação e derrame as camadas de PDMS a 50 °C num forno de convecção de ar quente durante 6 h. Após o cozimento, aguarde que as peças esfriem à temperatura ambiente.
    7. Corte a camada PDMS de 5 mm de espessura da peça de silício ao redor da camada de controle (padrão 2) usando uma lâmina afiada e remova-a do substrato de silício.
    8. Perfure dois orifícios de ~1 mm de diâmetro usando um perfurador Harris no reservatório do bloco PDMS para conectar o canal de imobilização e as entradas do canal de isolamento às linhas de gás para deflexões de membrana PDMS.
    9. Coloque a peça de silício com a camada PDMS revestida por rotação no padrão 1 (camada de fluxo), com a superfície revestida de PDMS voltada para cima, em uma bandeja de plástico. Mantenha o bloco PDMS perfurado com o padrão 2 (camada de controle) na bandeja com o lado moldado voltado para cima.
    10. Mantenha a bandeja de plástico dentro de um limpador de plasma e exponha as duas superfícies PDMS a plasma de ar de 18 W por 2 minutos sob baixo vácuo (200-600 mTorr). Aplique vácuo até que a câmara fique violeta brilhante. Execute esta etapa com pouca luz para ver a mudança de cor do plasma.
    11. Retire os dois blocos tratados com plasma e ligue suavemente os blocos pressionando as superfícies tratadas com plasma dos padrões 1 e 2 juntas. Asse os padrões colados a 50 °C durante 2 h num forno de convecção de ar quente.
    12. Retire o dispositivo colado do forno. Corte o dispositivo colado da bolacha de silício com o padrão 1 e o padrão 2 e faça furos nos reservatórios de entrada e saída da camada de fluxo usando o perfurador Harris.
    13. Coloque o bloco PDMS colado com a camada de fluxo voltada para cima em uma bandeja de plástico. Mantenha um vidro de cobertura limpo (#1.5) na mesma bandeja. Exponha os blocos e o vidro da tampa a plasma de ar de 18 W por 2 min. Ajuste a pressão de vácuo para ver uma câmara violeta.
      NOTA: Esta etapa deve ser feita com pouca luz para ver a mudança de cor do plasma. Para limpar o vidro da tampa, lave-o com IPA e seque com gás nitrogênio a 14 psi.
    14. Coloque o bloco PDMS exposto a plasma em cima do vidro da tampa e asse a estrutura colada em forno a 50 °C durante 2 h. Armazene o dispositivo em uma câmara limpa para qualquer experimento futuro.

2. Escorva da membrana do PDMS

  1. Pegue o dispositivo e coloque-o em um estereomicroscópio e prenda as tubulações. Conecte o tubo micro flex (diâmetro interno ~5 mm, diâmetro externo ~8 mm) a uma linha de gás nitrogênio comprimido em uma extremidade. Conecte um conector de três vias na outra extremidade. Os tubos 1 e 2 dos conectores de três vias serão conectados ao purgador e às membranas isolantes, respectivamente.
  2. Conecte dois tubos micro flex (diâmetro interno ~1,6 mm, diâmetro externo ~5 mm) às duas portas de saída da torneira de três vias. Conecte a outra extremidade dos dois tubos a uma agulha 18 G de 8 mm de comprimento.
  3. Preencha a camada de fluxo com buffer M9 usando uma micropipeta através da porta de entrada. Encha ambos os tubos com água DI através da extremidade conectada à agulha. Insira as duas agulhas nos orifícios perfurados, conectando a membrana de isolamento e aprisionamento, respectivamente.
  4. Abra o regulador de gás nitrogênio a 14 psi e gire a válvula de três vias do tubo 1 para empurrar a água para o dispositivo através dos canais microfluídicos nas camadas de controle, ou seja, as membranas de armadilha e isolamento.
  5. Espere até que a água encha o canal sem a presença de qualquer gota de ar em ambos os canais. Uma vez que os canais estão completamente cheios de água, os canais são considerados preparados.
  6. Libere a pressão usando a torneira de três vias uma vez que os canais estejam cheios de água e preparados. O escorva pode levar a bolhas na camada de fluxo, remova as bolhas fluindo meios adicionais através do canal de fluxo.

