Sistema de cultura de órgãos para avaliação da toxicidade de excipientes e produtos farmacêuticos para tratamento intraocular

Resumo

O objetivo deste protocolo é avaliar as alterações na atividade metabólica e na função refrativa do cristalino em resposta ao tratamento experimental.

Resumo

Como a principal causa de cegueira, a catarata é um fardo significativo para as dezenas de milhões de pessoas afetadas globalmente por essa condição. A exposição a produtos químicos, entre outros fatores ambientais, é uma causa estabelecida de catarata. Os testes de toxicidade ocular podem avaliar se os produtos farmacêuticos e seus componentes podem contribuir para danos ao cristalino que podem levar à catarata ou auxiliar no tratamento da catarata.

Estudos in vitro e testes in vivo em animais podem ser usados para avaliar a segurança de produtos químicos antes de estudos clínicos. O teste de Draize - o padrão atual in vivo para testes de toxicidade ocular e irritação - foi criticado por falta de sensibilidade e medições objetivas para determinar a toxicidade ocular. Os ensaios in vitro baseados em células são limitados, pois as culturas de células não podem modelar adequadamente uma lente funcional intacta.

O método aqui descrito é uma alternativa in vitro sensível aos ensaios em animais, concebida para avaliar a resposta do cristalino bovino intacto ao tratamento, tanto ao nível da actividade celular como ao desempenho refractivo global. O reagente não tóxico resazurina é metabolizado proporcionalmente ao nível de atividade celular. O ensaio de scanner a laser de lente mede a capacidade da lente de refratar feixes de luz incidentes em um único ponto com erro mínimo, diretamente relevante para sua função natural. O método pode ser usado para determinar alterações agudas e tardias na lente, bem como a recuperação da lente de exposições químicas ou ambientais.

Introdução

Afetando mais de 20 milhões de pessoas, a catarata é a causa mais prevalente de cegueira em todo o mundo ^1,2. A catarata é mais comumente causada por alterações relacionadas à idade no cristalino, mas também é induzida por trauma, condições genéticas, doenças ou exposições tóxicas². Atualmente, o tratamento envolve intervenção cirúrgica para substituição do cristalino, um procedimento caro e invasivo acessível principalmente para quem está em países desenvolvidos. A extensa carga da catarata direcionou décadas de pesquisa para a prevenção da catarata e ....

Protocolo

Todos os protocolos experimentais foram realizados em conformidade com as políticas de ética da Universidade de Waterloo para pesquisa usando tecido animal. Os olhos bovinos para o presente estudo foram fornecidos em abatedouro, obtidos de vacas não leiteiras poucas horas após a morte, e foram dissecados imediatamente, um processo que leva até 8 h para obter os olhos. Os olhos devem ser dissecados imediatamente para preservar a esterilidade e a qualidade da dissecção. O meio de cultura é preparado para um pH de 7,4 e filtrado estéril antes da suplementação com FBS²¹. Todos os procedimentos são realizados em con....

Resultados

A Figura 2 e a Figura 3 (n = 6) demonstram os resultados de um estudo que testou o efeito do tratamento químico (lanosterol) no cristalino bovino. O lanosterol é um esterol natural no cristalino que já mostrou resultados promissores como uma potencial intervenção farmacêutica para catarata²⁵, embora isso ainda não tenha sido comprovado²⁶. O desenho do estudo incluiu um controle de meio e veículo para o composto. Nã.......

Discussão

O objetivo deste protocolo é avaliar diretamente os efeitos de produtos químicos ou exposições ambientais no cristalino em cultura de tecidos primários. Primeiro, as lentes são dissecadas e digitalizadas quanto à qualidade óptica. A prevenção da contaminação e a garantia da qualidade da dissecação são críticas. As lentes são escaneadas em intervalos periódicos para monitorar continuamente as mudanças na função de refração em relação ao grupo de controle ou condição de pré-exposição. O en.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
(2-Hidroxipropil)-β-ciclodextrina	Sigma-Aldrich	H107	Pó
Sistema de filtragem de topo de garrafa de 1 L	VWR	97066-204	Montagem completa, tampa de garrafa, 0,2 μ m
Placa de Petri de 100 mm	VWR	89022-320	Deslizável, estilo economia de mídia, placa de
12 poços	Corning 353043	Petri	estéril, de fundo transparente
	VWR	25373-041	Placas de Petri descartáveis Falcon, estéreis, placa
de 96 poços	Corning VWR	29442-072	Estéril, azul
(resazurina)	Fischer Scientific	DAL1100	Molecular Probes reagente de viabilidade celular
Solução de cloreto de benzalcônio	Sigma-Aldrich	63249	50% em H20
			biossegurança
Leitor de placas Cytation 5	BioTek	CYT5MPV	Leitor multimodo de imagem celular
Soro bovino fetal	ThermoFischer Scientific	12484028	Qualificado, inativado por calor, Canadá
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Para cultura de células, pó
Incubadora
Lanosterol	Sigma-Aldrich	L5768	≥ 93%, pó
L-glutamina	Sigma-Aldrich		Para cultura de células, pó
Médio (M-199)	Sigma-Aldrich	M3769	Modificado, com Earle′ sais, sem L-glutamina, bicarbonato de sódio e vermelho de fenol, pó, adequado para cultura de células
Pipetas			5 3/4'', com e sem algodão
Penicilina-estreptomicina	ThermoFischer Scientific	15140122	Líquido (10.000 U/mL)
Tampão fospato salino (PBS)			líquido, estéril, adequado para cultura
de célulasPonteiras de pipeta (100 µ L, 1.000 µ L, 5.000 µ L)	VWR		Sterile
ScanTox (scanner-laser de lentes)	N/A especialmente desenvolvido internamente		Digitaliza a lente com um laser para determinar a qualidade óptica da lente
Câmara de cultura ScanTox	Especialmente desenvolvida internamente	/A	Mantém a lente bovina no lugar durante o teste e a cultura
Bicarbonato de sódio	Sigma-Aldrich	S5761	Para cultura de células, pó
Hidróxido de sódio	Sigma-Aldrich	S2770	1.0 N, BioReagent, adequado para cultura de células

estéril Placa de de 35 mm Alamar de fundo transparente Gabinete de Pasteur N