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Artigo de método

Investigando o Metabolismo Cardíaco no Coração de Rato Perfundido Isolado com Piruvato Hiperpolarizado [1-13C]Piruvato e Espectroscopia de RMN 13C/31P

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DOI:

10.3791/63188

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21 de abril de 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Radiology, Hadassah Medical Organization and Faculty of Medicine, Hebrew University of Jerusalem, 2The Wohl Institute for Translational Medicine

Neste artigo

Resumo

Descrevemos uma configuração experimental para administrar metabólitos hiperpolarizados marcados com 13C no modo de perfusão contínua a um coração de rato perfundido isolado. Uma abordagem dedicada à aquisição de 13C-NMR permitiu a quantificação da atividade enzimática metabólica em tempo real, e uma análise multiparamétrica de 31P-NMR permitiu a determinação do conteúdo de ATP tecidual e do pH.

Resumo

O metabolismo é a base de processos importantes na vida celular. Caracterizar como as redes metabólicas funcionam nos tecidos vivos fornece informações cruciais para a compreensão do mecanismo das doenças e a concepção de tratamentos. Neste trabalho, descrevemos procedimentos e metodologias para estudar a atividade metabólica intracelular em um coração de camundongo retrógrado perfundido em tempo real. O coração foi isolado in situ, em conjunto com parada cardíaca para minimizar a isquemia miocárdica e foi perfundido dentro de um espectrômetro de ressonância magnética nuclear (RMN). Enquanto no espectrômetro e sob perfusão contínua, o [1-13 C]piruvato hiperpolarizado foi administrado ao coração, e as subsequentes taxas de produção de [1-13 C]lactato e [13C]bicarbonato hiperpolarizadas serviram para determinar, em tempo real, as taxas de produção de lactato desidrogenase e piruvato desidrogenase. Esta atividade metabólica do [1-13C]piruvato hiperpolarizado foi quantificada com espectroscopia de RMN de forma livre usando a abordagem de aquisição de saturação seletiva de excitações do produto. 31 anos A espectroscopia de P foi aplicada entre as aquisições hiperpolarizadas para monitorar a energia cardíaca e o pH. Este sistema é excepcionalmente útil para estudar a atividade metabólica no coração de rato saudável e doente.

Introdução

Alterações no metabolismo cardíaco estão associadas a uma variedade de cardiomiopatias e muitas vezes formam a base dos mecanismos fisiopatológicos subjacentes1. No entanto, existem inúmeros obstáculos para estudar o metabolismo em tecidos vivos, já que a maioria dos ensaios bioquímicos requer a homogeneização do tecido e lise celular e / ou rastreamento radioativo. Portanto, há uma necessidade premente de novas ferramentas para investigar o metabolismo miocárdico em tecidos vivos. A ressonância magnética (RM) de substratos hiperpolarizados marcados com 13C permite medições em tempo real do metabolismo em tecidos vivos2, sem o uso de radiação ionizante, aumentando a relação sinal-ruído (SNR) por RM do(s) sítio(s) marcado(s) em várias ordens de magnitude3. Aqui, descrevemos uma configuração experimental, uma abordagem de aquisição e uma abordagem analítica para estudar o metabolismo rápido no coração isolado de camundongos e, em paralelo, apresentar indicadores de energia e acidez tecidual geral. O pH cardíaco é um indicador valioso, pois o equilíbrio ácido-base é interrompido nos estágios iniciais de doenças cardíacas e condições como isquemia miocárdica, hipertrofia desadaptativa e insuficiência cardíaca6.