3. Manutenção e sincronização de C. elegans

NOTA: Cepas de C. elegans: O estudo utilizou os seguintes transgenes PS3239 (dpy-20(e1282) syIs49 IV [MH86p(dpy-20(+) + pJB100(ZMP-1::GFP)]) para desenvolvimento vulvar 32, jsIs609 (mec7p::MLS(sinal de localização da matriz mitocondrial)::GFP)33 para desenvolvimento de neurônios receptores de toque (TRN) e imagens de transporte de mitocôndrias, e wdIs51(F49H12.4::GFP + unc-119(+)) para rastrear o desenvolvimento de PVD34. O protocolo padrão de cultura e manutenção de C. elegans foi seguido35.

  1. Cultivar C. elegans nas placas de Petri do meio de crescimento de nematoides (NGM) com E. coli OP50 como fonte de alimento a 22 °C. Mantenha as cepas de C. elegans transferindo repetidamente alguns hermafroditas ou fragmentando uma pequena quantidade de ágar com alguns animais para uma nova placa de NGM com um gramado OP50.
  2. Após 3-5 dias, verifique a placa NGM para o crescimento do animal e ovos de C. elegans. Recolha e transfira aproximadamente 30 ovos de um prato para um prato de NGM fresco com relvado OP50.
  3. Para sincronizar os animais para a obtenção de imagens, transfira todos os ovos não eclodidos da placa a cada 2 h para uma placa fresca e mantenha-os a 22 °C. Aproximadamente 15-20 ovos eclodirão em cada prato.
  4. Colher os animais entre 14-16 h e 28-30 h após a eclosão para os estágios larval 2 (L2) e larval 3 (L3), respectivamente. Transfira os animais para o dispositivo microfluídico para geração de imagens. Adicione o suprimento de alimentos conforme descrito na próxima seção para manter o animal dentro do dispositivo para experimentos de crescimento e imagem a longo prazo.

4. Crescimento de C. elegans dentro do dispositivo microfluídico de crescimento e imagem

  1. Monte um dispositivo microfluídico de crescimento e imagem em um microscópio invertido e visualize o padrão 2, após conectar as membranas de isolamento e a membrana de imobilização, em baixas ampliações (4x ou 10x). Certifique-se de que os canais estão cheios de água destilada limpa.
  2. Preparar uma solução fresca de 1 L de meio S usando 10 mL de citrato de potássio 1 M pH 6,0, 10 mL de solução de metais vestigiais, 3 mL de CaCl2 1 M, 3 mL de 1 M MgSO4. Prepare a solução em condições estéreis. Não autoclave o meio S.
  3. Preencha o canal de fluxo com meios de crescimento (meio S) 10 min antes do experimento. Evite bolhas de ar no canal de fluxo. Flua um meio adicional, se necessário, para remover as bolhas de ar.
  4. Escolher um único animal do estágio de desenvolvimento necessário de uma placa NGM em 10 μL de meio S usando uma micropipeta e empurrar o animal para o canal de fluxo através do orifício de entrada.
  5. Monitore a posição do animal no canal de fluxo usando uma objetiva de baixa ampliação. Fluir meio adicional através da entrada ou saída para empurrar o animal e posicioná-lo dentro do canal de fluxo restrito entre as duas membranas de isolamento.
  6. Abra a torneira de três vias para aplicar pressão de 14 psi nos canais de isolamento e empurre as membranas para baixo no canal de fluxo.
    NOTA: A membrana sela parcialmente o canal de fluxo e restringe o movimento do animal para a região entre as duas membranas de isolamento.
  7. Use uma única colônia de E. coli OP50 de uma placa estriada para inocular 250 mL de caldo L (2,5 g de bacto-triptona, 1,25 g de levedura bacto, 1,25 g de NaCl em H2O). Cultivar a cultura inoculada durante a noite a 37 °C.
  8. Aliquota 500 μL de cultura OP50 em tubos centrífugos estéreis de 1,5 mL e armazene o estoque e a alíquota por 2 semanas a 4 °C.
  9. Pellet down da cultura OP50 por centrifugação a 1,3 x g por 5 min. Dissolva o pellet com 1 mL de meio S fresco (diluição de 0,5x) e armazene-o à temperatura ambiente por 3-4 dias. Use este OP50 diluído para alimentar C. elegans dentro de dispositivos microfluídicos.
  10. Deixe uma gota de meio S em cima dos reservatórios de entrada e saída para reduzir a evaporação do meio S no canal de fluxo.
  11. Tomar a solução diluída de OP50 numa micropipeta de 10 μL. Retire a microponta preenchida com a solução OP50 da pipeta e pressione a ponta no reservatório de entrada. Em seguida, coloque outra ponta de micropipeta com 10 μL de solução alimentar e insira-a no reservatório de saída.
  12. Sele a cabeça da ponta aplicando pressão usando um dedo para garantir a continuidade das soluções alimentares sem qualquer espaço de ar. Troque a ponta da micropipeta com a solução OP50 todos os dias que não tenha mais de 3-4 dias.
  13. Encha um adicional de 20-30 μL de solução alimentar em ambas as pontas. Adicionar ou remover a solução alimentar de e para a ponta da micropipeta para ajustar o gradiente para empurrar o animal no canal de fluxo e ajustar a posição do animal sob a membrana de aprisionamento para geração de imagens.
  14. Monitore o fluxo de bactérias para garantir que ele seja contínuo através das membranas de isolamento parcialmente fechadas no canal de fluxo usando imagens de campo brilhante.
    NOTA: Na ausência de fluxo de bactérias, os animais podem comer as bactérias disponíveis no canal de fluxo entre as duas membranas de isolamento. No caso de nenhuma bactéria ou nenhum fluxo presente no canal, substitua as duas pontas de micropipeta na entrada e saída por novas pontas de pipeta cheias de suprimentos de alimentos recém-preparados.

