Um chip microfluídico simples para crescimento a longo prazo e imagem de Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans provou ser um poderoso organismo modelo para estudar biologia celular, envelhecimento, biologia do desenvolvimento e neurobiologia. Vantagens como seu corpo transparente, ciclo de vida curto, fácil manutenção, número definido de células, homologia com vários genes humanos e genética bem estudada levaram C. elegans a se tornar um modelo popular tanto para descobertas de biologia fundamental quanto para pesquisas aplicadas ^1,2. Compreender os processos biológicos e de desenvolvimento das células a partir de repetidas observações a longo prazo de animais individuais pode revelar-se benéfico. Convencionalmente, C. elegans é anestesiado em almofadas de ágar e fotografado ao microscópio. Os efeitos adversos dos anestésicos sobre a saúde dos animais limitam o uso de animais anestesiados para imagens intermitentes prolongadas e repetidas do mesmo animal ^3,4. Avanços recentes em tecnologias microfluídicas e sua adaptação para aprisionamento sem anestesia de C. elegans com riscos insignificantes para a saúde permitem imagens de alta resolução do mesmo animal em um curto e longo período de tempo.

Os chips microfluídicos foram projetados para triagem de alto rendimento de C. elegans'5 ^6,7,8, aprisionamento e dispensação⁹, triagem de drogas^10,11, estimulação de neurônios com imagens de alta resolução 12 e imagens de alta resolução do animal^12,13,14. Folhas microfluídicas ultrafinas para imobilização em lâminas também foram desenvolvidas¹⁵. Estudos de longo prazo de C. elegans têm sido realizados utilizando imagens de baixa resolução de animais crescendo em cultura líquida para observar crescimento, dinâmica de cálcio, efeitos de drogas sobre seu comportamento^16,17,18,19, sua longevidade e envelhecimento²⁰. Estudos de longo prazo utilizando microscopia de alta resolução têm sido realizados para avaliar o desenvolvimento sináptico²¹, a regeneração neuronal²² e a adição mitocondrial²³. Imagens de alta resolução de longo prazo e rastreamento do destino celular e diferenciação têm sido realizados em dispositivos multicanais^24,25. Vários eventos celulares e subcelulares ocorrem ao longo das escalas de tempo de várias horas e requerem aprisionar o mesmo indivíduo em diferentes pontos de tempo durante o seu desenvolvimento para caracterizar todas as etapas intermediárias do processo para entender a dinâmica celular in vivo. Para visualizar processos biológicos, como organogênese, desenvolvimento neuronal e migração celular, o animal precisa ser imobilizado na mesma orientação em vários pontos de tempo. Publicamos anteriormente um protocolo para imagens de alta resolução de C. elegans por mais de 36 h para determinar onde as mitocôndrias são adicionadas ao longo dos neurônios receptores de toque (TRNs)²³.

Este artigo fornece um protocolo para estabelecer uma metodologia baseada em microfluídica para imagens repetidas de alta resolução. Este dispositivo, com um único canal de fluxo, é mais adequado para imagens repetidas de um único animal por dispositivo. Para melhorar a produtividade e a imagem de muitos animais de uma só vez, vários dispositivos podem ser conectados à mesma linha de pressão, mas com conectores de três vias separados, controlando um único animal em cada dispositivo. O design é útil para estudos que exigem imagens de lapso de tempo de alta resolução, como processos de desenvolvimento pós-embrionários, migração celular, transporte de organelas, estudos de expressão gênica, etc. A tecnologia pode ser limitante para algumas aplicações, como estudos de tempo de vida e envelhecimento, que exigem crescimento paralelo e imagens de muitos animais em estágio avançado. O elastômero polidimetilsiloxano (PDMS) foi utilizado para a fabricação deste dispositivo devido à sua bioestabilidade²⁶, biocompatibilidade 27,28, permeablilidade gasosa ^29,30 e módulo elástico ajustável ³¹. Este dispositivo de duas camadas permite o crescimento de animais com suprimento contínuo de alimentos em um canal microfluídico e o aprisionamento de C. elegans individuais via compressão de membrana PDMS usando gás nitrogênio. Este dispositivo é uma extensão do dispositivo publicado anteriormente com a vantagem de cultivar e fotografar o mesmo animal no microcanal sob um suprimento contínuo de alimentos³. A rede de membrana de isolamento adicional e uma membrana de aprisionamento de 2 mm de largura permitem a imobilização eficiente de animais em desenvolvimento. O dispositivo tem sido usado para observar o desenvolvimento neuronal, o desenvolvimento vulvar e a arborização dendrítica em neurônios sensoriais PVD. Os animais crescem sem efeitos adversos à saúde no dispositivo e podem ser repetidamente imobilizados para facilitar a imagem de eventos subcelulares no mesmo animal durante o seu desenvolvimento.

Todo o protocolo é dividido em cinco partes. A Parte 1 descreve a fabricação do dispositivo para o chip de crescimento e imagem. A Parte 2 descreve como configurar um sistema de pressão para a deflexão da membrana PDMS para imobilizar e isolar C. elegans individuais. A Parte 3 descreve como sincronizar C. elegans em uma placa de meio de crescimento de nematoides (NGM) para imagens de dispositivos. A Parte 4 descreve como carregar um único animal no dispositivo e cultivar o animal dentro do dispositivo microfluídico por vários dias. A Parte 5 descreve como imobilizar um animal individual em vários pontos de tempo, capturar imagens de alta resolução usando diferentes objetivos e analisar as imagens usando Fiji.