A produção de [1-13 C]lactato e [13 C]bicarbonato hiperpolarizados a partir do [1-13C]piruvato hiperpolarizado ajuda a determinar as taxas de produção de lactato desidrogenase (LDH) e piruvato desidrogenase (PDH). A maioria dos estudos prévios realizados utilizando substratos hiperpolarizados no coração de roedores isolados utilizou modelos cinéticos complexos para derivar a atividade enzimática da LDH e PDH, ou relatou as razões de intensidade de sinal do produto hiperpolarizado para um substrato sem calcular as taxas reais de atividade enzimática 2,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Aqui, utilizou-se a abordagem de saturação-excitação seletiva do produto 15, que permite o monitoramento da atividade enzimática de forma livre de modelos15,16. Desta forma, as taxas enzimáticas absolutas (ou seja, o número de moles de produto produzido por unidade de tempo) foram determinadas. 31 anos A espectroscopia P foi utilizada para observar os sinais de fosfato inorgânico (Pi), fosfocreatina (PCr) e trifosfato de adenosina (ATP). Uma análise multiparamétrica foi utilizada para caracterizar a distribuição do pH do coração, como demonstrado pelo deslocamento químico heterogêneo no sinal Pi do tecido.

O coração de rato retrógrado perfundido (coração de Langendorff)17,18,19 é um modelo ex vivo para o coração que bate intacto. Nesse modelo, a viabilidade cardíaca e o pH são preservados por pelo menos 80 min20, e tem demonstrado potencial de recuperação após lesão isquêmica prolongada21,22. No entanto, a variabilidade inadvertida durante a microcirurgia pode levar à variabilidade na viabilidade tecidual entre os corações. Estudos anteriores relataram a deterioração desse coração ao longo do tempo19; por exemplo, observou-se uma redução na função contrátil de 5%-10% por hora18. O sinal do trifosfato de adenosina (ATP) já demonstrou relatar o estado energético miocárdico e a viabilidade23. Aqui, observamos que o coração perfundido pode, ocasionalmente, apresentar variabilidade não intencional nos níveis de viabilidade, como demonstrado pelo teor de ATP, apesar de termos tido uma perfusão ininterrupta e suprimento de oxigênio. Demonstramos aqui que normalizar as taxas de LDH e PDH para o conteúdo de ATP do coração reduz a variabilidade intercardíaca nessas taxas.

No protocolo a seguir, descrevemos o procedimento cirúrgico utilizado para canulação cardíaca, isolamento e consequente perfusão no espectrômetro de RMN. Vale ressaltar que outras abordagens cirúrgicas com o objetivo de isolar e perfundir o coração de camundongos foram descritas antesde 24,25.

As metodologias utilizadas para a aquisição de dados relacionados às taxas enzimáticas no coração batendo (usando espectroscopia de 13 C e [1-13C]piruvato hiperpolarizado) e a viabilidade e acidez do coração (usando espectroscopia de RMN de 31P) também são descritas. Finalmente, as metodologias analíticas para determinar as atividades enzimáticas metabólicas e a viabilidade e acidez tecidual são explicadas.

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Protocolo

O comitê conjunto de ética (IACUC) da Universidade Hebraica e do Hadassah Medical Center aprovou o protocolo de estudo para o bem-estar animal (MD-19-15827-1).

1. Preparação do tampão de Krebs-Henseleit

  1. Um dia antes do experimento, prepare uma versão modificada do buffer de Krebs-Henseleit (KHB)26. Inicialmente, dissolver 118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,5 mM piruvato, 1,2 mM MgSO 4, 25 mM NaHCO3 e 1,2 mM KH 2 PO4 em H2O de destilação dupla.
  2. Borbulhe esta mistura com 95%/5% O 2/CO 2 por 20 min e, em seguida, adicione 1,2 mM CaCl2.
  3. Ajuste o pH do tampão para 7,4 com HCl ou NaOH.
  4. No dia do experimento, adicionar 10 mM de glicose e 72 U/L de insulina ao KHB preparado na etapa 1.2.
    NOTA: A insulina é adicionada ao tampão de perfusão conforme descrito no trabalho de Kolwicz et al.26 e em concordância com estudos anteriores relatando que a insulina aumenta a função contrátil27 e a intensidade do sinal de bicarbonato hiperpolarizado [13C]28.