5. Imobilização e imagem de C. elegans

  1. Imobilização de C. elegans sob a membrana de aprisionamento
    1. Localize um único animal no canal de crescimento em baixas ampliações. Ajuste as alturas da solução alimentar nas duas pontas da micropipeta conectadas aos reservatórios de entrada e saída. Empurre o animal na direção necessária usando as diferenças de pressão hidrostática no canal de fluxo.
    2. Posicione o animal no centro da membrana de aprisionamento e monitore seu comportamento de natação usando uma objetiva de baixa ampliação (4x).
    3. Gire a torneira de três vias para aumentar a pressão no canal da armadilha lentamente. Imobilize o animal sob a membrana da armadilha em uma postura reta ao longo da parede de limite do canal de crescimento.
      CUIDADO: Evite prender o animal através do canal de fluxo em uma posição de curvatura Z ou U. Isso faz com que o corpo do animal seja espremido com maior pressão e causa danos permanentes à sua saúde.
  2. Imagem de C. elegans e liberação da membrana
    1. Transportar e carregar o dispositivo em um estágio de microscópio. Configure um microscópio invertido nas configurações de imagem desejadas com todos os componentes ópticos necessários (objetiva, fonte de luz, filtros de fluorescência e um detector) para campo brilhante de alta resolução, contraste de imagem diferencial (DIC) ou imagem de fluorescência (Figura 1 Suplementar).
    2. Adquira uma única ou várias imagens de fluorescência de lapso de tempo para capturar eventos celulares e subcelulares.
    3. Adquirir imagens de fluorescência de neurônios de C. elegans em função de seu desenvolvimento usando um objetivo de abertura numérica (NA) de 60x, 1,4, um laser de comprimento de onda de 488 nm com potência de laser de 7% a 10%, uma câmera CCD, em um microscópio de disco giratório. Realize imagens de lapso de tempo usando o software fornecido com o microscópio e adquira imagens a uma velocidade de 4 quadros por segundo (Figura 1 Suplementar).
    4. Após a aquisição das imagens, libere a pressão de aprisionamento e monitore a locomoção do animal em baixas ampliações - 4x e 10x. Manter o animal restrito dentro da região definida por membranas isolantes (mantidas abaixo de 14 psi durante todo o experimento).
    5. Ajuste o volume de solução alimentar nas duas pontas da micropipeta para continuar um fluxo de alimentos lento impulsionado pela gravidade no canal de crescimento. Este fluxo de alimentos é obtido ajustando os níveis das soluções alimentares em micropipetas na entrada e na saída (tipicamente 1-5 mm de diferença de altura).
    6. Visualize o fluxo sob um campo brilhante a partir do padrão de fluxo das bactérias no canal de crescimento.
      NOTA: Na ausência de fluxo, o animal come as bactérias OP50 disponíveis, o canal parece claro e o animal passa fome durante algumas horas. Um animal faminto normalmente desenvolve alta autofluorescência, facilmente observável ao adquirir imagens de fluorescência de lapso de tempo. Tais eventos têm efeitos prejudiciais sobre a fisiologia animal e foram evitados nos experimentos.
    7. Repita as etapas 5.2.1-5.2.3 após um intervalo de tempo predeterminado para adquirir imagens de fluorescência/DIC/campo brilhante do mesmo indivíduo em vários pontos de tempo.
    8. Depois que as imagens forem adquiridas em vários pontos de tempo desejados do mesmo animal individual, libere a pressão de isolamento e aprisionamento. Lave o canal com tampão M9 e empurre o animal através do reservatório de entrada. Recupere o animal do reservatório e coloque-o em uma placa de NGM fresca para monitoramento adicional da saúde.
    9. Lave o canal com tampão M9 algumas vezes para remover as bactérias. Enxaguar o canal de fluxo com álcool etílico a 70% (diluído em água destilada). Seque os canais empurrando o ar usando uma seringa. Armazene o dispositivo em um local seco e livre de poeira para uso repetido no futuro.