1. Fabricação de crescimento e dispositivo de imagem

1. Fabricação de moldes SU8
   1. Projete os padrões 1 (camada de fluxo) e 2 (camada de controle) usando formas retangulares em um software de processamento de texto (ou um software CAD de projeto auxiliado por computador) e imprima as fotomáscaras com a ajuda de um plotter a laser com um tamanho mínimo de recurso de 8 μm em filme à base de poliéster (Figura 1).
   2. Corte as bolachas de silício em pedaços de 2,5 cm × 2,5 cm e limpe-as com 20% KOH durante 1 min. Lave as bolachas em água deionizada (DI). Use uma bolacha cada para o fluxo e a camada de controle.
      CUIDADO: KOH é corrosivo e deve ser manuseado com cuidado.
   3. Secar as peças com gás nitrogênio comprimido de 14 psi seguido de desidratação em placa quente a 120 °C por 4 h. Antes de prosseguir para a próxima etapa, resfrie as duas peças até a temperatura ambiente.
   4. Pegue uma das peças de silício e coloque-a no mandril de um revestidor de fiação e ligue o vácuo para manter a bolacha no lugar. Na peça de silício, coloque ~20 μL de hexametildisilano (HMDS) e cubra-a usando o revestidor de rotação a 500 rotação por minuto (rpm) por 5 s seguido por 3.000 rpm por 30 s.
      CUIDADO: Esta etapa deve ser realizada em luz amarela. Não use luz branca na sala.
   5. Para obter uma espessura fotorresistente uniforme de ~40 μm (específica para a camada de fluxo; adequada para a imagem de animais do estágio larval inicial 1 ao estágio 3 (L1 - L3), cubra a bolacha de silício com ~1,5 mL de fotorresistência negativa-1 usando um revestidor de spin a 500 rpm por 5 s seguido por 2.000 rpm por 30 s.
   6. Repetir os passos 1.1.4 e 1.1.5 com a segunda bolacha para obter uma espessura fotorresistente uniforme de ~40 μm específica para a camada de controlo.
   7. Alternativamente, para aumentar a espessura da camada de fluxo para ~80 μm para animais mais velhos, cubra bolachas de silício com ~1,5 mL de fotorresist-2 negativo usando o revestidor de spin a 500 rpm por 5 s seguido por 2.000 rpm por 30 s. Esta espessura é adequada para o estágio L3 para animais adultos.
      CUIDADO: Segure as bolachas de silício ao lado para evitar qualquer dano às camadas revestidas por spin. Mantenha as luzes brancas apagadas durante esta etapa.
   8. Asse as peças de silício revestidas com fotorresistência (para as camadas de fluxo e controle) em uma placa quente a 65 °C por 1 min, seguida de 95 °C por 10 min. Arrefecer os pedaços cozidos à temperatura ambiente.
      NOTA: Os pedaços de silício cozido podem ser armazenados por um dia antes de prosseguir para a próxima etapa. Armazenar no escuro e não expor à luz branca.
   9. Coloque peças de silicone macias no estágio de exposição do iluminador UV com a superfície revestida de fotorresistência voltada para a lâmpada UV. Exponha as duas peças separadamente ao UV por 15 s, usando uma lâmpada de 200 W, através de uma fotomáscara com os padrões 1 e 2 para obter camadas de fluxo e controle, respectivamente.
      CUIDADO: Use óculos de segurança e evite a exposição direta à luz UV. Não acenda a luz branca na sala durante esta fase.
   10. Assar as duas peças de silício expostas com camada revestida voltada para cima, a 65 °C, seguidas de 95 °C durante 1 min e 10 min, respectivamente. Arrefecer as peças à temperatura ambiente antes de avançar para o passo seguinte.
   11. Desenvolver os padrões por imersão das peças de silício na solução reveladora fotorresistente (diluição 1:3 do revelador em isopropanol) por 20 min. Uma vez que o padrão esteja visível, lave as peças com álcool isopropílico puro (IPA) e seque suavemente usando gás nitrogênio (14 psi).
       CUIDADO: Use um ambiente bem ventilado para este tratamento químico para evitar a exposição humana. Use luz branca somente depois que os recursos forem desenvolvidos e enxaguados com IPA.
   12. Mantenha as peças de silício em um exsicador com a superfície revestida voltada para cima. Expor as peças a vapores de silano derramando 50 μL de silano tricloro puro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil) em um pequeno copo de plástico ou em uma lâmina de vidro. Coloque o copo/lâmina dentro de um exsicador e incube por 2 h.
       CUIDADO: Evite a exposição direta ao vapor de silano. Use sempre uma câmara selada para o tratamento de vapor de silano.
       NOTA: Se necessário, as peças de silício desenvolvidas podem ser armazenadas por 1-2 dias antes de prosseguir para a próxima etapa.
2. Fabricação de chips PDMS
   1. Faça PDMS em um copo de plástico misturando a base de elastômero com o agente de cura em uma proporção de 10:1. Misture bem o conteúdo mexendo constantemente por 3 min. A mistura criará muitas bolhas de ar na mistura PDMS.
   2. Degaseifique a mistura PDMS em um exsicador por 30 minutos para remover todas as bolhas de ar.
      CUIDADO: Certifique-se de que as bolhas de ar sejam removidas da mistura PDMS antes que ela seja derramada nos recursos, pois as bolhas podem causar dispositivos defeituosos e não funcionais.
   3. Coloque as bolachas de silício com a camada de controle (padrão 2) em uma placa de Petri. Despeje suavemente uma camada de mistura PDMS de 5 mm de espessura sobre a peça de silício evitando qualquer formação de bolhas.
   4. Desgaseifique a mistura PDMS em um exsicador para remover bolhas adicionais que são formadas durante o processo de derramamento PDMS.
   5. Coloque a bolacha de silício com camada de fluxo (padrão 1) no mandril giratório aplicando pressão de vácuo de 200-500 mTorr para segurar a bolacha. Despeje ~1 mL de PDMS na bolacha de silício e cubra-a usando um revestidor de rotação a 500 rpm por 5 s seguido por 1.000 rpm por 30 s para obter uma camada de ~80 μm de espessura.
   6. Asse as duas bolachas de silício com o PDMS revestido por rotação e derrame as camadas de PDMS a 50 °C num forno de convecção de ar quente durante 6 h. Após o cozimento, aguarde que as peças esfriem à temperatura ambiente.
   7. Corte a camada PDMS de 5 mm de espessura da peça de silício ao redor da camada de controle (padrão 2) usando uma lâmina afiada e remova-a do substrato de silício.
   8. Perfure dois orifícios de ~1 mm de diâmetro usando um perfurador Harris no reservatório do bloco PDMS para conectar o canal de imobilização e as entradas do canal de isolamento às linhas de gás para deflexões de membrana PDMS.
   9. Coloque a peça de silício com a camada PDMS revestida por rotação no padrão 1 (camada de fluxo), com a superfície revestida de PDMS voltada para cima, em uma bandeja de plástico. Mantenha o bloco PDMS perfurado com o padrão 2 (camada de controle) na bandeja com o lado moldado voltado para cima.
   10. Mantenha a bandeja de plástico dentro de um limpador de plasma e exponha as duas superfícies PDMS a plasma de ar de 18 W por 2 minutos sob baixo vácuo (200-600 mTorr). Aplique vácuo até que a câmara fique violeta brilhante. Execute esta etapa com pouca luz para ver a mudança de cor do plasma.
   11. Retire os dois blocos tratados com plasma e ligue suavemente os blocos pressionando as superfícies tratadas com plasma dos padrões 1 e 2 juntas. Asse os padrões colados a 50 °C durante 2 h num forno de convecção de ar quente.
   12. Retire o dispositivo colado do forno. Corte o dispositivo colado da bolacha de silício com o padrão 1 e o padrão 2 e faça furos nos reservatórios de entrada e saída da camada de fluxo usando o perfurador Harris.
   13. Coloque o bloco PDMS colado com a camada de fluxo voltada para cima em uma bandeja de plástico. Mantenha um vidro de cobertura limpo (#1.5) na mesma bandeja. Exponha os blocos e o vidro da tampa a plasma de ar de 18 W por 2 min. Ajuste a pressão de vácuo para ver uma câmara violeta.
       NOTA: Esta etapa deve ser feita com pouca luz para ver a mudança de cor do plasma. Para limpar o vidro da tampa, lave-o com IPA e seque com gás nitrogênio a 14 psi.
   14. Coloque o bloco PDMS exposto a plasma em cima do vidro da tampa e asse a estrutura colada em forno a 50 °C durante 2 h. Armazene o dispositivo em uma câmara limpa para qualquer experimento futuro.

