Uma plataforma robusta de descoberta para a identificação de novos mediadores de metástase de melanoma

Summary

Este artigo descreve um fluxo de trabalho de técnicas empregadas para testar novos mediadores candidatos de metástase de melanoma e seus mecanismos de ação.

Abstract

A metástase é um processo complexo, exigindo que as células superem barreiras que são apenas modeladas incompletamente por ensaios in vitro . Um fluxo de trabalho sistemático foi estabelecido utilizando modelos in vivo robustos e reprodutíveis e métodos padronizados para identificar novos atores na metástase do melanoma. Essa abordagem permite a inferência de dados em estágios experimentais específicos para caracterizar precisamente o papel de um gene na metástase. Os modelos são estabelecidos pela introdução de células de melanoma geneticamente modificadas através de injeções intracardicascas, intradérmicas ou subcutâneas em camundongos, seguidos pelo monitoramento com imagens in vivo em série. Uma vez alcançados pontos finais pré-estabelecidos, tumores primários e/ou órgãos portadores de metástases são colhidos e processados para várias análises. As células tumorais podem ser classificadas e submetidas a qualquer uma das várias plataformas de "omics", incluindo o sequenciamento de RNA unicelular. Os órgãos passam por análises de imagem e imunohistopatológicas para quantificar a carga global de metástases e mapear sua localização anatômica específica. Este pipeline otimizado, incluindo protocolos padronizados para engrafamento, monitoramento, colheita de tecidos, processamento e análise, pode ser adotado para culturas derivadas do paciente, culturas de curto prazo e linhas celulares humanas e murinas estabelecidas de vários tipos de câncer sólido.

Introduction

A alta mortalidade associada ao melanoma metastático combinada com uma incidência crescente de melanoma em todo o mundo¹ (um aumento estimado de 7,86% até 2025) exige novas abordagens de tratamento. Os avanços na descoberta de alvos dependem de modelos reprodutíveis de metástase, um processo altamente complexo. Ao longo das etapas da cascata metastática, as células de melanoma devem superar inúmeras barreiras para alcançar a evasão do sistema imunológico e a colonização de tecidos distantes². A resiliência e adaptabilidade das células de melanoma surgem de uma infinidade de fatores, incluindo sua alta carga mutacional ge....

Protocol

NOTA: Os procedimentos animais envolvidos no seguinte protocolo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Nova York (IACUC). Todos os procedimentos são realizados em instalações aprovadas pela Associação de Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care International (AAALAC). A Figura 1 retrata a abordagem experimental geral.

1. Culturas de melanoma derivados do paciente (STCs)

1. Coloque o tecido em uma placa de Petri de 60 mm com 1 mL de RPMI completo (RPMI 1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, 1 mM ....

Results

Os números a seguir ilustram como o fluxo de trabalho descrito tem sido aplicado para a identificação de novos condutores de metástase de melanoma. A Figura 2 resume os resultados de um estudo publicado em que foram estudados²⁶ os efeitos do silenciamento do fucosyltransferase FUT8 in vivo melanoma. Resumidamente, a análise dos dados glicomicomicos do paciente humano (obtidos por matrizes de lectina) e o perfil transcriômico revelaram níveis aumentados de alf.......

Discussion

O objetivo deste relatório técnico é oferecer um fluxo de trabalho padronizado, de ponta a ponta para a investigação de potenciais atores em metástase de melanoma. Como os experimentos in vivo podem ser caros e demorados, estratégias para maximizar a eficiência e aumentar o valor das informações obtidas são primordiais.

