Este protocolo tem como objetivo isolar mRNAs ribossomais de tradução específicos do tipo celular usando o modelo de camundongo NuTRAP.
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Artigo de método
Isole RNAs específicos do tipo celular de amostras de tecido heterogêneo congeladas sem triagem celular
Neste artigo
Resumo
Resumo
A heterogeneidade celular coloca desafios para a compreensão da função de tecidos complexos em um nível de transcriptoma. O uso de RNAs específicos do tipo celular evita possíveis armadilhas causadas pela heterogeneidade dos tecidos e desencadeia a poderosa análise do transcriptoma. O protocolo descrito aqui demonstra como usar o método Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) para isolar RNAs ligados a ribossomos de uma pequena quantidade de células que expressam EGFP em um tecido complexo sem classificação celular. Este protocolo é adequado para isolar RNAs específicos do tipo celular usando o modelo de camundongo NuTRAP recentemente disponível e também pode ser usado para isolar RNAs de quaisquer células que expressem EGFP.
Introdução
Abordagens de alto rendimento, incluindo sequenciamento de RNA (RNA-seq) e microarray, tornaram possível interrogar perfis de expressão gênica no nível de todo o genoma. Para tecidos complexos, como coração, cérebro e testículos, os dados específicos do tipo celular fornecerão mais detalhes comparando o uso de RNAs de todo o tecido 1,2,3. Para superar o impacto da heterogeneidade celular, o método Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) vem sendo desenvolvido desde o início da década de 20104. O TRAP é capaz de isolar RNAs ligados a ribossomo....
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Protocolo
Todos os experimentos em animais realizados seguiram os protocolos aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Auburn.
NOTA: O protocolo a seguir usa um testículo (cerca de 100 mg) em P28 de Gli1-CreERT2; Camundongos NuTRAP (Mus musculus). Os volumes de reagentes podem precisar ser ajustados com base nos tipos de amostras e no número de tecidos.
1. Coleta de tecidos
- Eutanasiar os ratos usando uma câmara de CO2 , higienizar a superfície do abdômen com etanol a 70%.
- Abra o abdômen inferior ....
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Resultados
O rato Gli1-CreERT2 (Jackson Lab Stock Number: 007913) foi cruzado pela primeira vez com o rato repórter NuTRAP (Jackson Lab Stock Number: 029899) para gerar ratos com dupla mutação. Camundongos portadores de ambos os alelos genéticos geneticamente modificados (ou seja, Gli1-CreERT2 e NuTRAP) foram injetados com tamoxifeno uma vez por dia, a cada dois dias, para três injeções. As amostras de tecido foram coletadas no 7º dia após o1º dia da injeção. A .......
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Discussão
A utilidade da análise do transcriptoma de todo o tecido pode ser atenuada, especialmente quando se estuda tecidos heterogêneos complexos. Como obter RNAs específicos do tipo celular torna-se uma necessidade urgente para liberar a poderosa técnica de RNA-seq. O isolamento de RNAs específicos do tipo celular geralmente depende da coleta de um tipo específico de células usando micromanipulação, classificação celular ativada por fluorescência (FACS) ou microdissecção por captura a laser (LCM)18. Outr.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Agradecimentos
Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo NIH R00HD082686. Agradecemos à Endocrine Society Summer Research Fellowship a H.S.Z. Também agradecemos ao Dr. Yuan Kang por criar e manter a colônia de ratos.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Actb | eurofins | qPCR primers | ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (primer direto / primer reverso) |
| Bioanalisador | Agilent | 2100 | |
| Mini Inibidor de Protease sem EDTA Cocktail | Millipore | 11836170001 | |
| cicloheximida | Millipore | 239764-100MG | |
| Cyp11a1 | eurofins | qPCR primers | CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (primer direto/primer reverso) |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0191 | |
| DTT, Ditiotreitol | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
| DynaMag-2 ímã | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Falcon tubes 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| GFP anticorpo | Abcam | ab290 | |
| Conjunto de moedor de vidro | DWK Life Sciences | 357542 | |
| heparina | BEANTOWN CHEMICAL | 139975-250MG | |
| em>Hsd3b | eurofins | qPCR primers | GACAGGAGCAGGAGGGTGTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (primer direto/primer reverso) |
| KCl | Biosciences | R005 | |
| MgCl2 | Biosciences | R004 | |
| Tubos de microcentrífuga 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 02-707-354 | |
| Mouse Clariom S Ensaio microarrays | Thermo Fisher Scientific | Microarray serviço | |
| NP-40 | Millipore | 492018-50 Ml | |
| oligo (dT)20 | Kit | Invitrogen 18418020 | |
| PicoPure | Thermo Fisher Scientific | KIT0204 | |
| Proteína G Dynabead | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| Células de crescimento de água sem RNase | NUPW-0500 | ||
| RNaseOUT Inibidor de ribonuclease recombinante | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | |
| Sox9 | eurofins | qPCR primers | TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (primer direto/primer reverso |
| Superscript IV transcriptase reversa | Invitrogen | 18090050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | |
| Sycp3 | eurofins | qPCR primers | GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (primário para a frente/primário para trás) |
| Tris | Alfa Aesar | J62848 |
Referências
- Yang, K. C., et al. Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support. Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).
- Soumillon, M., et al.
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Reimpressões e permissões