2. Escorva da membrana do PDMS

1. Pegue o dispositivo e coloque-o em um estereomicroscópio e prenda as tubulações. Conecte o tubo micro flex (diâmetro interno ~5 mm, diâmetro externo ~8 mm) a uma linha de gás nitrogênio comprimido em uma extremidade. Conecte um conector de três vias na outra extremidade. Os tubos 1 e 2 dos conectores de três vias serão conectados ao purgador e às membranas isolantes, respectivamente.
2. Conecte dois tubos micro flex (diâmetro interno ~1,6 mm, diâmetro externo ~5 mm) às duas portas de saída da torneira de três vias. Conecte a outra extremidade dos dois tubos a uma agulha 18 G de 8 mm de comprimento.
3. Preencha a camada de fluxo com buffer M9 usando uma micropipeta através da porta de entrada. Encha ambos os tubos com água DI através da extremidade conectada à agulha. Insira as duas agulhas nos orifícios perfurados, conectando a membrana de isolamento e aprisionamento, respectivamente.
4. Abra o regulador de gás nitrogênio a 14 psi e gire a válvula de três vias do tubo 1 para empurrar a água para o dispositivo através dos canais microfluídicos nas camadas de controle, ou seja, as membranas de armadilha e isolamento.
5. Espere até que a água encha o canal sem a presença de qualquer gota de ar em ambos os canais. Uma vez que os canais estão completamente cheios de água, os canais são considerados preparados.
6. Libere a pressão usando a torneira de três vias uma vez que os canais estejam cheios de água e preparados. O escorva pode levar a bolhas na camada de fluxo, remova as bolhas fluindo meios adicionais através do canal de fluxo.

3. Manutenção e sincronização de C. elegans

NOTA: Cepas de C. elegans: O estudo utilizou os seguintes transgenes PS3239 (dpy-20(e1282) syIs49 IV [MH86p(dpy-20(+) + pJB100(ZMP-1::GFP)]) para desenvolvimento vulvar 32, jsIs609 (mec7p::MLS(sinal de localização da matriz mitocondrial)::GFP)33 para desenvolvimento de neurônios receptores de toque (TRN) e imagens de transporte de mitocôndrias, e wdIs51(F49H12.4::GFP + unc-119(+)) para rastrear o desenvolvimento de PVD³⁴. O protocolo padrão de cultura e manutenção de C. elegans foi seguido³⁵.

