Este protocolo descreve um modelo animal composto com exposição a material particulado (PM) que agrava a isquemia miocárdica com aterosclerose.
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Artigo de método
Agravamento da Isquemia do Miocárdio sobre exposição de matéria particulada no modelo animal de aterosclerose
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os problemas de saúde causados pela poluição do ar (especialmente a poluição das partículas) estão recebendo cada vez mais atenção, especialmente entre pacientes com doenças cardiovasculares, o que agrava transtornos complicados e causa mau prognóstico. O modelo simples de isquemia miocárdica (MI) ou material particulado (PM) é inadequado para tais estudos de doenças com múltiplas causas. Aqui, foi descrito um método para a construção de um modelo composto que combina exposição à PM, aterosclerose e isquemia do miocárdio. Os camundongos apoE-/− foram alimentados com uma dieta rica em gordura por 16 semanas para desenvolver aterosclerose, a instilação traqueal da suspensão padrão pm foi realizada para simular a exposição pulmonar da PM, e a artéria coronária descendente anterior esquerda foi ligalada uma semana após a última exposição. A instilação traqueal da PM pode simular exposição pulmonar aguda, reduzindo significativamente o custo do experimento; a clássica ligatração da artéria descendente anterior com intubação traqueal não invasiva e um novo dispositivo de expansão auxiliar podem garantir a taxa de sobrevivência do animal e reduzir a dificuldade da operação. Este modelo animal pode simular razoavelmente as alterações patológicas do infarto do miocárdio agravado pela poluição do ar e fornecer referência para a construção de modelos animais relacionados a estudos envolvendo doenças com múltiplas causas.
Introdução
A poluição do ar tem sido associada à alta mortalidade por todas as causas e contribuiu com uma carga significativa da doença mais do que a soma da poluição da água, poluição do solo e exposição ocupacional1. Um relatório da OMS revelou que a poluição atmosférica ao ar livre causou 4,2 milhões de mortes prematuras em ambas as cidades e áreas rurais em todo o mundo em 20162. 91% das pessoas em todo o mundo vivem em locais onde a qualidade do ar excede os limitesde diretrizes da OMS 2. Além disso, a matéria particulada fina (PM) (≤2,5 μm de diâmetro, PM2,5) é reconhecida como a ameaça mais significativa de poluição do ar à saúde pública global3, especialmente para as pessoas que vivem em cidades de países de baixa renda e de renda média.
Os efeitos adversos da poluição do ar sobre doenças cardiovasculares merecem mais atenção. Estudos anteriores mostraram que a PM leva a um aumento do risco de doenças cardiovasculares (DCV)4. A exposição a altas concentrações de partículas ultrafinas por várias horas pode levar ao aumento da mortalidade por infarto do miocárdio. Para pessoas com histórico de infarto do miocárdio, a exposição a partículas ultrafinas pode aumentar significativamente o risco de recidiva5. Além disso, geralmente é aceito que a exposição à PM acelera a progressão da aterosclerose6.
Para a pesquisa médica, é crucial selecionar um modelo animal adequado. Modelos animais de aterosclerose simples7, isquemia miocárdica modelosanimais 8, e modelos animais de exposição PM9 já existem. O camundongo ApoE−/− (apolipoproteína E nocauteada) é um modelo tradicional de camundongos usado em estudos de aterosclerose. A capacidade de limpar lipoproteínas plasmáticas em camundongos ApoE−/− é severamente prejudicada. A alimentação alimentar com alto teor de gordura causaria aterosclerose grave, assemelhando-se à dependência dietética de doenças cardíacas ateroscleróticas observadas em humanos7. A ligadura da artéria coronária descendente anterior esquerda (LAD) é um método clássico para induzir o evento isquêmico 8,10. A infusão traqueal tem sido usada em muitas pesquisas e se destaca dos modelos de exposição11,12 por causa de sua melhor simulação e menor custo.