2. Preparação do sistema de perfusão

  1. Manter um reservatório de 200 mL de KHB em banho-maria a 40 °C e borbulhar com 95%/5% O 2/CO2 a uma taxa de fluxo de 4 L/min por 1 h antes da perfusão cardíaca. Mantenha o tampão continuamente borbulhando com esta mistura de gases durante todo o experimento.
    1. Primeiro, ajuste o banho-maria para 40 °C. Insira o reservatório KHB. Use uma bomba peristáltica (ver Tabela de Materiais) e tubos de extensão de grau médico para recircular o KHB entre o reservatório tampão e o tubo de RMN de 10 mm a uma taxa de fluxo constante de 7,5 mL/min.
    2. Conecte três tubos de silicone curados com platina (3 mm i.d.) à bomba (um tubo de entrada e dois tubos de saída para o buffer KH). Insira as linhas de saída e de entrada no buffer KH aquecido. Em seguida, insira a linha de oxigênio no tampão KH aquecido.
    3. Use linhas finas de éter de poliéter cetona (PEEK, consulte Tabela de Materiais) para que o buffer e o agente hiperpolarizado fluam de e para o tubo de RMN dentro do furo do espectrômetro.
  2. Certifique-se de que a temperatura é mantida em 37-37,5 °C. Siga os passos abaixo.
  3. Envolva a linha de entrada (do reservatório tampão para o tubo de RMN) com uma fita de aquecimento ajustada para 42 °C.
  4. Aqueça o tubo de RMN dentro do espectrômetro com um fluxo de ar quente que é regulado pelo espectrômetro.
  5. Use um sensor de temperatura compatível com RMN (consulte Tabela de Materiais) para medir a temperatura dentro do tubo de RMN. A temperatura é ajustada para 37-37,5 °C.

3. Calibração e preparação do espectrômetro de RMN para aquisição

  1. No dia do experimento, insira uma amostra padrão de 13 C que contenha 1,4-dioxano (Tabela de Materiais) no espectrômetro e ajuste e combine a sonda de RMN para 13C. Em seguida, obtenha um espectro mostrando o sinal de equilíbrio térmico de 1,4-dioxano com um ângulo de nutação de 90°.
  2. Agora troque a amostra padrão de 13C por uma amostra padrão de 31 P (Tabela de Materiais), que contém 105 mM de ATP em D2O. Tune e corresponda à sonda NMR para 31P.
    NOTA: Um espectro que mostra os sinais de fosfato de equilíbrio térmico é obtido com um ângulo de nutação de 50°.
  3. Insira a linha de entrada, a linha de saída e a sonda de temperatura em um tubo de RMN de 10 mm e, em seguida, insira o tubo no furo magnético. Ajustar a fita de aquecimento a 42 °C.
  4. Adquira um espectro de RMN de 31 P do tampão KH circulante a ser usado nesse experimento por 30min, com um ângulo de nutação de 50° e um TR de 1,1 s (1.640 aquisições).

