Artigo de método

Ensaio de membros recombinantes de frango para entender morfogênese, padronização e primeiros passos na diferenciação celular

DOI:

10.3791/63183

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12 de janeiro de 2022

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1Departamento de Medicina Genómica y Toxicología Ambiental, Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, 2Departamento de Anatomía y Biología Celular and IDIVAL, Facultad de Medicina, Universidad de Cantabria

Neste artigo

Resumo

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Membros recombinantes são um poderoso modelo experimental que permite estudar o processo de diferenciação celular e a geração de padrões sob a influência de sinais embrionários. Este protocolo apresenta um método detalhado para a geração de membros recombinantes com células mesodérmicas de membros de frango, adaptáveis a outros tipos celulares obtidos de diferentes organismos.

Resumo

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A diferenciação celular é o processo afinado de comprometimento celular que leva à formação de diferentes tipos de células especializadas durante o estabelecimento de tecidos e órgãos em desenvolvimento. Esse processo é mantido ativamente na idade adulta. A diferenciação celular é um processo contínuo durante o desenvolvimento e homeostase dos órgãos. Entender os primeiros passos da diferenciação celular é essencial para conhecer outros processos complexos, como a morfogênese. Assim, os membros de frango recombinantes são um modelo experimental que permite o estudo da diferenciação celular e geração de padrões sob sinais de padronização embrionária. Este modelo experimental imita um ambiente in vivo ; ele monta células reaggregadas em uma cobertura ectodérmica obtida a partir de um broto de membro inicial. Posteriormente, os ectodermes são transferidos e implantados em um receptor de embrião de filhotes para permitir seu desenvolvimento. Este ensaio foi usado principalmente para avaliar células mesodérmicas de botões de membros; no entanto, pode ser aplicado a outras células-tronco ou progenitoras de outros organismos.

Introdução

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O membro vertebrado é um modelo formidável para estudar diferenciação celular, proliferação celular, morte celular, formação de padrões e morfogênese 1,2. Durante o desenvolvimento, os membros emergem como protuberâncias das células derivadas do mesoderme de placa lateral1. Os botões de membros consistem em um núcleo central de células mesodérmicas cobertas por um ectoderme. A partir desta estrutura inicial, um membro inteiro e bem formado emerge. Após a êxito do membro, três eixos são reconhecidos: (1) o eixo proximo-distal ([PD] ombro a dedos), (2) o eixo dorso-ventral ([DV] da parte ....

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Protocolo

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Esta pesquisa foi revisada e aprovada pelo Conselho de Revisão Institucional para o Cuidado e Uso de Animais laboratoriais do Instituto de Investigaciones Biomédicas da Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Cidade do México, México). Um fluxograma esquemático das etapas gerais deste protocolo é mostrado na Figura 1A.

1. Incubação de embriões e determinação da viabilidade

  1. Incubar ovos de galinha fertilizados a 38 °C e 60% de umidade relativa por cerca de três dias e meio até atingirem a etapa de 22 HH (de acordo com Hamilton e Hamburger, 1951)16.
    NOT....

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Resultados

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Reconhecendo um membro recombinante bem executado
Após o enxerto, os embriões manipulados foram devolvidos à incubadora para permitir que a RL se desenvolvesse. O tempo de incubação correlaciona-se com os requisitos do experimento. No entanto, a RL pode ser facilmente distinguida após 12 horas de implantação. Para determinar se a implantação era adequada, a RL foi observada como uma protuberância que estava firmemente presa à parede mesodérmica do embrião doador (Figura 2A

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Discussão

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Em geral, o protocolo RL pode ser dividido em cinco etapas: (1) incubação de embriões, (2) obtenção de células mesodérmicas de membros para preencher os ectodermes, (3) obtenção dos ectodermes, (4) a montagem de células mesodérmicas dentro das capas ectodérmicas e (5) transplantes dos ectoderms preenchidos nos embriões hospedeiros. A maior limitação da técnica RL é o protocolo longo e detalhado, que tem muitos pontos críticos que requerem paciência para executar adequadamente. Para completar com sucesso o protocolo, mome.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Agradecemos a Estefania Garay-Pacheco pelas imagens da Figura 2 e de Maria Valeria Chimal-Montes de Oca pela obra de arte. Este trabalho foi apoiado pela Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [números de subvenção IN211117 e IN213314] e Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [concessão número 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] concedida ao JC-M. JC M-L foi o beneficiário de uma bolsa de pós-doutorado do Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Alcian Blue 8GXSigmaA5268
Faca de fenda angularAlcon2,75 mm DB
Pinça sem corteFerramentas de Belas Ciências11052-10
Colagenase tipo IVGibco1704-019
DMEM-HGSigmaD5796
Incubadorade ovos Incumatic de MéxicoIncumatic 1000
Fetal bovinogibco16000069
fino fórceps cirúrgicofine science tools9115-10
hanks equilibrado solução salinasigmah6648
microcentrífugaeppendorf5417r
micropipetana na
na fio de paládiogoodfellow7440 05-3
Placa de PetriNest705001
PippettecrmglobePF1016
EstereomicroscópioZeissStemi DV4
FitaNANA
Tripsina suínaMerck9002-7
Agulha de tungstênioGoodFellowE74-15096/01
soro

Referências

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  1. Malashichev, Y., Christ, B., Pröls, F. Avian pelvis originates from lateral plate mesoderm and its development requires signals from both ectoderm and paraxial mesoderm. Cell and Tissue Research. 331 (3), 595-604 (2008).
  2. Mahmood, R., et al.

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