Este protocolo descreve o fluxo de trabalho para obter macrófagos derivados de monócitos (MDM) a partir de amostras de sangue humano, um método simples para introduzir eficientemente os repórteres de complementação de fluorescência bimolecular inflamatória (BiFC) em MDM humano sem comprometer a viabilidade e o comportamento celular, e uma abordagem baseada em imagens para medir a ativação inflamatória de caspase em células vivas.
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Artigo de método
Visualização de Caspases Inflamatórias Induzidas proximidade em macrófagos derivados de monócitos humanos
Neste artigo
Resumo
Resumo
As caspases inflamatórias incluem caspase-1, -4, -5, -11 e -12 e pertencem ao subgrupo de caspases iniciadores. O Caspase-1 é necessário para garantir a correta regulação da sinalização inflamatória e é ativado pela dimerização induzida pela proximidade após o recrutamento para inflamações. Caspase-1 é abundante na linhagem celular monocítica e induz a maturação das citocinas pró-inflamatórias interleucina (IL)-1β e IL-18 a moléculas secretas ativas. As outras caspases inflamatórias, caspase-4 e -5 (e seu caspase-11 homólogo murino) promovem a liberação de IL-1β induzindo a piroptose. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) é uma ferramenta usada para medir a proximidade induzida por caspase inflamatória como uma leitura da ativação do caspase. O caspase-1, -4, ou -5 prodomínio, que contém a região que se liga ao inflamatório, é fundido a fragmentos não fluorescentes da proteína fluorescente amarela Vênus (Venus-N [VN] ou Venus-C [VC]) que associam a reforma do complexo fluorescente de Vênus quando as caspas sofrem proximidade induzida. Este protocolo descreve como introduzir esses repórteres em macrófagos derivados do monócito humano primário (MDM) usando nucleofeipulsão, tratar as células para induzir ativação inflamatória de caspase e medir a ativação de caspase usando fluorescência e microscopia confocal. A vantagem dessa abordagem é que ela pode ser usada para identificar os componentes, requisitos e localização do complexo de ativação inflamatória de caspase em células vivas. No entanto, controles cuidadosos precisam ser considerados para evitar comprometer a viabilidade e o comportamento celular. Esta técnica é uma poderosa ferramenta para a análise de interações dinâmicas de caspase no nível inflamatório, bem como para o interrogatório das cascatas inflamatórias de sinalização em MDM vivos e monócitos derivados de amostras de sangue humano.
Introdução
As caspases são uma família de proteases de cisteína aspartate que podem ser agrupadas em caspases iniciadores e caspases carrascos. As caspases carrascos compreendem caspase-3, -6 e -7. Eles são naturalmente encontrados em células como dimers e são cortados pelas caspases iniciadores para executar apoptose1. As caspases iniciais incluem caspase humana-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 e -12. Eles são encontrados como zymogens inativos (pro-caspases) que são ativados pela dimerização induzida pela proximidade e estabilizados pelo decote auto-proteolítico 2,3. As caspases inflamatórias são um s....
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Protocolo
Este protocolo segue as diretrizes do comitê de ética em pesquisa humana da Baylor College of Medicine para a manipulação de amostras humanas. As amostras de sangue são tratadas seguindo as diretrizes institucionais de segurança para amostras humanas. As amostras de sangue são obtidas em um banco de sangue regional, onde são coletadas com solução de fosfato dextrose citrato (CPD). No entanto, o sangue coletado com outros anticoagulantes como heparina de sódio, heparina de lítio ou EDTA também pode ser usado para este protocolo28,29.
1. Isolamento dos monócitos humanos e difere....
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Resultados
O esquema mostrado na Figura 2 dá uma visão geral de como obter, transfetar e imagem humana MDM. Após a incubação dos monócitos CD14+ selecionados com GM-CSF por 7 dias, a morfologia celular muda ao longo do período de diferenciação (Figura 3A), passando de células de suspensão esféricas para spindly e totalmente anexadas (dias 3 e 4), e, por último, para células mais difundidas quando totalmente diferenciadas (dia 7). As células totalmente diferenciadas são en.......
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Discussão
Este protocolo descreve o fluxo de trabalho para obter macrófagos de monócitos isolados de amostras de sangue humano e um método para introduzir eficientemente os repórteres de Caspase Inflamatório BiFC em MDM humano sem comprometer a viabilidade e o comportamento celular.