4. Preparação animal, procedimento cirúrgico e perfusão do coração no tubo de RMN

  1. Anestesiar um camundongo macho HSD:ICR (CD-1) com isoflurano a 3,3% em ar ambiente (Tabela de Materiais) a 340 mL/min por 5 min utilizando um sistema de anestesia gasosa (Tabela de Materiais) em câmara de indução.
  2. Utilizar anestesia nasal para a manutenção da anestesia geral com isoflurano a 2,9%.
    NOTA: Cuidados são tomados para minimizar a dor e o desconforto para o animal.
  3. Prenda os membros do animal com fita adesiva, assegure um reflexo negativo de dor no pedal e, em seguida, injete 300 UI de heparina sódica por via intraperitoneal.
  4. Molhe a parede torácica e o abdômen do rato completamente com álcool a 70% para garantir a limpeza e evitar a contaminação ou obstrução do cabelo durante o procedimento cirúrgico.
  5. Em 1 min após a injeção de heparina, corte a pele e o músculo da cavidade abdominal com uma pequena tesoura.
  6. Coloque o pequeno grampo de mosquito com bloqueio de hemostático de mandíbula curva entre o processo xifoide e a pele do peito para levantar o peito e expor o diafragma. Punção e corte o lobo direito do diafragma.
  7. Corte o peito através da linha média, retraia para os lados e, em seguida, remova.
  8. Injete o ventrículo esquerdo do coração com 200 UI de heparina sódica para evitar a coagulação do sangue. Em seguida, injete 0,1 mL de KCl gelado a 0,5 mol/L para atingir a parada cardíaca, conforme descrito anteriormente25. A parada cardíaca é essencial para poder canular o coração.
  9. Identifique o timo e remova-o usando uma tesoura para expor a aorta. Remova o tecido residual da caixa torácica.
  10. Identifique o arco aórtico e use pinças curvas para colocar um nó solto com uma sutura de seda 3-0 (Tabela de Materiais) ao redor da aorta ascendente. Injete 3 mL de KHB no ventrículo esquerdo para remover coágulos sanguíneos da aorta.
  11. Use pinça curva para retrair o coração inferiormente para melhor visualização da aorta ascendente.
  12. Realizar a canulação in situ com cateter intravenoso 22 G (Tabela de Materiais). Aplique adesivo de cianoacrilato na região canulada e, em seguida, realize a amarração de sutura dupla. Injete tampão KH adicional no coração e verifique se ele flui através do tubo de canulação.
  13. Remova a pinça curva. Desconecte o coração das vísceras circundantes e perfunda-o retrógradamente com KHB gelado (4 °C) através do cateter intravenoso.
  14. Conecte o coração à linha de entrada do sistema de perfusão através do cateter intravenoso. Após o início da perfusão com tampão quente (37-37,5 °C) a 7,5 mL/min, o coração começa a bater espontaneamente.
  15. Fixe o tubo de RMN com o coração batendo, as linhas de saída e a sonda de temperatura e insira no furo do espectrômetro, certificando-se de que o coração esteja no centro da sonda de RMN.

5. Aquisição de dados para energia cardíaca e pH

  1. Adquira espectros de 31P por cerca de 1 h com um ângulo de inversão de 50 ° e um TR de 1,1 s.

6. Polarização e dissolução do spin DNP

  1. Prepare uma formulação de 28,5 mg de [1-13C]piruvato. Esta formulação consiste em 11,1 mM a 14,0 mM OX063 radical no ácido puro.
  2. Preparar 4 ml de meio de dissolução. O meio de dissolução consiste em tampão TRIS-fosfato, que contém 11,2 mM NaH 2 PO 4, 38,8 mM Na 2 HPO4, 33 mM TRIS e2mM HCl. Esta composição do meio é ajustada de tal forma que, após a adição de 28,5 mg de formulação de ácido [1-13C]pirúvico a 4 mL deste tampão (na fase de dissolução), o pH da solução resultante será de 7,4.
  3. Execute a polarização por rotação e a dissolução rápida em um dispositivo de polarização por rotação DNP (dDNP) de acordo com as instruções do fabricante (Tabela de Materiais). Aplicar irradiação de micro-ondas a uma frequência de 94,110 GHz para a polarização da formulação de ácido [1-13C]pirúvico a 1,45 K a 1,55 K por cerca de 1,5 h.
  4. Misture rapidamente os 4 mL de meio hiperpolarizado do dispositivo dDNP com uma solução bem oxigenada que complemente o meio de dissolução hiperpolarizado para obter uma composição próxima ao meio de perfusão.
    NOTA: O volume final do meio que perfunde o coração durante as injeções hiperpolarizadas com 14 mM hiperpolarizados [1-13C]piruvato é de 26 mL. A composição final do meio injetado (após mistura) contém 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 70 mM NaCl, 25 mM NaHCO3, 1,2 mM KH 2 PO4, 10 mM de glicose, 1,2 mM CaCl2e 72 U/L de insulina.
  5. Administrar o meio hiperpolarizado contendo [1-13C]piruvato ao coração isolado usando uma configuração de fluxo contínuo29.
    NOTA: Isso é feito para garantir que a perfusão cardíaca não seja perturbada em nenhum momento durante o experimento e que o meio hiperpolarizado seja administrado a uma taxa conhecida e por uma duração conhecida.