No entanto, modelos animais de doença única têm limitações significativas na pesquisa científica. A isquemia miocárdica induzida apenas pela ligadura LAD não é simulada na situação real. No estado natural, a isquemia do miocárdio é geralmente causada pela ruptura da placa e artérias coronárias bloqueadas13. Pacientes com cardiomiopatia isquêmica geralmente têm lesões básicas ateroscleróticas13. Há também metabolismo lipídico anormal e reações inflamatórias no corpo14. Portanto, a isquemia causada por fatores físicos ou em condições naturais tem diferentes manifestações patológicas. Estudos existentes têm demonstrado que o infarto e inflamação em modelos de isquemia miocárdica com aterosclerose são mais graves15,16. A exposição da PM pode agravar ainda mais a aterosclerose e isquemia do miocárdio, induzindo inflamação e estresse oxidativo1. Três fatores geralmente coexistem no estado natural, de modo que a situação real poderia ser melhor simulada usando um modelo composto.
Este protocolo descreve o desenvolvimento de um modelo animal de isquemia miocárdica (MI) combinando aterosclerose (AS) e exposição aguda de PM. Os camundongos apoE−/− foram alimentados com uma dieta rica em gordura para induzir aterosclerose. A exposição pulmonar da PM foi imitada pela suspensão da PM pingando através da traqueia. A ligadura do LAD em camundongos foi usada para induzir isquemia miocárdica. Esses métodos foram combinados e otimizados para simular melhor o estado da doença e melhorar a taxa de sobrevivência dos animais. Nenhuma grande unidade de exposição ou máquina de anestesia a gás é necessária, facilitando o desempenho do experimento. Este modelo pode ser usado para estudar o impacto da exposição da PM na poluição do ar na aterosclerose e cardiomiopatia isquêmica e realizar pesquisas sobre novos fármacos desenvolvidos para tratar doenças com fatores tão complexos.
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Protocolo
Todas as atividades animais descritas aqui foram aprovadas pelo Comitê de Ética Animal do Instituto de MateriaMedim Chinês, Academia chinesa de Ciências Médicas Chinesas. Foram utilizados para o estudo camundongos machos ApoE−/− (C57BL/6 de 6 a 8 semanas de idade).
1. Preparação experimental
- Preparar anestésicos tribromoetanol (15 mg/mL): dissolver 0,75 g de tribromoetanol em 1 mL de álcool tert-amilo (ver Tabela de Materiais). Após a dissolução completa, dilui-o a 50 mL com soro fisiológico estéril. Armazene a solução a 4 °C em um recipiente estéril e evite a exposição à luz.
NOTA: Neste protocolo, o tribromoetanol foi utilizado devido ao tempo ideal de recuperação da anestesia e à taxa de sobrevivência dos animais. Siga as recomendações do comitê de ética animal local ao selecionar o regime de anestesia. - Prepare a suspensão pm: medir 5 mg de DPM (material particulado diesel, ver Tabela de Materiais) em tubos de centrífugas de 10 mL. Adicione 5 mL de soro fisiológico normal e vire o tubo de cabeça para baixo para misturar bem. Use filme de parafina para selar o tubo e, em seguida, colocá-lo em limpador ultrassônico por 2-3 h (40KHz, 80w) para quebra ultrassônica.
NOTA: A suspensão deve ser homogênea e livre de partículas aglomeradas. Agite bem antes de usar.
2. Indução de aterosclerose em camundongos
- Alimente os camundongos com uma dieta rica em gordura (pó de gema de ovo 10%, banha 10%, esterol 1%, alimentação de manutenção 79%, ver Tabela de Materiais) por 12 semanas.
- Para estimar o progresso da aterosclerose, selecione 2-3 camundongos aleatoriamente e verifique se há uma placa no arco aórtico por ultrassom ou observação anatômica direta17.