É imprescindível a utilização de abordagens complementares ao longo de todo para cruzar os achados dentro do mesmo experimento. Por exemplo, tanto a coloração imunohis.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
#15 Lâmina de Fuga	WPI	500242	Para procedimentos cirúrgicos
#3 Scapel Handle	WPI	500236	Para procedimentos cirúrgicos
Seringa Tuberculin de 1 mL, ponta deslizante	Injeções BD	309626
Seringa de 10 mL, ponta deslizante	BD	301029	Perfusão
10% Formalina Tamponada com Sódio	EK Industries	4499-20L	Para fixador de perfusão/tecido
15 mL Cônico	Corning	430052	Cultura de células
15 mL Tubos de centrífuga cônicos de polipropileno	Falcon	352196	Cultura de células
200 Prova de etanol	Deacon Labs	04-355-223	Histologia
22G - agulha de 22mm	BD	305156	Perfusão
4-0 Sutura Vicryl	Ethicon	J464G	Sutura
4% tamponado com fosfato de Carson paraformaldeído	EMS	15733-10	Para perfusão/fixador de tecido
40µ m	Corning	431750	Processamento de tecidos
5-0 Sutura Absorvível	Fechamento Ethicon	6542000	50
mL Cônico	Corning	430828	Cultura de células
50mL Tubos de centrífuga cônicos de polipropileno	Falcon	352070	Cultura de células
7-0 Sutura de seda	FST	18020-70	Ligadura
70µ m	Corning	431751	Processamento
de tecidos Mídia de montagem anti-desbotamento	Imunofluorescência	Vector Labs	H-1000-10
aplicando Fórceps, 10cm	WPI	14189	Para procedimentos microcirúrgicos
Avance	Bruker	3 HD	NMR Console
Biospec 7030	Bruker	7030	Micro MRI
BSA	Bioreg	A941	NuMA Coloração
Pinça de sutura Castroviejo, pontas retas Plataforma de amarração de 5,5mm, 11cm	WPI	WP5025501	Para procedimentos microcirúrgicos
Frasco de Coloração Coplin	Bel-Art	F44208-1000	Histologia
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-1MG	Imunofluorescência
dCas9-KRAB	Addgene	110820	Manipulação genética
DNase I	NEB	M0303L	Processamento de tecidos
DPBS	Corning	21-030-CM	Processamento de tecidos
Lâmina de borda única não revestida extra afiada	GEM	62-0167	Processamento de tecidos
Substrato de Matriz Extracelular	A Corning	354234	considerar o fator de crescimento reduzido (como alternativa
FBS	Cytiva	SH30910.03	Cultura de células
Fiji Image J	Fiji Image J	Software	Imunofluorescência
Cabra anti-coelho HRP multímero conjugado	Thermo Fisher	A16104	NuMA Coloração
Soro de Cabra	Gibco	PCN5000	Imunofluorescência
HBSS	Corning	21-020-CV	Processamento
tecidos Hematoxilina	Richard-Allan Scientific	7231	Histologia
Illumina III	Seringa de insulina PerkinElmer	CLS136334	BLI Instrument
28G - agulha de 8mm	BD	329424	Injeções seringa de
insulina 31G - agulha de 6mm	BD	326730	Injeções
Pinça de íris, 10,2 cm, curva completa, serrilhada	WPI	504478	Para perfusão e procedimentos cirúrgicos
Isoflurano USP	Covetrus	11695067772	Anestesia
Joalheiros # 7 Fórceps Titânio 11 cm 0,07 x 0,01 mm Ponta	WPI	WP6570	Para procedimentos microcirúrgicos
Cetamina HCl 100mg / mL	Mylan Ind.	1049007	Anestesia
lentiCRISPRv2	Addgene	98290	Manipulação genética
Lycopersicon Esculentum (Tomate) Lectina, DyLight 649	Invitrogen	L32472	Marcador de células endoteliais vasculares
MEM aminoácidos não essenciais X 100	Corning	25-025-CI	Cultura de células
Metzenbaum Tesoura	WPI	503269	Para cirúrgico procedimentos
Unidade de Microinjeção	KOPF	5000	Injeções intracardíacas
NaCl	Fisher	S25877	Coloração NuMA
Agulha 30G x 25mm	BD	305128	Agulha de Injeção Intracardíaca
33G x 15mm	Hamilton	7747-01 Porta-agulha	Injeção Intracarotídea
, Castroviejo, 14cm, com trava, 1,2mm Mandíbulas Serrilhadas	WPI	14137-G	Para procedimentos microcirúrgicos
NOD. Camundongos Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ	O Laboratório Jackson 005557		camundongos MURINOS modelo
NU/J	O Laboratório Jackson	002019	Modelo Murino
Aparelho Mitótico Nuclear Proteína policlonal coelho anti-humano	Abcam	97585	NuMA Coloração
Penicilina-Estreptomicina 10000U/mL	Gibco	15140122	Cultura de células
Percoll	GE	0891-01	solução de separação de densidade
PI Classic Luvas Cirúrgicas	Cardinal Health	2D72PT75X	Cirurgia
pLKO Tet-On	Addgene	21915	Manipulação genética
iodopovidona 10%	Medline	MDS093943	Cirurgia Gotas
proparacaína 0,5%	Akorn Pharma	AX0501	Anestésico local oftálmico
Puralube Petrolatum Pomada Oftálmica	Dechra	de Anestesia	83592
Lâminas de Dupla Borda	EMS	72000	Barbear e Fatiar Cérebro Vibrotom
Clipe Reflex 9mm EZ	Braintree	EZC-  KIT	Fechamento de ferida
RPMI 1640	Tesoura de	Cultura de Células	10-040-CM
, Mola 10.5cm Str, Lâminas de 8mm	WPI	501235	Para procedimentos microcirúrgicos
Micrótomo de Lâmina Vibratória Semi-Automática	Leica	VT1200	Imunofluorescência de Fatia de Cérebro
	Kent Scientific	VetFlo-1210S	anestesia
Sistema de Câmara de Mesa Smartbox e Soprador de Exaustão	EZ Systems	TT4000	CO2 Eutanásia
Estéril Fenestrados Campo Descartável	Medline	NON21002	Cirurgia
Estéril Não Reforçado Aurora Batas Cirúrgicas com Mangas de Fixação	Medline	DYNJP2715
Cirurgia T25 Flask	Corning	430639	Cultura de células
Tris	Corning	46-031-CM	NuMA Coloração
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-500ML	Imunofluorescência
Pinça de atar Troutman, 10cm, Padrão G curvo, ponta de 0,52mm com plataforma de atar	WPI	WP505210	Para procedimentos microcirúrgicos
Clipes de vaso 10G Pressão 5x 0,8mm Mandíbulas, 5/pkg	WPI	15911	Para procedimentos microcirúrgicos
Visiopharm	Visiopharm Visiopharm		NuMA Software de quantificação de coloração
Xylasine 100mg / mL	Akorn Pharma	59399-111-50	Anestesia
Xylene	Fisher	X3P-1GAL	Histologia