Análise da diferenciação celular, morfogênese e padronização durante a embriogênese de frango usando o ensaio de contas encharcadas

Summary

O ensaio de contas encharcada envolve a entrega direcionada de reagente de teste em qualquer ponto de desenvolvimento para estudar a regulação da diferenciação celular e morfogênese. Um protocolo detalhado, aplicável a qualquer modelo animal experimental, para preparar três tipos diferentes de contas encharcadas e implantá-las no interdigit de um embrião de frango é apresentado.

Abstract

Uma infinidade de programas genéticos é ativada durante o desenvolvimento embrionário que orquestra a diferenciação celular para gerar uma diversidade surpreendente de células, tecidos e órgãos somáticos. A ativação precisa desses programas genéticos é regulada por morfogens, moléculas difusíveis que direcionam o destino celular em diferentes limiares. Entender como a ativação genética coordena a morfogênese requer o estudo das interações locais desencadeadas por morfogênicos durante o desenvolvimento. O uso de contas embebidas em proteínas ou drogas implantadas em regiões distintas do embrião permite estudar o papel de moléculas específicas no estabelecimento de dígitos e outros processos de desenvolvimento. Esta técnica experimental fornece informações sobre o controle da indução celular, destino celular e formação de padrões. Assim, este ensaio de contas encharcada é uma ferramenta experimental extremamente poderosa e valiosa aplicável a outros modelos embrionários.

Introduction

Avanços nos mecanismos moleculares que controlam a expressão genética durante o desenvolvimento embrionário nos permitiram entender como o destino celular é determinado. O compromisso com diferentes linhagens celulares ocorre uma vez que as células iniciam a expressão molecular dos fatores de transcrição¹. Esse padrão de expressão é altamente coordenado no espaço e no tempo e, assim, direciona a formação, posicionamento e padronização de células, tecidos e órgãos 1,2,3,4,5. A indução....

Protocol

Esta pesquisa foi revisada e aprovada pelo Conselho de Revisão Institucional para o Cuidado e Uso de Animais laboratoriais do Instituto de Investigaciones Biomédicas da Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Cidade do México, México).

1. Incubação de ovos e estadiamento de embriões

NOTA: Ovos de galinha fertilizados podem ser obtidos em fazendas locais. Ovos de galinha Leghorn Branco Fertilizado são mais comumente usados. Armazene os ovos de galinha recém-fertilizados a 15 °C por até 1 semana antes da incubação.

1. Incubar os ovos de galinha fertilizados verticalmente com o lado po....

Results

Usando contas encharcadas para avaliar o comportamento celular no membro do pintinho embrionário
Para assegurar a eficácia deste ensaio, a conta deve ser colocada de forma consistente e precisa no local correto; neste caso, a maioria distal do terceiro interdigit sob a est cume ectodérmica apical AER (Figura 1A). Este posicionamento permite que a molécula em questão se espalhe igualmente por todo o tecido interdigital. Além disso, a zona abaixo do AER contém células indif.......

Discussion

A principal vantagem da ferramenta experimental detalhada neste protocolo é ser capaz de controlar a hora e a localização da exposição a contas encharcadas em uma determinada molécula experimental. Combinar o posicionamento correto com o timing preciso do desenvolvimento oferece enormes possibilidades de estudar processos de diferenciação celular. Realizar esses experimentos em tecidos indiferenciados permite investigar os primeiros eventos cruciais na linhagem celular. Por exemplo, colocar uma conta encharcada de TGFß n.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Contas de gel azul Affi-Gel	Bio-Rad	153-7302
AG1-X2 contas	Bio-Rad	1400123
Incubadora de ovos	Incumatic de Mexico	Incumatic 1000
pinças cirúrgicas finas	Fine Science Tools	9115-10
contas de heparina sepharose	Abcam ab193268
placa de Petri	Nest
Estereomicroscópio	Zeiss	Stemi DV4
Fita	NA	NA
Agulha de tungstênio	GoodFellow	E74-15096/01