Este protocolo aproveita a técnica BiFC35 para marcar as caspases inflamatórias no domínio de recrutamento caspase (CARD) com fragmentos não fluorescentes da proteína fluorescente dividida Vênus. Casp.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Agradecemos aos membros do laboratório passado e presente da LBH que contribuíram para o desenvolvimento dessa técnica. Este laboratório é suportado por NIH/NIDDK T32DK060445 (BEB), NIH/NIDDK F32DK121479 (BEB), NIH/NIGMS R01GM121389 (LBH). A Figura 2 foi desenhada usando o software Biorender.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placas de cultura de tecidos de 48 poços2:34 | Genesee Scientific | 25-108 | |
| Placas de cultura de tecidos de 10 cm | VWR | 25382-166 | |
| 2 Mercaptoetanol 1000x | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| 8 lamínulas com 1,5 HP | Cellvis | c8-1.5H-N | |
| AutoMACS colunas | Miltenyi (Biotec) | 130-021-101 | Para separação automatizada usando apenas o separador AutoMACS Pro |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi (Biotec) | 130-092-545 | Para separação automatizada usando apenas o separador AutoMACS Pro |
| Solução de lavagem AutoMACS Pro | Miltenyi (Biotec) | 130-092-987 | Para separação automatizada usando apenas o separador AutoMACS Pro |
| de enxágue AutoMACS | Miltenyi (Biotec) | 130-091-222 | Para separação automatizada usando apenas o AutoMACS Pro Separator |
| AutoMacs executando o buffer | Miltenyi (Biotec) | 130-091-221 | Para separação manual ou automatizada usando QuadroMACS ou AutoMACS pro Separator |
| Axio Observer Z1 microscópio invertido motorizado equipado com uma unidade de disco giratório CSU-X1A 5000 | Zeiss | Qualquer microscópio confocal equipado com um módulo laser equipado com linhas de laser de comprimentos de onda de 568 nm (RFP) e 488 ou 512 nm (GFP ou YFP) pode ser usado | |
| AxioObserver A1, Microscópio Invertido de Grau de Pesquisa | Zeiss | Qualquer microscópio de epifluorescência com filtros de fluorescência capazes de excitar comprimentos de onda de 568 nm (RFP) e 488 ou 512 nm (GFP ou YFP) pode ser usado | |
| CD14+ MICROBEADS | Miltenyi (Biotec) | 130-050-201 | Para separação manual ou automatizada usando QuadroMACS ou AutoMACS pro Separador |
| DPBS sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio | Sigma | D8537-6x500ML | |
| DsRed plasmídeo mito | Clontech | 632421 | Plasmídeos semelhantes que podem ser usados como repórteres fluorescentes podem ser encontrados no Addgene |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10437028 | |
| Ficoll-Paque PLUS 6 x 100 mL | Sigma | GE17-1440-02 | |
| Suplemento GlutaMAX (100x) | Thermo Fisher Scientific | 35050079 | |
| GM-CSF | Thermo Fisher Scientific | PHC2011 | |
| Hemin BioXtra, de Porcine, ≥ 96,0% (HPLC) | Sigma | 51280-1G | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
| Caspase inflamatória plasmídeos | Disponível mediante solicitação do laboratório | ||
| LBH LPS-EB Ultrapure | Invivogen | TLRL-3PELPS | |
| LS Colunas | Miltenyi (Biotec) | 130-042-401 | Para separação manual usando apenas o separador QuadroMACS |
| MACS 15 mL Tube Rack | Miltenyi (Biotec) | 130-091-052 | Para separação manual usando apenas o separador QuadroMACS |
| MACS MultiStand | Miltenyi (Biotec) | 130-042-303 | Para separação manual usando apenas o separador QuadroMACS |
| plasmídeo mCherry | Yungpeng Wang Lab | Plasmídeos semelhantes que podem ser usados como repórteres fluorescentes podem ser encontrados no | |
| Addgene Neon Transfection System | Thermo Fisher Scientific | MPK5000 | Inclui dispositivo de eletroporação de néon, pipeta e estação de pipeta |
| Sistema de transfecção de néon 10 µ Kit L | Thermo Fisher Scientific | MPK1096 | Inclui amortecedor de ressuspensão R, amortecedor de ressuspensão T, amortecedor eletrolítico E, 96 x 10 µ L Pontas de néon e tubos de eletroporação de néon |
| Sal de sódio de nigericina, solução pronta | Sigma | SML1779-1ML | |
| Penicilina-Estreptomicina (10.000 U / mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Bromidrato de poli-D-lisina | Sigma | P7280-5mg | |
| QuadroMACS Separador | Miltenyi (Biotec) | 130-090-976 | Para separação manual usando QuadroMACS Separador apenas |
| qVD-OPh | Fisher (ApexBio) | 50-101-3172 | |
| RPMI 1640 Médio | Thermo Fisher Scientific | 11875119 | |
| Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenol | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | |
| UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0 | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
| Zeiss Zen 2.6 (edição azul) software | Zeiss | Qualquer software usado para operar o microscópio confocal de sua escolha |
Referências
- Boatright, K. M., et al. A unified model for apical caspase activation. Molecular Cell. 11 (2), 529-541 (2003).
- Pop, C., Salvesen, G. S. Human caspases: activation, specificity, and regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2....
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Reimpressões e permissões
