Este artigo descreve um fluxo de trabalho de técnicas empregadas para testar novos mediadores candidatos de metástase de melanoma e seus mecanismos de ação.
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Artigo de método
Uma plataforma robusta de descoberta para a identificação de novos mediadores de metástase de melanoma
Neste artigo
Resumo
Resumo
A metástase é um processo complexo, exigindo que as células superem barreiras que são apenas modeladas incompletamente por ensaios in vitro . Um fluxo de trabalho sistemático foi estabelecido utilizando modelos in vivo robustos e reprodutíveis e métodos padronizados para identificar novos atores na metástase do melanoma. Essa abordagem permite a inferência de dados em estágios experimentais específicos para caracterizar precisamente o papel de um gene na metástase. Os modelos são estabelecidos pela introdução de células de melanoma geneticamente modificadas através de injeções intracardicascas, intradérmicas ou subcutâneas em camundongos, seguidos pelo monitoramento com imagens in vivo em série. Uma vez alcançados pontos finais pré-estabelecidos, tumores primários e/ou órgãos portadores de metástases são colhidos e processados para várias análises. As células tumorais podem ser classificadas e submetidas a qualquer uma das várias plataformas de "omics", incluindo o sequenciamento de RNA unicelular. Os órgãos passam por análises de imagem e imunohistopatológicas para quantificar a carga global de metástases e mapear sua localização anatômica específica. Este pipeline otimizado, incluindo protocolos padronizados para engrafamento, monitoramento, colheita de tecidos, processamento e análise, pode ser adotado para culturas derivadas do paciente, culturas de curto prazo e linhas celulares humanas e murinas estabelecidas de vários tipos de câncer sólido.
Introdução
A alta mortalidade associada ao melanoma metastático combinada com uma incidência crescente de melanoma em todo o mundo1 (um aumento estimado de 7,86% até 2025) exige novas abordagens de tratamento. Os avanços na descoberta de alvos dependem de modelos reprodutíveis de metástase, um processo altamente complexo. Ao longo das etapas da cascata metastática, as células de melanoma devem superar inúmeras barreiras para alcançar a evasão do sistema imunológico e a colonização de tecidos distantes2. A resiliência e adaptabilidade das células de melanoma surgem de uma infinidade de fatores, incluindo sua alta carga mutacional ge....
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Protocolo
NOTA: Os procedimentos animais envolvidos no seguinte protocolo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Nova York (IACUC). Todos os procedimentos são realizados em instalações aprovadas pela Associação de Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care International (AAALAC). A Figura 1 retrata a abordagem experimental geral.
1. Culturas de melanoma derivados do paciente (STCs)
- Coloque o tecido em uma placa de Petri de 60 mm com 1 mL de RPMI completo (RPMI 1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, 1 mM ....
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Resultados
Os números a seguir ilustram como o fluxo de trabalho descrito tem sido aplicado para a identificação de novos condutores de metástase de melanoma. A Figura 2 resume os resultados de um estudo publicado em que foram estudados26 os efeitos do silenciamento do fucosyltransferase FUT8 in vivo melanoma. Resumidamente, a análise dos dados glicomicomicos do paciente humano (obtidos por matrizes de lectina) e o perfil transcriômico revelaram níveis aumentados de alf.......
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Discussão
O objetivo deste relatório técnico é oferecer um fluxo de trabalho padronizado, de ponta a ponta para a investigação de potenciais atores em metástase de melanoma. Como os experimentos in vivo podem ser caros e demorados, estratégias para maximizar a eficiência e aumentar o valor das informações obtidas são primordiais.
É imprescindível a utilização de abordagens complementares ao longo de todo para cruzar os achados dentro do mesmo experimento. Por exemplo, tanto a coloração imunohis.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.