1. Cultivar C. elegans nas placas de Petri do meio de crescimento de nematoides (NGM) com E. coli OP50 como fonte de alimento a 22 °C. Mantenha as cepas de C. elegans transferindo repetidamente alguns hermafroditas ou fragmentando uma pequena quantidade de ágar com alguns animais para uma nova placa de NGM com um gramado OP50.
2. Após 3-5 dias, verifique a placa NGM para o crescimento do animal e ovos de C. elegans. Recolha e transfira aproximadamente 30 ovos de um prato para um prato de NGM fresco com relvado OP50.
3. Para sincronizar os animais para a obtenção de imagens, transfira todos os ovos não eclodidos da placa a cada 2 h para uma placa fresca e mantenha-os a 22 °C. Aproximadamente 15-20 ovos eclodirão em cada prato.
4. Colher os animais entre 14-16 h e 28-30 h após a eclosão para os estágios larval 2 (L2) e larval 3 (L3), respectivamente. Transfira os animais para o dispositivo microfluídico para geração de imagens. Adicione o suprimento de alimentos conforme descrito na próxima seção para manter o animal dentro do dispositivo para experimentos de crescimento e imagem a longo prazo.

4. Crescimento de C. elegans dentro do dispositivo microfluídico de crescimento e imagem

1. Monte um dispositivo microfluídico de crescimento e imagem em um microscópio invertido e visualize o padrão 2, após conectar as membranas de isolamento e a membrana de imobilização, em baixas ampliações (4x ou 10x). Certifique-se de que os canais estão cheios de água destilada limpa.
2. Preparar uma solução fresca de 1 L de meio S usando 10 mL de citrato de potássio 1 M pH 6,0, 10 mL de solução de metais vestigiais, 3 mL de CaCl₂ 1 M, 3 mL de 1 M MgSO₄. Prepare a solução em condições estéreis. Não autoclave o meio S.
3. Preencha o canal de fluxo com meios de crescimento (meio S) 10 min antes do experimento. Evite bolhas de ar no canal de fluxo. Flua um meio adicional, se necessário, para remover as bolhas de ar.
4. Escolher um único animal do estágio de desenvolvimento necessário de uma placa NGM em 10 μL de meio S usando uma micropipeta e empurrar o animal para o canal de fluxo através do orifício de entrada.
5. Monitore a posição do animal no canal de fluxo usando uma objetiva de baixa ampliação. Fluir meio adicional através da entrada ou saída para empurrar o animal e posicioná-lo dentro do canal de fluxo restrito entre as duas membranas de isolamento.
6. Abra a torneira de três vias para aplicar pressão de 14 psi nos canais de isolamento e empurre as membranas para baixo no canal de fluxo.
   NOTA: A membrana sela parcialmente o canal de fluxo e restringe o movimento do animal para a região entre as duas membranas de isolamento.
7. Use uma única colônia de E. coli OP50 de uma placa estriada para inocular 250 mL de caldo L (2,5 g de bacto-triptona, 1,25 g de levedura bacto, 1,25 g de NaCl em H₂O). Cultivar a cultura inoculada durante a noite a 37 °C.
8. Aliquota 500 μL de cultura OP50 em tubos centrífugos estéreis de 1,5 mL e armazene o estoque e a alíquota por 2 semanas a 4 °C.
9. Pellet down da cultura OP50 por centrifugação a 1,3 x g por 5 min. Dissolva o pellet com 1 mL de meio S fresco (diluição de 0,5x) e armazene-o à temperatura ambiente por 3-4 dias. Use este OP50 diluído para alimentar C. elegans dentro de dispositivos microfluídicos.
10. Deixe uma gota de meio S em cima dos reservatórios de entrada e saída para reduzir a evaporação do meio S no canal de fluxo.
11. Tomar a solução diluída de OP50 numa micropipeta de 10 μL. Retire a microponta preenchida com a solução OP50 da pipeta e pressione a ponta no reservatório de entrada. Em seguida, coloque outra ponta de micropipeta com 10 μL de solução alimentar e insira-a no reservatório de saída.
12. Sele a cabeça da ponta aplicando pressão usando um dedo para garantir a continuidade das soluções alimentares sem qualquer espaço de ar. Troque a ponta da micropipeta com a solução OP50 todos os dias que não tenha mais de 3-4 dias.
13. Encha um adicional de 20-30 μL de solução alimentar em ambas as pontas. Adicionar ou remover a solução alimentar de e para a ponta da micropipeta para ajustar o gradiente para empurrar o animal no canal de fluxo e ajustar a posição do animal sob a membrana de aprisionamento para geração de imagens.
14. Monitore o fluxo de bactérias para garantir que ele seja contínuo através das membranas de isolamento parcialmente fechadas no canal de fluxo usando imagens de campo brilhante.
    NOTA: Na ausência de fluxo de bactérias, os animais podem comer as bactérias disponíveis no canal de fluxo entre as duas membranas de isolamento. No caso de nenhuma bactéria ou nenhum fluxo presente no canal, substitua as duas pontas de micropipeta na entrada e saída por novas pontas de pipeta cheias de suprimentos de alimentos recém-preparados.