  3. Análise de imagens e estatísticas
    1. Use o software FIJI ImageJ para análise de imagem tiff. Abra imagens tiff das imagens de lapso de tempo PVD dos animais wdIs51 em Fiji ImageJ. Extraia os melhores planos da pilha de planos z mostrando os processos primários selecionando a guia Imagem > projeto Pilhas > Z.
    2. Filtre toda a série de imagens e encontre quadros de imagem específicos que cubram com sucesso todos os processos neuronais usando seções sobrepostas dos quadros de imagem animal. Selecione Plug-in > Analisar Contador de Células > na barra de ferramentas FIJI. Isso abrirá uma janela para numerar diferentes ramos e manter uma contagem de cada neurônio selecionado.
    3. Selecione Inicializar Contadores de > > Type1 e marque as ramificações secundárias. Em seguida, selecione Tipo 2 e marque Quaternário, clique na janela Resultados mostrando contagens de todas as ramificações (Figura 2 Suplementar). Esse método exibirá as ramificações que já estão contadas.
    4. Abra a próxima imagem sobreposta e conte as ramificações restantes. Esse processo evitará a dupla contagem e garantirá que todos os processos sejam contados. Identificar e contar o número total de ramos primários presentes nos estágios larvais iniciais de C. elegans. Realizar análises semelhantes para as imagens para processos secundários e quaternários em animais mais velhos.
      NOTA: Os adultos mostram muitos processos que inervam nos músculos da parede do corpo e podem ser difíceis de contar. Certifique-se de que cada processo seja contado apenas uma vez.
    5. Calcule a distância entre os corpos celulares PVD nos animais wdIs51 desenhando uma linha segmentada do corpo celular PVD (CB) para o PVC CB. Para animais de estágio larval 4 (L4), os corpos celulares estão distantes e não estão no mesmo quadro quando fotografados com uma objetiva de 60x.
    6. Selecione imagens sobrepostas da pilha para cobrir todo o comprimento do animal da cabeça à cauda usando a guia Imagem > projeto Pilhas > Z da ImageJ. Desenhe linhas segmentadas ao longo do processo neuronal entre os CBs PVD e PVC.
    7. Meça os comprimentos de todas as linhas segmentadas usando ImageJ > Analyze > Measure. Adicione os comprimentos de todos os segmentos para calcular a distância total entre os CBs PVD e PVC para cada ponto de tempo.
    8. Para o comprimento dos neurônios de TRNs em animais jsIs609 , carregue as imagens em Fiji. Desenhe uma linha segmentada ao longo dos microtúbulos laterais posteriores (PLMs; visível com GFP solúvel) do corpo celular até o centroide da primeira mitocôndria. Calcule o comprimento da linha para o primeiro valor de distância.
    9. Desenhe uma linha segmentada do centro da primeira para a segunda mitocôndria. Repita este processo para cada par de mitocôndrias até o final do comprimento do processo neuronal. Adicione todos os comprimentos para calcular o comprimento total do processo neuronal.
    10. Para a análise da linhagem celular, carregue todas as imagens vulvais em Fiji e extraia a melhor imagem de foco das células das imagens de lapso de tempo de vários planos z.
    11. Representar os dados como média ± erro padrão da média (EPM). Calcule a significância estatística usando ANOVA unidirecional para mais de duas amostras ou um teste t de duas amostras para um par de amostras. Denote significância pelo valor de p < 0,05 (*), valor de p < 0,005 (**) e valor de p > 0,05 (ns, não significativo).

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Resultados

Caracterização do dispositivo: O dispositivo de crescimento e imagem consiste em duas camadas PDMS unidas (Figura 1) usando ligação de plasma irreversível. A camada de fluxo (padrão 1) que tem 10 mm de comprimento e 40 μm ou 80 μm de altura nos permite cultivar o animal em cultura líquida (Figura 1A). A camada de aprisionamento (padrão 2) possui uma membrana de 2 mm de largura (Figura 1B) para imobilização do anima...