Agradecimentos
Agradecemos à Divisão de Tecnologias avançadas de Pesquisa (DART) da NYU Langone Health, e, em particular, ao Laboratório de Pesquisa em Patologia Experimental, ao Centro de Tecnologia do Genoma, ao Laboratório de Citometria e Triagem Celular, ao Núcleo de Imagem Pré-Clínica, que são parcialmente apoiados pelo Perlmutter Cancer Center Support Grant NIH/NCI 5P30CA016087. Agradecemos ao Grupo Cooperativo Interdisciplinar de Melanoma da NYU (PI: Dr. Iman Osman) por fornecer acesso a culturas de curto prazo de melanoma derivados do paciente+ (10-230BM e 12-273BM), que foram obtidos por meio de protocolos aprovados pelo IRB (Estudo de Consentimento Universal #s1....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| #15 Lâmina de Fuga | WPI | 500242 | Para procedimentos cirúrgicos |
| #3 Scapel Handle | WPI | 500236 | Para procedimentos cirúrgicos |
| Seringa Tuberculin de 1 mL, ponta deslizante | Injeções BD | 309626 | |
| Seringa de 10 mL, ponta deslizante | BD | 301029 | Perfusão |
| 10% Formalina Tamponada com Sódio | EK Industries | 4499-20L | Para fixador de perfusão/tecido |
| 15 mL Cônico | Corning | 430052 | Cultura de células |
| 15 mL Tubos de centrífuga cônicos de polipropileno | Falcon | 352196 | Cultura de células |
| 200 Prova de etanol | Deacon Labs | 04-355-223 | Histologia |
| 22G - agulha de 22mm | BD | 305156 | Perfusão |
| 4-0 Sutura Vicryl | Ethicon | J464G | Sutura |
| 4% tamponado com fosfato de Carson paraformaldeído | EMS | 15733-10 | Para perfusão/fixador de tecido |
| 40µ m | Corning | 431750 | Processamento de tecidos |
| 5-0 Sutura Absorvível | Fechamento Ethicon | 6542000 | 50 |
| mL Cônico | Corning | 430828 | Cultura de células |
| 50mL Tubos de centrífuga cônicos de polipropileno | Falcon | 352070 | Cultura de células |
| 7-0 Sutura de seda | FST | 18020-70 | Ligadura |
| 70µ m | Corning | 431751 | Processamento |
| de tecidos Mídia de montagem anti-desbotamento | Imunofluorescência | Vector Labs | H-1000-10 |
| aplicando Fórceps, 10cm | WPI | 14189 | Para procedimentos microcirúrgicos |
| Avance | Bruker | 3 HD | NMR Console |
| Biospec 7030 | Bruker | 7030 | Micro MRI |
| BSA | Bioreg | A941 | NuMA Coloração |
| Pinça de sutura Castroviejo, pontas retas Plataforma de amarração de 5,5mm, 11cm | WPI | WP5025501 | Para procedimentos microcirúrgicos |
| Frasco de Coloração Coplin | Bel-Art | F44208-1000 | Histologia |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Imunofluorescência |
| dCas9-KRAB | Addgene | 110820 | Manipulação genética |
| DNase I | NEB | M0303L | Processamento de tecidos |
| DPBS | Corning | 21-030-CM | Processamento de tecidos |
| Lâmina de borda única não revestida extra afiada | GEM | 62-0167 | Processamento de tecidos |
| Substrato de Matriz Extracelular | A Corning | 354234 | considerar o fator de crescimento reduzido (como alternativa |
| FBS | Cytiva | SH30910.03 | Cultura de células |
| Fiji Image J | Fiji Image J | Software | Imunofluorescência |
| Cabra anti-coelho HRP multímero conjugado | Thermo Fisher | A16104 | NuMA Coloração |
| Soro de Cabra | Gibco | PCN5000 | Imunofluorescência |
| HBSS | Corning | 21-020-CV | Processamento |
| tecidos Hematoxilina | Richard-Allan Scientific | 7231 | Histologia |
| Illumina III | Seringa de insulina PerkinElmer | CLS136334 | BLI Instrument |
| 28G - agulha de 8mm | BD | 329424 | Injeções seringa de |
| insulina 31G - agulha de 6mm | BD | 326730 | Injeções |