5. Imobilização e imagem de C. elegans

1. Imobilização de C. elegans sob a membrana de aprisionamento
   1. Localize um único animal no canal de crescimento em baixas ampliações. Ajuste as alturas da solução alimentar nas duas pontas da micropipeta conectadas aos reservatórios de entrada e saída. Empurre o animal na direção necessária usando as diferenças de pressão hidrostática no canal de fluxo.
   2. Posicione o animal no centro da membrana de aprisionamento e monitore seu comportamento de natação usando uma objetiva de baixa ampliação (4x).
   3. Gire a torneira de três vias para aumentar a pressão no canal da armadilha lentamente. Imobilize o animal sob a membrana da armadilha em uma postura reta ao longo da parede de limite do canal de crescimento.
      CUIDADO: Evite prender o animal através do canal de fluxo em uma posição de curvatura Z ou U. Isso faz com que o corpo do animal seja espremido com maior pressão e causa danos permanentes à sua saúde.
2. Imagem de C. elegans e liberação da membrana
   1. Transportar e carregar o dispositivo em um estágio de microscópio. Configure um microscópio invertido nas configurações de imagem desejadas com todos os componentes ópticos necessários (objetiva, fonte de luz, filtros de fluorescência e um detector) para campo brilhante de alta resolução, contraste de imagem diferencial (DIC) ou imagem de fluorescência (Figura 1 Suplementar).
   2. Adquira uma única ou várias imagens de fluorescência de lapso de tempo para capturar eventos celulares e subcelulares.
   3. Adquirir imagens de fluorescência de neurônios de C. elegans em função de seu desenvolvimento usando um objetivo de abertura numérica (NA) de 60x, 1,4, um laser de comprimento de onda de 488 nm com potência de laser de 7% a 10%, uma câmera CCD, em um microscópio de disco giratório. Realize imagens de lapso de tempo usando o software fornecido com o microscópio e adquira imagens a uma velocidade de 4 quadros por segundo (Figura 1 Suplementar).
   4. Após a aquisição das imagens, libere a pressão de aprisionamento e monitore a locomoção do animal em baixas ampliações - 4x e 10x. Manter o animal restrito dentro da região definida por membranas isolantes (mantidas abaixo de 14 psi durante todo o experimento).
   5. Ajuste o volume de solução alimentar nas duas pontas da micropipeta para continuar um fluxo de alimentos lento impulsionado pela gravidade no canal de crescimento. Este fluxo de alimentos é obtido ajustando os níveis das soluções alimentares em micropipetas na entrada e na saída (tipicamente 1-5 mm de diferença de altura).
   6. Visualize o fluxo sob um campo brilhante a partir do padrão de fluxo das bactérias no canal de crescimento.
      NOTA: Na ausência de fluxo, o animal come as bactérias OP50 disponíveis, o canal parece claro e o animal passa fome durante algumas horas. Um animal faminto normalmente desenvolve alta autofluorescência, facilmente observável ao adquirir imagens de fluorescência de lapso de tempo. Tais eventos têm efeitos prejudiciais sobre a fisiologia animal e foram evitados nos experimentos.
   7. Repita as etapas 5.2.1-5.2.3 após um intervalo de tempo predeterminado para adquirir imagens de fluorescência/DIC/campo brilhante do mesmo indivíduo em vários pontos de tempo.
   8. Depois que as imagens forem adquiridas em vários pontos de tempo desejados do mesmo animal individual, libere a pressão de isolamento e aprisionamento. Lave o canal com tampão M9 e empurre o animal através do reservatório de entrada. Recupere o animal do reservatório e coloque-o em uma placa de NGM fresca para monitoramento adicional da saúde.
   9. Lave o canal com tampão M9 algumas vezes para remover as bactérias. Enxaguar o canal de fluxo com álcool etílico a 70% (diluído em água destilada). Seque os canais empurrando o ar usando uma seringa. Armazene o dispositivo em um local seco e livre de poeira para uso repetido no futuro.
3. Análise de imagens e estatísticas
   1. Use o software FIJI ImageJ para análise de imagem tiff. Abra imagens tiff das imagens de lapso de tempo PVD dos animais wdIs51 em Fiji ImageJ. Extraia os melhores planos da pilha de planos z mostrando os processos primários selecionando a guia Imagem > projeto Pilhas > Z.
   2. Filtre toda a série de imagens e encontre quadros de imagem específicos que cubram com sucesso todos os processos neuronais usando seções sobrepostas dos quadros de imagem animal. Selecione Plug-in > Analisar Contador de Células > na barra de ferramentas FIJI. Isso abrirá uma janela para numerar diferentes ramos e manter uma contagem de cada neurônio selecionado.
   3. Selecione Inicializar Contadores de > > Type1 e marque as ramificações secundárias. Em seguida, selecione Tipo 2 e marque Quaternário, clique na janela Resultados mostrando contagens de todas as ramificações (Figura 2 Suplementar). Esse método exibirá as ramificações que já estão contadas.
   4. Abra a próxima imagem sobreposta e conte as ramificações restantes. Esse processo evitará a dupla contagem e garantirá que todos os processos sejam contados. Identificar e contar o número total de ramos primários presentes nos estágios larvais iniciais de C. elegans. Realizar análises semelhantes para as imagens para processos secundários e quaternários em animais mais velhos.
      NOTA: Os adultos mostram muitos processos que inervam nos músculos da parede do corpo e podem ser difíceis de contar. Certifique-se de que cada processo seja contado apenas uma vez.
   5. Calcule a distância entre os corpos celulares PVD nos animais wdIs51 desenhando uma linha segmentada do corpo celular PVD (CB) para o PVC CB. Para animais de estágio larval 4 (L4), os corpos celulares estão distantes e não estão no mesmo quadro quando fotografados com uma objetiva de 60x.
   6. Selecione imagens sobrepostas da pilha para cobrir todo o comprimento do animal da cabeça à cauda usando a guia Imagem > projeto Pilhas > Z da ImageJ. Desenhe linhas segmentadas ao longo do processo neuronal entre os CBs PVD e PVC.
   7. Meça os comprimentos de todas as linhas segmentadas usando ImageJ > Analyze > Measure. Adicione os comprimentos de todos os segmentos para calcular a distância total entre os CBs PVD e PVC para cada ponto de tempo.
   8. Para o comprimento dos neurônios de TRNs em animais jsIs609 , carregue as imagens em Fiji. Desenhe uma linha segmentada ao longo dos microtúbulos laterais posteriores (PLMs; visível com GFP solúvel) do corpo celular até o centroide da primeira mitocôndria. Calcule o comprimento da linha para o primeiro valor de distância.
   9. Desenhe uma linha segmentada do centro da primeira para a segunda mitocôndria. Repita este processo para cada par de mitocôndrias até o final do comprimento do processo neuronal. Adicione todos os comprimentos para calcular o comprimento total do processo neuronal.
   10. Para a análise da linhagem celular, carregue todas as imagens vulvais em Fiji e extraia a melhor imagem de foco das células das imagens de lapso de tempo de vários planos z.
   11. Representar os dados como média ± erro padrão da média (EPM). Calcule a significância estatística usando ANOVA unidirecional para mais de duas amostras ou um teste t de duas amostras para um par de amostras. Denote significância pelo valor de p < 0,05 (*), valor de p < 0,005 (**) e valor de p > 0,05 (ns, não significativo).