7. Espectroscopia hiperpolarizada de 13C

  1. Adquirir dados hiperpolarizados de 13 C usando pulsos de saturação-excitação seletivos do produto 15 aplicando pulsos de seno cardinal (Sinc) de 2,5 ms, conforme descrito anteriormente15,16. Excitar seletivamente [1-13 C]lactato e [13C]bicarbonato consecutivamente em intervalos de 6 s para obter um intervalo de 12s para cada metabólito.
  2. Para a detecção de [1-13 C]lactato, centralize o pulso seletivo de Sinc na frequência de hidrato de [1-13 C]piruvato (179,4 ppm), o que resulta em razão de intensidade de sinal (lac) de 0,113 para os sinais C 1 de [1-13 C]piruvato para [1-13C]lactato.
  3. Para a detecção de [13 C]bicarbonato, centralize o pulso seletivo de Sinc em 157,7 ppm, que é 214 Hz de campo descendente do sinal de [13C]bicarbonato (161,1 ppm); isso resulta em uma razão de intensidade de sinal (bic) de 0,139 para o sinal C 1 de [1-13C]piruvato para [13C]bicarbonato.

8. Determinação do peso e volume húmidos do tecido

  1. No final do experimento, desprenda o coração do sistema de perfusão e seque-o suavemente com papel de seda. Posteriormente, pese o coração para obter o peso úmido do tecido.
  2. Determinar o volume do coração usando um fator de densidade de 1,05 g/cm3, conforme determinado anteriormente para o coração do rato30.

9. Quantificação do teor de ATP

  1. Integrar o sinal γ-ATP de uma única aquisição da amostra padrão ATP e uma aquisição de 30 min (TR de 1,1 s e 1.640 aquisições) do coração isolado.
  2. Quantifique o conteúdo de ATP do coração comparando a integral do sinal γ-ATP do coração com o do padrão (Tabela de Materiais), onde este último tem uma concentração conhecida (105 mM), e corrigir o número de aquisições e efeitos de relaxamento.

10. Resolvendo o sinal Pi do coração

NOTA: Para avaliar o pH tecidual, primeiro é necessário dissociar o sinal Pi do coração do sinal Pi total (Pit). Isso é feito omitindo o sinal do KHB Pi (PiKH) do sinal do Pit.

  1. Em um espectro de 31P de KHB que mostra um único sinal Pi (Pi KH, Figura 1A), ajuste o sinal PiKH a uma função lorentziana usando o Excel (Tabela de Materiais).
  2. O volume visível para a sonda de RMN (Vp, 1,375 mL), contém mais KHB quando o tubo de amostra não contém o coração. Para corrigir esse efeito de enchimento, calcule o sinal de buffer atenuado (Pib) usando a Eq. 1A.
    figure-protocol-1Equina 1A
    onde Vh é o volume do coração, conforme determinado na etapa 8.
  3. Subtraia este sinal do Pit de acordo com a Eq. 1B para obter o sinal Pi proveniente exclusivamente do coração perfundido (Pih, Figura 1B).
    figure-protocol-2Eq. 1B

11. Análise multiparamétrica do pH

  1. Realizar a conversão da distribuição do deslocamento químico do sinal de Pih para o pH com referência ao deslocamento químico do PCr usando a Eq. 231.
    figure-protocol-3Equina 2
    onde Δδ é a diferença de deslocamento químico, pKa é 6,72, δ base livre é 5,69 e δ ácido livre é 3,27, conforme descrito anteriormente31.
  2. Corrigir a curva de distribuição de pH resultante para a não linearidade entre a escala de deslocamento químico de Pih e a escala de pH de acordo com Lutz et al.32. Uma distribuição típica do pH resultante desse cálculo é apresentada na Figura 1C.
  3. Analisar a distribuição do pH tecidual com uma abordagem multiparamétrica utilizando sete parâmetros estatísticos seguindo o trabalho de Lutz et al. 32. Quatro desses parâmetros são apresentados aqui, pois parecem ser os mais descritivos do pH tecidual: 1) pH máximo global; 2) pH médio ponderado; 3) pH mediano ponderado; e 4) distorção do gráfico de pH (Figura 1C).