NOTA: Para observação anatômica, os animais foram selecionados por amostragem aleatória e eutanásia após anestesia. Em seguida, sua cavidade torácica foi aberta, e os vasos sanguíneos foram diretamente visualizados. A observação anatômica é geralmente mais confiável porque a imagem de ultrassom pode não detectar todas as placas. - Uma vez que a aterosclerose tenha julgado formada, prepare os ratos para o próximo passo.
3. Intubação orotraqueal e exposição aguda de material particulado
NOTA: A PM será exposta uma vez por semana durante 4 semanas após 12 semanas de alimentação rica em gordura e continuamente dada uma dieta rica em gordura.
- Prepare uma placa de dissecção (ver Tabela de Materiais) com um elástico que garante 1,5 cm da borda superior. Fixar a placa de dissecção em um ângulo de 60° do plano de mesa.
- Anestesiar o camundongo usando anestésico de tribromoetanol por injeção intraperitoneal (0,1 mL para cada 10 g de peso corporal). Depois de 2-3 min, gire o mouse para verificar se há um reflexo de direita. Faça uma beliscão no dedo do dedo do dedo para confirmar a sedação. Solte lubrificação estéril nos olhos.
- Desinfete a placa de dissecção com lenços umedecidos.
- Coloque o rato anestesiado em uma posição supina na placa e conecte os incisivos superiores ao elástico.
- Use um pequeno holofote LED (ver Tabela de Materiais) com um tubo flexível. Concentre a luz na traqueia, que fica perto do ponto médio da linha axilar.
- Coloque um pequeno cotonete estéril na boca do rato, depois role o cotonete para colocar a língua para fora.
- Segure a língua e puxe-a suavemente para cima para fazer a cavidade oral, faringe e traqueia na mesma direção longitudinal. O glottis, que é a entrada da traqueia, será mostrado como um ponto brilhante, que abre e fecha a cada respiração.
- Continue segurando a língua suavemente. Insira a cânula (22 G) na traqueia do mouse mirando no glottis, puxando o núcleo da agulha depois que a cânula é inserida na traqueia.
- Use uma arma de pipeta com uma pequena quantidade de soro fisiológico normal para testar se o tubo está corretamente na meia-porta. Se o tubo estiver na posição certa, a coluna líquida da pistola pipeta estará saltando a cada respiração.
- Solte 50 μL de suspensão DPM (preparado na etapa 1.2) no tubo com uma arma de pipeta. A suspensão será naturalmente inalada nos pulmões do rato enquanto respira.
NOTA: Para garantir uma respiração suave, dar ao mouse duas vezes a suspensão DPM (25 μL por uma vez), 10 s de distância, é melhor. - Remova a agulha de indwelling do animal de estimação após a exposição da PM. Espere o rato permanecer nas almofadas de aquecimento até que eles recuperem a consciência (10-20 min) e, em seguida, coloque de volta na gaiola doméstica.
4. Ligadura da artéria coronária
NOTA: A operação de modelagem da Isquemia miocárdica (ligadura da artéria coronária) é realizada na16ª semana.
- Prepare instrumentos cirúrgicos. Após a autoclavagem, armazene todas as ferramentas cirúrgicas em uma caixa de instrumentos selada. Mergulhe-os em 75% de álcool por 20-30 minutos antes da cirurgia.
- Construa a plataforma de cirurgia. Para alcançar a inclinação adequada da plataforma, use uma cobertura de prato de cultura celular (150 mm x 25 mm). Dobre 0-0 seda (10-15 cm de comprimento) ao meio e conecte as extremidades do rosca à parte superior da plataforma inclinada usando fita para criar um laço de suspensão.
- Anestesiar os camundongos após o procedimento descrito na etapa 3.2.
NOTA: Um intervalo de 1 semana deve ser assegurado entre cada administração de tribromoetanol. - Desinfete a plataforma com lenços umedecidos.
- Coloque o mouse em uma posição supina na plataforma de intubação e gancho os incisivos superiores na alça de suspensão descrita na etapa 4.2. Fita a cauda, membros e bigodes.