Caracterização do dispositivo: O dispositivo de crescimento e imagem consiste em duas camadas PDMS unidas (Figura 1) usando ligação de plasma irreversível. A camada de fluxo (padrão 1) que tem 10 mm de comprimento e 40 μm ou 80 μm de altura nos permite cultivar o animal em cultura líquida (Figura 1A). A camada de aprisionamento (padrão 2) possui uma membrana de 2 mm de largura (Figura 1B) para imobilização do animal para imagens de alta resolução. A máscara para a camada de aprisionamento também cria um par de membranas de isolamento para restringir o movimento do animal dentro de uma seção do canal de fluxo entre pontos de tempo de imagem sucessivos. A membrana de aprisionamento do dispositivo é adaptada do nosso dispositivo de imagem anterior3. O dispositivo atual (Figura 1C,L) inclui a adição de uma membrana de isolamento e um aumento na largura da membrana de aprisionamento para 2 mm para a imobilização eficiente do mesmo animal em vários pontos de tempo.

Para o teste do dispositivo, foi preenchida água destilada limpa nos canais microfluídicos que conectam as membranas de aprisionamento (Figura 1D,E e Figura 3 Suplementar) e pressurizada com gás nitrogênio de 14 psi, também utilizado para aprisionamento de um animal sob uma membrana PDMS de 2 mm de espessura (Figura 1H,K,L). Um único animal foi colhido de uma placa de NGM usando uma micropipeta e carregado no canal de fluxo (Figura 1F). O canal de crescimento foi preenchido com bactérias ressuspensas em meio S (Figura 1F,G,I,J). Um fluxo constante foi mantido durante toda a duração da imagem, ajustando as alturas dos meios nas pontas da pipeta conectadas à entrada e saída do dispositivo, enquanto monitorava o animal no canal de fluxo entre as duas membranas de isolamento. A solução de OP50 recém-preparada foi preenchida nas pontas da micropipeta diariamente para garantir uma fonte de alimento saudável para o animal dentro do microcanal. Fonte de alimento fresco e material PDMS permeável a gás garantem suprimento suficiente de oxigênio dentro do microcanal30,29. O crescimento dos animais no dispositivo foi rastreado usando marcadores específicos da célula ou marcadores que mostram linhagem celular ou padrões variáveis de expressão celular durante o desenvolvimento. Os animais foram imobilizados sob a membrana de aprisionamento usando gás nitrogênio 14 psi e mantendo vermes em posição reta ao longo da parede do canal. O animal cresceu mais lentamente dentro do canal microfluídico em comparação com uma placa NGM23.

Estudo da linhagem celular usando o dispositivo de imagem de longo prazo: Para avaliar o desenvolvimento de C. elegans dentro do dispositivo microfluídico, crescemos a cepa32 do PS3239 (ZMP-1::GFP) com fornecimento constante de alimentos para rastrear o desenvolvimento da vulva em diferentes pontos de tempo de seu crescimento. ZMP-1 codifica para uma metaloprotease de zinco e se expressa na célula âncora no estágio L3, nas células vulD e vulE no estágio L4 e na vulA no dia 1 (1D) animais adultos (Figura 2A). As mudanças no padrão de expressão representam um exemplo de regulação genética temporal em que o mesmo gene é expresso em diferentes células em diferentes estágios de desenvolvimento. Para observar o desenvolvimento vulvar, o animal foi primeiro imobilizado e a região vulvar foi então fotografada através de múltiplos planos z a cada 8-10 h a partir de L3 em diante até os estágios adultos. ZMP-1::GFP é expressa em diferentes células vulvais de acordo com o estágio de desenvolvimento (Figura 2B). As imagens de fluorescência de alta resolução das células vulvares dos animais que crescem no interior do dispositivo microfluídico demonstram desenvolvimento vulvar normal e a expressão e localização da ZMP-1::GFP são semelhantes aos relatos anteriores32.