12. Cálculo das atividades LDH e PDH

NOTA: As taxas de produção dos metabólitos hiperpolarizados [1-13 C]lactato e [13C]bicarbonato são utilizadas para calcular as actividades LDH e PDH, respectivamente. Na abordagem de saturação-excitação seletiva do produto15, apenas metabólitos hiperpolarizados recém-sintetizados são detectados por cada excitação seletiva.

  1. Use o sinal hiperpolarizado [1-13C]piruvato como referência para determinar o nível de produção de metabólitos correspondente.
    1. Durante a perfusão com o meio hiperpolarizado, a concentração de [1-13C]piruvato no tubo de RMN aumenta (wash-in), depois se estabiliza (a uma concentração máxima de 14 mM) e depois diminui (wash-out).
    2. Para identificar os pontos de tempo em que a concentração de piruvato atingiu um nível constante (platô), corrija o sinal de [1-13C]piruvato para o decaimento do sinal resultante do relaxamento de T1 e da pulsação de RF usando a constante de relaxamento efetiva, Teff.
    3. Para cada injeção, defina o Teff com base em sua capacidade de corrigir a curva de decaimento do [1-13C]piruvato para mostrar essa dinâmica de fluxo (Eq.3).
      figure-protocol-4Equina 3
      onde figure-protocol-5 é o sinal de [1-13 C]piruvato que foi adquirido durante a aquisição de [13C]bicarbonato. A média de Teff nos experimentos aqui descritos foi de 35,8 s ± 2,3 s (n = 5 corações).
    4. Selecione os pontos de dados em que a concentração está dentro de 10% do sinal máximo corrigido [1-13C]piruvato para análise posterior.
  2. Utilizar os dados correspondentes de produção de [1-13 C]lactato e [13C]bicarbonato para os pontos de tempo selecionados no passo 12.1 para o cálculo das taxas de produção de metabolitos utilizando a Eq. 4A e a Eq. 4B, desde que o SNR do sinal do metabolito seja superior a 2 (limiar para análise). Um exemplo típico de tal seleção de pontos de tempo é mostrado na Figura 2B (janela temporal realçada).
  3. Calcule as taxas de produção de cada um dos pontos de dados selecionados usando a Eq. 4A e a Eq. 4B:
    figure-protocol-6Equina 4A
    figure-protocol-7Equina 4B
    onde figure-protocol-8 e são as taxas de produção de [1-13 C]lactato ou [13 C]bicarbonato em cada ponto de tempo, respectivamente. e são fatores que representam a excitação relativa de [1-13 C]piruvato e figure-protocol-9 figure-protocol-10 os produtos [1-13 C]lactato ou [13C]bicarbonato, respectivamente.figure-protocol-11 Esses fatores foram determinados previamente como sendo 0,113 e 0,139, respectivamente29. Vp é o volume que é detectado pela sonda de RMN (1,375 mL), TR denota o intervalo de tempo entre duas excitações seletivas consecutivas de saturação do produto (12 s para cada produto), figure-protocol-12 e são os sinais de [1-13 C]lactato e [13 C]bicarbonato, respectivamente, e figure-protocol-13 figure-protocol-14 são os sinais de [1-13 C]piruvato que foram adquiridos durante o [1-13 C]lactato e figure-protocol-15 [13 Excitações de C]bicarbonato, respectivamente. [Pyr] é a concentração de [1-13C]piruvato, que foi de 14 mM durante a fase de platô.
    1. Determine a taxa para cada ponto e, em seguida, a média por injeção hiperpolarizada.

