Artigo de método

Espectroscopia de CD para estudar interações DNA-proteína

DOI:

10.3791/63147

⸱

10 de fevereiro de 2022

 ,  , 
1Jawaharlal Nehru University New Delhi

Neste artigo

Resumo

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A interação de um remodelador de cromatina dependente de ATP com um ligante de DNA é descrita usando espectroscopia de CD. As alterações conformais induzidas em um promotor genético analisado pelos picos gerados podem ser usadas para entender o mecanismo de regulação transcricional.

Resumo

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A espectroscopia do dicromaísmo circular (CD) é um método simples e conveniente para investigar a estrutura secundária e as interações das biomoléculas. Os recentes avanços na espectroscopia de CD permitiram o estudo das interações DNA-proteína e da dinâmica conformacional do DNA em diferentes microambientes em detalhes para uma melhor compreensão da regulação transcricional in vivo. A área ao redor de uma zona de transcrição em potencial precisa ser desenrolada para que a transcrição ocorra. Trata-se de um processo complexo que requer a coordenação de modificações de histona, vinculação do fator de transcrição ao DNA e outras atividades de remodelação da cromatina. Utilizando espectroscopia de CD, é possível estudar mudanças conformais na região promotora causadas por proteínas regulatórias, como remodeladores de cromatina dependentes de ATP, para promover a transcrição. As alterações conformais que ocorrem na proteína também podem ser monitoradas. Além disso, consultas sobre a afinidade da proteína com seu DNA alvo e especificidade de sequência podem ser abordadas incorporando mutações no DNA alvo. Em suma, a compreensão única desse método sensível e barato pode prever mudanças na dinâmica da cromatina, melhorando assim a compreensão da regulação transcricional.

Introdução

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O dichroismo circular (CD) é uma técnica espectroscópica que se baseia na quiralidade inerente das macromoléculas biológicas que leva à absorção diferencial da luz circularmente polarizada destro e canhoto. Essa absorção diferencial é conhecida como dicromaísmo circular. A técnica, portanto, pode ser utilizada para delinear a conformação de macromoléculas biológicas, como proteínas e DNA, ambas contendo centros quirais1,2.

As ondas eletromagnéticas contêm componentes elétricos e magnéticos. Tanto os campos elétricos quanto os magnéticos oscilam perpendiculares à direção da propagaçã....

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Protocolo

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1. Concentração de trabalho dos componentes de reação

  1. Prepare as concentrações de trabalho dos buffers para CD e outros componentes de reação recentemente (ver Tabela 1) e mantenha-os a 4 °C antes de configurar as reações.
    NOTA: Para as reações do CD descritas neste artigo, as concentrações de trabalho dos componentes são as seguintes: Tampão de fosfato de sódio (pH 7.0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, Proteína 1 μM, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM.

2. Atividade atpase

  1. Antes da espectroscopia do CD, estabeleça a atividade ATPase da proteína na prese....

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Resultados

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ADAAD estabiliza uma estrutura semelhante a um loop-tronco no promotor MYC
Evidências experimentais anteriores mostraram que o SMARCAL1 é um regulador negativo do MYC29. A análise da região promotora de 159 bp do gene MYC pelo mapeador QGRS mostrou que a vertente dianteira tinha o potencial de formar um G-quadruplex (Tabela 2). Mfold mostrou que ambos os fios do DNA MYC poderiam formar uma e.......

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Discussão

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O objetivo deste artigo é introduzir a técnica de espectroscopia de CD como abordagem para estudar as alterações conformais ocorridas no DNA na presença de proteínas remodeladoras de cromatina dependentes de ATP e vincular essas alterações conformais à expressão genética. A espectroscopia de CD fornece um método rápido e facilmente acessível para estudar as alterações conformais no DNA.

Um ponto crucial a ser considerado para esta técnica é a pureza do DNA e da proteína. É aconselhável.......

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Divulgações

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Os autores não têm conflito de interesses para declarar.

Agradecimentos

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Os autores gostariam de agradecer ao Advanced Instrumentation Research Facility, JNU, pelo espectrômetro do CD. V.J. e A.D. foram apoiados por uma bolsa da CSIR.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2-MercaptoetanolFisher scientificO3446I-100
Adenosina 5′-trifosfato sal dissódico hidratoSigmaaldrichA2383
CD Cubeta de quartzoSTARNA21-Q-1
Chirascan V100 CD espectrômetroFotofísica AplicadaNão disponível
EDTA Sal Dissódico DihidratadoSRL43272
Glutationa Sepharose 4BGE Healthcare17-0756-01Cromatografia de afinidade de glutationa
Hellmanex III solução de limpeza Hellma9-307-011-4-507
L-Lactic DesidrogenaseSigmaaldrich  L2625
Acetato de Magnésio TetrahidratadoFisher scientificBP215-500
Cloreto de Magnésio HexahidratadoFisher scientificM33-500
NADH sal dissódicoSigmaaldrich10107735001
Fosfoenolpiruvato Monociclohexilamônio SalSRL40083
Acetato de PotássioFisher scientificP178-3
Piruvato QuinaseSigmaaldrichP1506
Fosfato de Sódio DibásicoAnidro Fisher scientificS374-500
Fosfato de Sódio Monobásico MonohidratadoFisher scientificS369-500
Synergy HT leitor de microplacasBioTekNão disponível
Tris BaseFisher scientificBP152-500

Referências

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  1. Woody, R. W. Circular dichroism. Methods in Enzymology. 246, 34-71 (1995).
  2. Kelly, S., Price, N. The Use of Circular Dichroism in the Investigation of Protein Structure and Function. Current Protein & Peptide Science. 1 (4), 349-384 (2000).
  3. Rodg....

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Etiquetas

CD SpectroscopyDNA Protein InteractionsCircular DichroismChromatin RemodelingTranscription RegulationATPase ActivityG Quadruplex DNAPromoter RegionSecondary StructureOligonucleotide Structure

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