Acompanhamento do desenvolvimento de neurônios usando o crescimento a longo prazo e o dispositivo de imagem: Para demonstrar o uso do dispositivo para imagens subcelulares de um animal individual, o desenvolvimento de dois neurônios mecanossensoriais PVD e TRNs foi monitorado. A cepa NC1686 expressando wdIs51 que expressa GFP nos dois neurônios PVD foi utilizada34,36. Cada neurônio PVD apresenta arquitetura dendrítica ramificada semelhante a uma menorá, composta por processos primários (PP), secundários (SP), terciários (TP) e quaternários (QP) nos estágios de desenvolvimento L2 (14-16 h), L2 tardio (20-22 h), L3 (24-26 h) e L4 (36-42 h), respectivamente (Figura 3). O corpo celular PVD está presente posteriormente à vulva. Ele envia um axônio e dois processos dendríticos primários que dão origem a SP e TP, que por sua vez dão origem a ramos dendríticos QP que inervam os músculos da parede do corpo. Os estágios L3 e L4 tardios apresentam alta arborização37,34. Cultivamos animais NC1686 dentro do dispositivo microfluídico e os alimentamos continuamente com alimentos bacterianos. Os animais foram imobilizados durante o L2 até o estágio 1D de desenvolvimento e os neurônios PVD foram repetidamente fotografados a cada 8-12 h usando o objetivo de óleo de 60x, 1,3 NA para contar o número de ramos SP, TP e QP em três dimensões. A extensão da ramificação aumentou durante o desenvolvimento, como mostra a Figura 3B. Os números de SP e QP em diferentes estágios do desenvolvimento do verme aumentaram com a idade (Figura 4A), como já foi observado em estudos anteriores37. Os animais L2 apresentaram 10 ± 3,8 (n = 9) SPs, mas sem QP, quando medidos pelo dispositivo (Figura 4A). Colocamos C. elegans em uma gota de levamisole de 3 mM, anestésico que causa contração do músculo da parede corporal e paralisia, para minimizar os efeitos adversos no transporte de organelas, reduzindo os movimentos dos animais e causando paralisia suficiente, necessária para imagens de alta resolução 3,4. Os valores de SP (4 ± 1,6, n = 25, p = 0,15) não foram significativamente diferentes quando medidos a partir de animais em estádios semelhantes cultivados em placas de NGM e fotografados com levamisol de 3 mM em lâmina de ágar (Figura 4B). Os dados sugerem que a imobilização do dispositivo permite imagens de alta resolução de arquiteturas neuronais complexas e não afeta seu desenvolvimento. Os animais em estágio L3 têm um pequeno número de QP que aumenta em número com o desenvolvimento. Adultos 1D apresentaram 67 ± 2,8 QPs (n = 5) em animais cultivados no dispositivo. Estudos anteriores mostraram a formação, bem como uma retração dos processos de PVD durante o desenvolvimento, conhecida como auto-evitação, onde reduzem seus números de ramos38. A redução do PS às 51 h (1D) após a eclosão pode ser resultado de tais retrações. Os animais que cresceram em placas NGM e fotografados com levamisol 3 mM apresentaram uma tendência de número de ramificação semelhante para estágios comparáveis de desenvolvimento (Figura 4A,B). Além disso, a distância entre os dois corpos celulares de PVC, um presente na cauda e o segundo presente perto da vulva, aumenta à medida que se afastam em animais cultivados no dispositivo ou naqueles cultivados em placas de NGM (Figura 4C,D). Durante todo o processo de imagem, os animais permaneceram saudáveis e puderam botar ovos mesmo depois que os animais foram imobilizados sob a membrana repetidamente durante esse longo período.

Usando este dispositivo, fomos capazes de imobilizar o animal na mesma orientação e imagem do neurônio idêntico e sua arquitetura com alta resolução, mesmo com fraca expressão de GFP. Para demonstrar a utilidade de nossa tecnologia de crescimento e imobilização, o desenvolvimento dos TRNs de L3 para adulto foi fotografado usando animais jsIs609 (mec-7p::MLS::GFP). Os TRNs posteriores estão presentes no lado lateral do corpo e são denominados TMPM e PLML, que correspondem aos lados direito e esquerdo do animal. Fotografamos os mesmos animais crescendo no chip microfluídico e os imobilizamos em intervalos de 12 a 14 h. A montagem representa todo o processo neuronal do RMPL em pontos de tempo sucessivos, destacando tanto as mitocôndrias quanto o processo neuronal (Figura 5A). O comprimento total do processo neuronal foi calculado e constatou-se que aumentou com uma inclinação de 10,4 μm por h (Figura 5B). Essa taxa de aumento no comprimento do processo neuronal concorda com um relato anterior de ~10 μm/h 18,31,39,40,41. Observamos também a adição de novas mitocôndrias no processo de crescimento e a mudança na posição do ponto de ramificação sináptica em relação ao corpo celular, conforme relatado anteriormente23.