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Resultados

Os espectros de 31P registrados a partir de um coração de rato perfundido com KHB e do tampão isolado são mostrados na Figura 1A. Os sinais de α, β e γ-ATP, PCr e Pi foram observados no coração. O sinal Pi foi composto por dois componentes principais: no campo superior (lado esquerdo do sinal), o sinal Pi foi principalmente devido ao KHB a um pH de 7,4; no campo inferior (lado direito do sinal), o sinal Pi foi mais amplo e menos homogêneo devido ao ambiente mais ácido. Este último...

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Discussão

Demonstramos uma configuração experimental projetada para investigar o metabolismo hiperpolarizado do [1-13C]piruvato, a energia tecidual e o pH em um modelo isolado de coração de camundongo.

As etapas críticas dentro do protocolo são as seguintes: 1) garantir que o pH do tampão seja de 7,4; 2) assegurar que todos os componentes da reserva sejam incluídos; 3) evitar a coagulação do sangue nos vasos cardíacos por injeções de heparina; 4) evitar danos isquêmicos ao coração, reduzindo ...

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Divulgações

Não há divulgações.

Agradecimentos

Este projeto recebeu financiamento da Israel Science Foundation sob o contrato de subvenção nº 1379/18; a Bolsa Jabotinsky do Ministério da Ciência e Tecnologia de Israel para Ciências Aplicadas e de Engenharia para Estudantes de Doutorado Direto No. 3-15892 para D.S.; e o programa de investigação e inovação Horizonte 2020 da União Europeia ao abrigo da convenção de subvenção n.º 858149 (AlternativesToGd).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Equipamento
Polarizador DNP HyperSenseOxford Instruments52-ZNP91000HyperSense, 3.35 T, dissolução pré-clínica-DNP hiperpolarizador
espectrômetro de RMN Cubo de RMN RS2D, 5,8 T, equipado com uma sonda de banda larga de 10 mm
Bomba peristáltica Sonda de temperatura Cole-Parmer07554-95
Sondade temperatura compatívelOsensaFTX-100-LUX+
Sistema de anestesia de baixo fluxo Somnosuite KentScientific
Lines, tubulações, sutura
silicone curados com platinaCole-ParmerHV-96119-16L/S 16 I.D. 3.1 mm& nbsp;
Linhas finas de poliéter éter cetona (PEEK)Upchurch Scientificid. 0.040 "
Cateter intravenoso BD Medical38132322 G
Sutura de sedaEthiconW577HDiâmetro do fio de 3-0
Chemicals and pharmaceuticals
[1-13C]pyruvic acidCambridge Isotope LaboratoriesCLM-8077-1
Cloreto de cálcioSigma-Aldrich21074CAS: 10043-52-4
D-(+)-GlicoseSigma-AldrichG7528CAS: 50-99-77
Heparina sódicaRotexmedicaHEP5A0130C0160
Ácido clorídrico 37%Sigma-Aldrich258148CAS: 7647-01-0
Insulina aspártico (NovoLog)Novo Nordisk
IsofluranoTerrel
Sulfatode MagnésioSigma-Aldrich793612CAS: 7487-88-9
Cloretode potássio Sigma-AldrichP4504CAS: 7447-40-7
Fosfato de potássio monobásicoSigma-AldrichP9791CAS: 7778-77-0
Bicarbonato de sódioGadot GroupCAS: 144-55-8
Cloreto de sódioSigma-AldrichS9625CAS: 7647-14-5
Sódio hidróxidoSigma-Aldrich655104CAS: 1310-73-2
Fosfato de sódio dibásicoSigma-AldrichS7907CAS: 7558-79-4
Fosfato de sódio monobásico di-hidratadoMerck6345CAS: 13472-35-0
TRIS (grau de biotecnologia)Amresco0826CAS: 77-86-1
Radical tritil OX063GE Healthcare ASNC100136OX063
NMR< / strong>
13< / sup>C amostra padrãoCambridge Isotope LaboratoriesDLM-72A40% de p-dioxano em benzeno-D6
31< / sup>P amostra padrãoFabricado internamente105 mM ATP e 120 mM de ácido fenilfosfônico em D2
OSoftware
Excel 2016Microsoft
MNovaMestrelab Pesquisa
NMRTubos de

Referências

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