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Discussão

Neste trabalho, um protocolo para fabricação e uso de um dispositivo microfluídico simples para o cultivo de C. elegans com suprimento constante de alimentos e imagens de alta resolução de um único animal durante seu desenvolvimento foi descrito. Este processo de fabricação é simples e pode ser feito em um ambiente não estéril. Um ambiente livre de poeira é fundamental durante as etapas de fabricação. A presença de partículas de poeira levaria ao contato inadequado entre as duas superfícies de ligação, resultand...

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Divulgações

S.M. e S.P.K. são autores de uma patente pendente sobre o dispositivo de imagem e crescimento microfluídico (Pedido de patente número 640/CHE/2011).

Agradecimentos

Agradecemos à instalação de imagem CIFF, NCBS pelo uso dos microscópios confocais apoiados pelo DST - Centre for Nanotechnology (No. SR/55/NM-36-2005). Agradecemos o financiamento de pesquisa do DBT (SPK), CSIR-UGC (JD), DST (SM), DBT (SM), disco giratório suportado pelo DAE-PRISM 12-R & D-IMS-5.02.0202 (SPK e Gautam Menon) e HHMI-IECS número de concessão 55007425 (SPK). As cepas HB101, PS3239 e wdIs51 foram fornecidas pelo Caenorhabditis Genetics Center (CGC), que é financiado pelo NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). S.P.K. fez jsIs609 no laboratório de Mike Nonet.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Agulhas de 18 GSigma-Aldrich, Bangalore, ÍndiaGauge 18
Cole-ParmerWW-30600-02Encaixe Masterflex com trava luer
Câmera CCDAndor Technology EMCCDC9100-13no
Placa de circuito FineLine Imaging, Colorado, EUAOs designs são impressos com 65.024 pontos por polegada (DPI)
Forno de ConvecçãoMeta-Lab Scientific Industries, ÍndiaMSI-5
Lamínulasde cobertura microscópico azul22mm x 10Gms
EtanolHi media
Harris uni-core puncher 1mmQiagenZ708801
HexametildisilazaneSigma-Aldrich, Bangalore, Índia440191
Placaquente  IKARCT B S 22
IsopropanolFisher Scientific26895
KOHFisher Scientific
ZEISSLSM 5 LIVE
Pontas de micropipetaTarsons0.5-10 µ As pontas de micropipeta L são usadas para fornecimento de alimentos
Negativo Fotorresistente-1MicrochemSU8-2025http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Negativo Fotorresistente-2MicroquímicoSU8-2050http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Gás nitrogênioFornecedor localGás nitrogênio comercialVolume do cilindro de 7 metros cúbicos
PDMS (solução de cura)Dow Corning Corporation, MI, EUA&nbsp; Solução de cura Sylgardagente de cura Placas Petri
Praveen Scientific Corporation
Limpador de plasmaHarrick Plasma, NY, EUA&nbsp; PDC-32G
Navalha e lâminasLister lâmina cirúrgica
Elastômero de silício (base)Dow Corning Corporation, MI, EUASylgard 184 basede elastômero base
Tubos de siliconeFisher ScientificTubos de plástico com o diâmetro interno de 1,59 mm e o diâmetro externo de 3,18 mm
Wafer de silícioUniversity Wafer, MA, EUA[100] orientação, 4 polegadas de diâmetroPequenos pedaços (2 mm e 2 mm) foram cortados de wafer de 100 mm de diâmetro
Spin CoaterSPS-Europe B.V., HolandaSPIN 150
Sistema VOX de ultra-visão Perkin ElmerCSU-X1-A3 NO sistema foi equipado com quatro lasers (405/488/561/640 nm) e controlado com o pacote de software Volocity.
Desenvolvedor SU8Microchem, MA, EUASU8 Desenvolvedor
Tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil) silanoSigma-Aldrich, Bangalore, Índia448931O vapor de silano de tricloro (1H, 1H, 2H, 2H, 2H-perfluorooctil) é
uma lâmpada UVOriel Instruments, Bangalore, Índia200 Watts e fonte de luz UV colimada
Software VolocityPerkin-Elmer análise
Torneira de 3 vias Vidro Microscópio de Varredura a Laser Microscópio de disco giratório tóxica Imagem

Referências

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