- Remova o cabelo do peito esquerdo e parte do peito direito adjacente com creme de depilação antes da cirurgia.
- Realizar intubação orotraqueal em camundongos seguindo o procedimento descrito nas etapas 3.4-3.8.
- Ligue a agulha de indwelling do animal com um ventilador animal (ver Tabela de Materiais). Ajuste do ventilador: taxa respiratória- 120 vezes/min; razão de inalação/respiração - 1:1.1; volume de marés - 1,7 mL.
- Limpe a pele com iodophor e álcool para desinfetar.
- Exponha o coração. Faça um corte de pele por 0,5-1 cm por tesoura oftálmica e prepare os músculos (músculo superficiale peitoral e músculo serratus anterior) para expor as costelas. Fixar a costela com uma pinça oftálmica (com ganchos) e, em seguida, fazer um pequeno corte no terceiro espaço intercostal (ver Tabela de Materiais). Faça uma janela de operação com ferramentas caseiras de abertura do peito.
NOTA: O corte de pele está localizado em cerca de um terço do processo xifoide e da linha de axila. - Rasgue as membranas pericárvias. Em seguida, é possível ligar o LAD seguindo as etapas 4.11-4.14.
NOTA: Se os lobos pulmonares estiverem bloqueando a vista, empurre-o para trás do coração usando um pequeno cotonete estéril. - A princípio, localize o RAPAZ.
- Segure a sutura de seda estéril 6-0 com uma agulha usando fórceps hemostáticos microvasculares (ver Tabela de Materiais). Passe a seda através de uma largura de 2 mm de miocárdio na área onde a artéria coronária está localizada.
NOTA: Não tente ligar apenas o LAD, o que pode causar hemorragia intraoperatória grave. - Coloque um pequeno pedaço de seda estéril 5-0 entre a ligadura e os tecidos do miocárdio para evitar a quebra do tecido.
- Amarre o LAD e o pequeno pacote do miocárdio em torno dele firmemente. A ligadura é considerada bem sucedida quando a parede anterior do ventrículo esquerdo (LV) fica pálida; A elevação do segmento ST pode ser observada simultaneamente se uma máquina de eletrocardiograma estiver conectada.
- Gentilmente esprema o ar do peito. Músculos intercostais de sutura e pele sequencialmente com seda estéril 5-0.
NOTA: Para espremer o ar do peito, feche o peito no momento da expansão pulmonar e use o indicador e os dedos médios para espremer suavemente a caixa torácica no meio e permitir que o ar escape além do último ponto. Seringas também podem ser usadas para extrair gás torácico.
NOTA: Recomenda-se sutura simples interrompida, pois os ratos podem roer a seda quando estiverem acordados.
5. Recuperação
- Limpe toda a mancha de sangue após a cirurgia, ou o rato seria atacado por outros.
- Coloque o mouse em uma almofada de aquecimento em uma posição lateral reclinável. Monitore continuamente os sinais do rato por 5-20 minutos até que se recuperem da anestesia. O tempo de monitoramento depende do estado do órgão.
NOTA: Os ratos respiram mais facilmente na posição lateral reclinável. - Uma vez recuperado o reflexo de redocimento, transfira os ratos para limpar gaiolas de recuperação em uma almofada de aquecimento com comida e garrafa de água. Continue monitorando por 15-30 min para garantir a sobrevivência do rato. Mantenha o mouse longe dos outros antes que ele possa se mover totalmente de forma autônoma.
- Para prevenir a infecção por feridas, injete a penicilina de sódio intramuscularmente de acordo com a dose desejada (1.000.000-1.50.000 U/kg). Para obter detalhes, consulte a rotulagem de medicamentos para conversão de dosagem.
- Coloque o rato de volta na gaiola. Mantenha o monitoramento pelas próximas 24 horas antes da coleta da amostra. Administre analgésicos para experimentos de longo prazo.