| Pinça de íris, 10,2 cm, curva completa, serrilhada | WPI | 504478 | Para perfusão e procedimentos cirúrgicos |
| Isoflurano USP | Covetrus | 11695067772 | Anestesia |
| Joalheiros # 7 Fórceps Titânio 11 cm 0,07 x 0,01 mm Ponta | WPI | WP6570 | Para procedimentos microcirúrgicos |
| Cetamina HCl 100mg / mL | Mylan Ind. | 1049007 | Anestesia |
| lentiCRISPRv2 | Addgene | 98290 | Manipulação genética |
| Lycopersicon Esculentum (Tomate) Lectina, DyLight 649 | Invitrogen | L32472 | Marcador de células endoteliais vasculares |
| MEM aminoácidos não essenciais X 100 | Corning | 25-025-CI | Cultura de células |
| Metzenbaum Tesoura | WPI | 503269 | Para cirúrgico procedimentos |
| Unidade de Microinjeção | KOPF | 5000 | Injeções intracardíacas |
| NaCl | Fisher | S25877 | Coloração NuMA |
| Agulha 30G x 25mm | BD | 305128 | Agulha de Injeção Intracardíaca |
| 33G x 15mm | Hamilton | 7747-01 Porta-agulha | Injeção Intracarotídea |
| , Castroviejo, 14cm, com trava, 1,2mm Mandíbulas Serrilhadas | WPI | 14137-G | Para procedimentos microcirúrgicos |
| NOD. Camundongos Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | O Laboratório Jackson 005557 | camundongos MURINOS modelo | |
| NU/J | O Laboratório Jackson | 002019 | Modelo Murino |
| Aparelho Mitótico Nuclear Proteína policlonal coelho anti-humano | Abcam | 97585 | NuMA Coloração |
| Penicilina-Estreptomicina 10000U/mL | Gibco | 15140122 | Cultura de células |
| Percoll | GE | 0891-01 | solução de separação de densidade |
| PI Classic Luvas Cirúrgicas | Cardinal Health | 2D72PT75X | Cirurgia |
| pLKO Tet-On | Addgene | 21915 | Manipulação genética |
| iodopovidona 10% | Medline | MDS093943 | Cirurgia Gotas |
| proparacaína 0,5% | Akorn Pharma | AX0501 | Anestésico local oftálmico |
| Puralube Petrolatum Pomada Oftálmica | Dechra | de Anestesia | 83592 |
| Lâminas de Dupla Borda | EMS | 72000 | Barbear e Fatiar Cérebro Vibrotom |
| Clipe Reflex 9mm EZ | Braintree | EZC- KIT | Fechamento de ferida |
| RPMI 1640 | Tesoura de | Cultura de Células | 10-040-CM |
| , Mola 10.5cm Str, Lâminas de 8mm | WPI | 501235 | Para procedimentos microcirúrgicos |
| Micrótomo de Lâmina Vibratória Semi-Automática | Leica | VT1200 | Imunofluorescência de Fatia de Cérebro |
| Kent Scientific | VetFlo-1210S | anestesia | |
| Sistema de Câmara de Mesa Smartbox e Soprador de Exaustão | EZ Systems | TT4000 | CO2 Eutanásia |
| Estéril Fenestrados Campo Descartável | Medline | NON21002 | Cirurgia |
| Estéril Não Reforçado Aurora Batas Cirúrgicas com Mangas de Fixação | Medline | DYNJP2715 | |
| Cirurgia T25 Flask | Corning | 430639 | Cultura de células |
| Tris | Corning | 46-031-CM | NuMA Coloração |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | Imunofluorescência |
| Pinça de atar Troutman, 10cm, Padrão G curvo, ponta de 0,52mm com plataforma de atar | WPI | WP505210 | Para procedimentos microcirúrgicos |
| Clipes de vaso 10G Pressão 5x 0,8mm Mandíbulas, 5/pkg | WPI | 15911 | Para procedimentos microcirúrgicos |
| Visiopharm | Visiopharm Visiopharm | NuMA Software de quantificação de coloração | |
| Xylasine 100mg / mL | Akorn Pharma | 59399-111-50 | Anestesia |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL | Histologia |
Referências
- Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Adler, N. R., Haydon, A., McLean, C. A., Kelly, J. W., Mar, V. J.
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Reimpressões e permissões
