Neste protocolo, os pontos quânticos conjugados ao pico SARS-CoV-2 recombinante permitem que ensaios baseados em células monitorem a ligação de espigão para hACE2 na membrana plasmática e a endocitose subsequente das proteínas ligadas ao citoplasma.
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Artigo de método
Imagem confocal de alta taxa de imagem confocal de sars-cov-2 trimers de pico conjugados de alta throughput para rastrear a vinculação e a endocitose em células HEK293T
Neste artigo
Resumo
Resumo
O desenvolvimento de novas tecnologias para microscopia de fluorescência celular facilitou métodos de triagem de alto rendimento para a descoberta de drogas. Pontos quânticos são nanopartículas fluorescentes com excelentes propriedades fotofísicas imbuídas de fotoluminescência brilhante e estável, bem como faixas de emissão estreitas. Os pontos quânticos são esféricos em forma, e com a modificação adequada da química da superfície, podem ser usados para conjugar biomoléculas para aplicações celulares. Essas propriedades ópticas, combinadas com a capacidade de funcionalizá-las com biomoléculas, as tornam uma excelente ferramenta para investigar interações receptor-ligantes e tráfico celular. Aqui, apresentamos um método que usa pontos quânticos para rastrear a ligação e a endocitose da proteína de pico SARS-CoV-2. Este protocolo pode ser usado como um guia para experimentalistas que procuram utilizar pontos quânticos para estudar interações proteína-proteína e tráfico no contexto da fisiologia celular.
Introdução
A microscopia de fluorescência permite que os pesquisadores espiem o funcionamento interno da célula usando corantes especializados1, proteínas fluorescentes geneticamente codificadas2 e nanopartículas fluorescentes na forma de pontos quânticos (QDs)3. Para a síndrome respiratória aguda grave coronavírus de 2019 (SARS-CoV-2) pandemia global, pesquisadores têm usado microscopia de fluorescência para entender como o vírus interage com a célula tanto na membrana plasmática quanto no citoplasma. Por exemplo, os pesquisadores têm sido capazes de obter insights sobre a ligação da proteína SARS-CoV-2 Spi....
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Protocolo
A linha celular HEK293T usada neste estudo é uma linha celular imortalizada. Não foram utilizados indivíduos humanos ou animais neste estudo.
1. Cultivo de células e semeadura
- Dentro de um armário de biossegurança estéril, usando equipamentos de proteção individual (incluindo luvas de laboratório, jaleco e óculos de segurança), prepare o meio de cultura celular suplementando o Meio Águia Modificada (DMEM) de Dulbecco com 10% de soro bovino fetal (FBS), penicilina/estreptomicina (P/S) e 250 μg/mL G418.
- Para 500 mL de mídia, adicione 443,75 mL de DMEM, 50 mL de FBS, 5 mL de P/S e 1,25 mL de G418.
- ....
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Resultados
Após o tratamento, os QDs serão internalizados, pois a nanopartícula se ligará ao ACE2 na membrana plasmática e induzirá a endocitose. Usando uma linha celular de expressão ACE2-GFP, a translocação de QDs e ACE2 pode ser visualizada usando microscopia de fluorescência. Uma vez internalizados, os dois sinais QD e ACE2 mostram forte colocalização. A partir dessas imagens, a segmentação de imagens e a análise subsequente podem ser realizadas para extrair parâmetros relevantes, como contagem de pontos (F.......
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Discussão
O método descrito neste artigo fornece as etapas necessárias para a imagem de QDs funcionalizados em células humanas usando microscopia confocal de alta produtividade. Este método é mais adequado para células onde a endocitose é a principal rota de entrada viral em vez da atividade de TMPRSS2 e fusão de membrana, pois permite o estudo do SarS-CoV-2 Spike e hACE2 endocitose. Devido à natureza do modelo QD e da tag C-terminal No aparador spike comercialmente disponível, qualquer decote TMPRSS2 dos domínios Spike S1 e S2 de.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo Programa de Pesquisa Intramural do Centro Nacional de Promoção de Ciências Translacionais, NIH. O Laboratório de Pesquisa Naval forneceu financiamento através de seu Instituto interno de Nanociências. A preparação do reagente foi apoiada através do fundo base NRL COVID-19.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 32% Paraformaldeído | Microscopia Eletrônica Ciências | 15714 | Usado para fixação de células após tratamento de pontos quânticos, concentração final 3,2% < br / > Usado para estabilizar QDs em Optimem I e evitar interações não específicas, concentração final 0,1% |
| 7,5% Albumina de soro bovino | Gibco | 15260-037 | Usado como um corante de viabilidade celular para contagem de células de fluorescência |
| Laranja de acridina/mancha de iodeto de propídio | Logos Biosystems | F23001 | Placas de micropoços utilizadas para semear células e ensaios QD-Spike |
| Fundo transparente preto 96 placa bem revestida revestida com poli-D-lisina | Greiner | 655946 | Usado para apoiar a cultura celular, suplemento DMEM Soro |
| bovino fetal caracterizado | Cytiva/HyClone | SH30071.03 | Software de análise de imagem de alto conteúdo baseado em nuvem; V2.9.1 |
| Columbus Analyzer | Perkin Elmer | NA | Usado para marcar núcleos celulares e corpos celulares após fixação, corante nuclear vermelho escuro |
| DRAQ5 (5 mM) | ThermoFisher Scientific | 62252 | Meio basal para cultura de células HEK293T |
| Meio essencial mínimo de Dulbecco, D-glicose (4,5g/L), L-glutamina, piruvato de sódio (110 mg/L), vermelho de fenol | Gibco | 11995-065 | Usado para organizar dados após a exportação do Columbus; V2110 Microsoft 365 |
| Excel | Microsoft | NA | Usado para continuar a seleção de células positivas para hACE2-GFP, suplemento DMEM |
| G418 | InvivoGen | ant-gn-5 | Linha de células renais embrionárias humanas expressão estável enzima conversora de angiotensina humana 2 marcada com GFP |
| HEK293T hACE2-GFP | Codex Biosolutions | CB-97100-203 | Contador de células automatizado |
| Luna Contador de células automatizado | Logos Biosystems | NA | Usado para contagem de células de fluorescência |
| Lâminas de contagem de células Luna | Logos Biosystems | L12001 | Plataforma de imagem de alto conteúdo |
| Opera Phenix | Perkin Elmer | NA | Mídia de imagem, usada para incubar células com pontos quânticos |
| Opti-MEM I Meio de soro reduzido | Gibco | 11058-021 | Solução salina tamponada com fosfato sem cálcio ou magnésio usada para lavar células durante a passagem e ensaio |
| PBS -/- | Gibco | 10010-023 | Usado para prevenir a contaminação bacteriana da cultura de células, suplemento DMEM |
| Penicilina estreptomicina | Gibco | 15140-122 | Usado para gráficos, visualização de dados e análise estatística; V9.1.0 |
| Prism | GraphPad | NA | Usado para testar a ligação do SARS-Cov-2 Spike ao hACE2 e monitorar a endocitose do Spike |
| Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike) | feito sob medida pelo Laboratório de Pesquisa Naval | Usado para inibição da ligação do SARS-Cov-2 Spike ao hACE2 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Anticorpo neutralizador de pico, Mouse Mab | Sino Biological | 40592-MM57 | Usado para dissociar células do frasco durante a passagem |
| TrypLE Express | Gibco | 12605-010 |
Referências
- Chazotte, B. Labeling Lysosomes in Live Cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571(2011).
- Mehta, S., Zhang, J. Biochemical activity architectures visualized-using genetically encoded fluorescent biosensors t....
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Reimpressões e permissões