Figura 1: Um chip microfluídico simples para crescimento a longo prazo e imagem de C. elegans. (A) A camada de fluxo consiste em um canal microfluídico de 10 mm de comprimento (padrão 1) em uma fina camada PDMS. (B) A camada de aprisionamento consiste num canal de imobilização de 2 mm de espessura e num par de canais de isolamento finos na camada PDMS a granel. (C) As duas camadas PDMS são unidas juntamente com um vidro de cobertura fino para fazer o dispositivo. (D, E) Os canais de controle de aprisionamento e isolamento são preenchidos com água deionizada (DI), sob gás nitrogênio comprimido (N2). (F) C. elegans sincronizados com a idade são colhidos de placas NGM e carregados dentro da camada de fluxo do dispositivo. (G) Os alimentos são fornecidos usando duas pontas de micropipeta nos reservatórios de entrada e saída. (H) Os animais são livres para se mover dentro dos dois canais de isolamento e estão presos sob a membrana de imobilização. (I) Imagem do dispositivo de crescimento e imagem com suprimento de alimentos através de duas pontas de micropipeta. (J, K) Imagens de um C. elegans em movimento livre e imobilizado dentro do canal microfluídico. A barra de escala é de 1 mm (I) e 200 μm (J, K). (L) Esquema da seção transversal do dispositivo mostrando as alturas do canal de fluxo (FC), membrana PDMS (M) e canal de controle (CC). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Rastreando a expressão de um marcador vulvar em C. elegans se desenvolvendo dentro do dispositivo. (A) Esquema de células vulvais expressando ZMP-1::GFP em animais PS3239 durante o desenvolvimento. O sinal de GFP aparece na célula âncora no estágio L3, nas células vulD e vulE no estágio L4 e nas células vulA no estágio 1D adulto. (B) Imagens do animal PS3239 crescendo dentro do chip microfluídico e imobilizado a cada 8-10 h para capturar imagens de fluorescência da expressão de ZMP-1::GFP durante o desenvolvimento vulvar de L3, L4 e 1 dia (1D) adulto. Abreviaturas: AC = célula âncora, A = vulA, D = vulD, E = vulE. A barra de escala é de 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Imagem de wdIs51 C. elegans individuais para rastrear o desenvolvimento neuronal da DVP . (A) Esquema do crescimento de neurônios PVD e arborização dendrítica do estágio L2 a L4. O círculo verde mostra o corpo da célula PVD (CB, seta amarela). Os dendritos mostram o surgimento de processos primários (PP) em L2 tanto do lado anterior quanto posterior do CB, processos secundários (SP) durante L2 tardia, processos terciários (TP) em L3 e processos quaternários (QP) durante os estágios L4. (B) Imagens de neurônios PVD de animais crescendo dentro de um dispositivo microfluídico. (C) Imagens de neurônios PVD de animais cultivados em uma placa NGM e imobilizados com levamisol 3 mM (Lev). A barra de escala é de 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Comparação do desenvolvimento de PVD em animais cultivados em dispositivos e animais cultivados em placas de NGM. (A) O número médio de processos secundários (SP) e processos quaternários (QP) dos mesmos animais que crescem dentro do dispositivo microfluídico. Os valores são calculados em 16 h (L2), 24 h (L3), 36 h (L4 precoce), 42 h (L4 tardio) e 51 h (adulto 1D). (B) Número médio de SP e QP de um lote diferente de animais que crescem em placas de NGM e anestesiados com levamisole de 3 mM. (C) Separação média entre os dois corpos celulares neuronais PVD do mesmo animal que cresce no dispositivo microfluídico. (D) Separação média de diferentes conjuntos de animais que crescem em placas de NGM e anestesiados com levamisol de 3 mM. Dados representados como média ± MEV (n ≥ 10 para levamisol 3 mM e n ≥ 6 para animais imobilizados por dispositivo). As significâncias estatísticas são calculadas por ANOVA one-way e denotadas como p-valor < 0,05 (*), p-valor < 0,005 (**) e p-valor > 0,05 (ns). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Imagem de alta resolução de neurônios receptores de toque (TRNs) de animais que crescem dentro do dispositivo microfluídico. (A) Montagem de processos neuronais de um único animal fotografado em momentos diferentes. O corpo celular (CB, seta), o ponto de ramificação sináptica (PA, ponta de seta) e a ponta do neurônio (ponta, seta para cima) são rotulados. O processo neuronal e a posição de cada mitocôndria são rastreados manualmente usando Fiji. A barra de escala é de 10 μm. (B) Duração média do processo neuronal em diferentes pontos de tempo de imagem. Dados representados como média ± MEV (n = 8). A significância estatística é calculada usando ANOVA one-way e denotada como p-valor < 0,005 (**) e p-valor > 0,05 (ns). Uma equação de regressão é ajustada com uma inclinação de 10,4 μm de alongamento do processo neuronal por hora, R2=0,9425. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 1 Suplementar: Capturas de tela de configurações de microscópio para imagens de fluorescência de C. elegans. (A) Um painel do software de análise de imagem mostra as seções destacadas para configurar a velocidade de digitalização, o conjunto de filtros e o objetivo para imagens. (B) O software é então usado para escolher o laser de 488 nm com 7% da potência total do laser. (C) O software de análise de imagem pode pegar um único quadro de imagem ou uma série de imagens de lapso de tempo e armazená-las para análise futura. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 2 Suplementar: Capturas de tela do software FIJI mostrando as etapas de análise para contagem de ramificações PVD em animais wdIs51 . (A) Mostra a imagem PVD aberta no software Fiji ImageJ e o link para o plug-in do contador de células. (B) Janela do contador de células para inicializar o contador de uma imagem. (C) Seleção de contadores para marcar ramos que estão incluídos e para evitar a contagem múltipla. (D) Janela de resultados mostrando o número total de filiais em cada categoria. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 3 suplementar: Esquema do dispositivo de crescimento e imagem. Duas pontas de micropipeta, preenchidas com diferentes volumes de solução alimentar bacteriana (amarela), são inseridas nos punhos de entrada e saída do canal de fluxo na camada inferior. A diferença nas alturas das soluções alimentares nas pontas faz com que a solução flua dentro do canal que, por sua vez, fornece bactérias ao animal para o seu crescimento. Os canais de aprisionamento e isolamento (azul) são preenchidos com água destilada e comprimidos usando um gás nitrogênio (ajustado em 14 psi). O canal de isolamento está sempre conectado a 14 psi. A pressão sobre a membrana de aprisionamento é comutada entre 0 (o animal é livre para se mover e se alimentar) e 14 psi (o animal é imobilizado para imagens de alta resolução) usando um conector de três vias. Clique aqui para baixar este arquivo.

S.M. e S.P.K. são autores de uma patente pendente sobre o dispositivo de imagem e crescimento microfluídico (Pedido de patente número 640/CHE/2011).