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Resultados
Os camundongos foram eutanizados 24 h após a ligadura da artéria coronária, e o sangue foi coletado após anestesia. Os camundongos foram anestesiados por tribromoetanol (conforme o passo 3.2), e a amostra de sangue foi coletada do seio retroorbital. O coração foi colhido, e o grau de Isquemia foi examinado por 2,3,5-Triphenyltetrazolium Cloreto (TTC) (Figura 1). Os tecidos normais ficam vermelhos quando o TTC reage com desidrogenase de succinato, enquanto os tecidos isquêmic...
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Discussão
O estabelecimento de um modelo animal composto é ligeiramente diferente do modelo MI único. Manter uma alta taxa de sobrevivência é um desafio no desenvolvimento do modelo composto. A gravidade da aterosclerose em camundongos ApoE−/− se tornará mais severa com a extensão do tempo de alimentação de alta gordura7, e a fraqueza dos camundongos leva ao aumento da mortalidade. Portanto, é necessário monitorar a condição dos camundongos durante o experimento continuamente e ajustar o tempo pa...
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Divulgações
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes para declarar.
Agradecimentos
Este modelo foi desenvolvido com o apoio da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (Nos. 81673640, 81841001 e 81803814) e do Programa Nacional de Ciência e Tecnologia da China para Drogas Inovadoras (2017ZX093012002 e 2017ZX0910100200002001-001-3).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| 75% desinfetante | |||
| Ventilador para animais | Shanghai Alcott Biotech | ALC-V8S | |
| Cotonetes | estéreis | ||
| para bebês | Estéril, aproximadamente 3 mm de diâmetro | ||
| Prato | de culturaCorning | 430597 | 150 mm x 25 mm |
| Diesel Particulate Matter | National Institute of Standards Technology | 1650b | |
| dissecação | Cerca de 25 x 17 cm. A placa de dissecação pode ser substituída por uma placa de madeira do mesmo tamanho | ||
| Dieta rica em gordura para ratos | Prescrição: gema de ovo em pó 10%, banha de porco 10%, esterol 1%, alimentação de manutenção 79% | ||
| Iodóforo desinfetante | |||
| LED holofote | 5 V, 3 W, com mangueiras e braçadeiras Bola | ||
| fio de seda médica | Shanghai Medical Suture Needle Factory Co., Ltd. | - | 0-0 |
| Fita médica | 3M | 1527C-0 | |
| Micro Vascular Hemostática Forceps | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Fábrica de Instrumentos Cirúrgicos | W40350 | |
| Porta-agulhas | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Fábrica de Instrumentos Cirúrgicos | JC32010 | |
| Solução salina | |||
| normalTesoura oftálmica | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Fábrica de instrumentos cirúrgicos | Y00040 | |
| Pinça oftálmica, 10 cm, curva, com ganchos | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Fábrica de instrumentos cirúrgicos | JD1080 | |
| Pinça oftálmica, 10 cm, curva, com dentes | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Fábrica de instrumentos cirúrgicos | JD1060 | |
| Pontas de pipeta | Axygen | T-200-Y-R-S | 0-200 μ L |
| Pipeta | eppendorf | 3121000074 | 100 uL |
| Pino | Aproximadamente 4,5 cm de comprimento, para fazer ferramentas de abertura do peito | ||
| Cânulas intravenosas para pequenos animais | Baayen healthcare suzhou | BAAN-322025 | CATETER I.V 22FG x 25 MM |
| Agulha de sutura com rosca | Shanghai Medical Suture Needle Factory Co., Ltd. | - | 6-0, linha de nylon |
| agulha de sutura com linha | JinHuan Medical | F503 | 5-0 |
| Seringa | 1 mL | ||
| Terc-amílico álcool | |||
| Zoom-microscópio estéreo | Mshot | MZ62 |
Referências
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Reimpressões e permissões
