A interação de um remodelador de cromatina dependente de ATP com um ligante de DNA é descrita usando espectroscopia de CD. As alterações conformais induzidas em um promotor genético analisado pelos picos gerados podem ser usadas para entender o mecanismo de regulação transcricional.
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Artigo de método
Espectroscopia de CD para estudar interações DNA-proteína
Neste artigo
Resumo
Resumo
A espectroscopia do dicromaísmo circular (CD) é um método simples e conveniente para investigar a estrutura secundária e as interações das biomoléculas. Os recentes avanços na espectroscopia de CD permitiram o estudo das interações DNA-proteína e da dinâmica conformacional do DNA em diferentes microambientes em detalhes para uma melhor compreensão da regulação transcricional in vivo. A área ao redor de uma zona de transcrição em potencial precisa ser desenrolada para que a transcrição ocorra. Trata-se de um processo complexo que requer a coordenação de modificações de histona, vinculação do fator de transcrição ao DNA e outras atividades de remodelação da cromatina. Utilizando espectroscopia de CD, é possível estudar mudanças conformais na região promotora causadas por proteínas regulatórias, como remodeladores de cromatina dependentes de ATP, para promover a transcrição. As alterações conformais que ocorrem na proteína também podem ser monitoradas. Além disso, consultas sobre a afinidade da proteína com seu DNA alvo e especificidade de sequência podem ser abordadas incorporando mutações no DNA alvo. Em suma, a compreensão única desse método sensível e barato pode prever mudanças na dinâmica da cromatina, melhorando assim a compreensão da regulação transcricional.
Introdução
O dichroismo circular (CD) é uma técnica espectroscópica que se baseia na quiralidade inerente das macromoléculas biológicas que leva à absorção diferencial da luz circularmente polarizada destro e canhoto. Essa absorção diferencial é conhecida como dicromaísmo circular. A técnica, portanto, pode ser utilizada para delinear a conformação de macromoléculas biológicas, como proteínas e DNA, ambas contendo centros quirais1,2.
As ondas eletromagnéticas contêm componentes elétricos e magnéticos. Tanto os campos elétricos quanto os magnéticos oscilam perpendiculares à direção da propagaçã....
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Protocolo
1. Concentração de trabalho dos componentes de reação
- Prepare as concentrações de trabalho dos buffers para CD e outros componentes de reação recentemente (ver Tabela 1) e mantenha-os a 4 °C antes de configurar as reações.
NOTA: Para as reações do CD descritas neste artigo, as concentrações de trabalho dos componentes são as seguintes: Tampão de fosfato de sódio (pH 7.0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, Proteína 1 μM, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM.
2. Atividade atpase
- Antes da espectroscopia do CD, estabeleça a atividade ATPase da proteína na prese....
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Resultados
ADAAD estabiliza uma estrutura semelhante a um loop-tronco no promotor MYC
Evidências experimentais anteriores mostraram que o SMARCAL1 é um regulador negativo do MYC29. A análise da região promotora de 159 bp do gene MYC pelo mapeador QGRS mostrou que a vertente dianteira tinha o potencial de formar um G-quadruplex (Tabela 2). Mfold mostrou que ambos os fios do DNA MYC poderiam formar uma e.......
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Discussão
O objetivo deste artigo é introduzir a técnica de espectroscopia de CD como abordagem para estudar as alterações conformais ocorridas no DNA na presença de proteínas remodeladoras de cromatina dependentes de ATP e vincular essas alterações conformais à expressão genética. A espectroscopia de CD fornece um método rápido e facilmente acessível para estudar as alterações conformais no DNA.
Um ponto crucial a ser considerado para esta técnica é a pureza do DNA e da proteína. É aconselhável.......
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Divulgações
Os autores não têm conflito de interesses para declarar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer ao Advanced Instrumentation Research Facility, JNU, pelo espectrômetro do CD. V.J. e A.D. foram apoiados por uma bolsa da CSIR.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 2-Mercaptoetanol | Fisher scientific | O3446I-100 | |
| Adenosina 5′-trifosfato sal dissódico hidrato | Sigmaaldrich | A2383 | |
| CD Cubeta de quartzo | STARNA | 21-Q-1 | |
| Chirascan V100 CD espectrômetro | Fotofísica Aplicada | Não disponível | |
| EDTA Sal Dissódico Dihidratado | SRL | 43272 | |
| Glutationa Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0756-01 | Cromatografia de afinidade de glutationa |
| Hellmanex III solução de limpeza Hellma | 9-307-011-4-507 | ||
| L-Lactic Desidrogenase | Sigmaaldrich | L2625 | |
| Acetato de Magnésio Tetrahidratado | Fisher scientific | BP215-500 | |
| Cloreto de Magnésio Hexahidratado | Fisher scientific | M33-500 | |
| NADH sal dissódico | Sigmaaldrich | 10107735001 | |
| Fosfoenolpiruvato Monociclohexilamônio Sal | SRL | 40083 | |
| Acetato de Potássio | Fisher scientific | P178-3 | |
| Piruvato Quinase | Sigmaaldrich | P1506 | |
| Fosfato de Sódio Dibásico | Anidro Fisher scientific | S374-500 | |
| Fosfato de Sódio Monobásico Monohidratado | Fisher scientific | S369-500 | |
| Synergy HT leitor de microplacas | BioTek | Não disponível | |
| Tris Base | Fisher scientific | BP152-500 |
Referências
- Woody, R. W. Circular dichroism. Methods in Enzymology. 246, 34-71 (1995).
- Kelly, S., Price, N. The Use of Circular Dichroism in the Investigation of Protein Structure and Function. Current Protein & Peptide Science. 1 (4), 349-384 (2000).
- Rodg....
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Reimpressões e permissões
