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Research Article
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Desenvolvemos uma única plataforma para rastrear o comportamento animal durante duas tarefas de aprendizagem associativa dependentes de fibras. O design de baixo custo permite a integração com experimentos optogenéticos ou de imagem direcionados à atividade cerebelar associada à fibra.
As entradas de fibra de escalada para as células Purkinje fornecem sinais instrutivos críticos para o aprendizado associativo dependente do cerebelo. Estudar esses sinais em camundongos fixos na cabeça facilita o uso de métodos de imagem, eletrofisiológico e optogenético. Aqui, foi desenvolvida uma plataforma comportamental de baixo custo (~US$ 1000) que permite o rastreamento do aprendizado associativo em ratos fixos que locomotem livremente em uma roda de corrida. A plataforma incorpora dois paradigmas comuns de aprendizagem associativa: condicionamento de olho e condicionamento tátil retardado. O comportamento é rastreado usando uma câmera e o movimento da roda por um detector. Descrevemos os componentes e a configuração e fornecemos um protocolo detalhado para treinamento e análise de dados. Esta plataforma permite a incorporação de estimulação optogenética e imagens de fluorescência. O design permite que um único computador hospedeiro controle várias plataformas para treinar vários animais simultaneamente.
O condicionamento pavloviano da associação subcaída entre estímulos para obter uma resposta condicionada tem sido usado há muito tempo para sondar o aprendizado dependente de cerebelar. Por exemplo, no condicionamento clássico de desintegação (DEC), os animais aprendem a fazer um piscar de proteção bem cronometrado em resposta a um estímulo condicional neutro (CS; por exemplo, um flash de luz ou tom auditivo) quando é emparelhado repetidamente com um estímulo incondicional (EUA; por exemplo, um sopro de ar aplicado à córnea) que sempre provoca um reflexo piscando, e que vem no final ou perto do CS. A resposta aprendida é referida como uma resposta condicionada (CR), enquanto a resposta reflexa é referida como a resposta incondicionada (UR). Em coelhos, lesões específicas de cerebelo interrompem essa forma de aprendizado 1,2,3,4. Além disso, os picos complexos de células Purkinje, impulsionados por suas entradasde fibra de escalada 5, fornecem um sinal necessáriode 6,7 e 8,9 suficientes para a aquisição de CRs devidamente cronometrado.
Mais recentemente, paradigmas de aprendizagem associativa dependentes de fibras foram desenvolvidos para ratos com fixação de cabeça. O DEC foi o primeiro paradigma de aprendizagem associativa a ser adaptado a essa configuração10,11. DEC em camundongos fixos na cabeça tem sido usado para identificar regiões cerebelares 11,12,13,14,15,16,17 e elementos de circuito11,1 2,13,14,15,18,19 que são necessários para aquisição e extinção de tarefas. Essa abordagem também tem sido usada para demonstrar como a representação fisiológica de nível celular dos parâmetros de tarefa evolui com o aprendizado 13,15,16.
Além do eyeblink, o paradigma de condicionamento tátil de início de partida (DTSC) foi recentemente desenvolvido como uma nova tarefa de aprendizagem associativa para ratos fixos na cabeça20. Conceitualmente semelhante ao DEC, o DTSC envolve a apresentação de um CS neutro com um US, um toque no rosto suficiente em intensidade para engajar um reflexo de medo 21,22 como ur. No paradigma DTSC, tanto a UR quanto a CR são lidas como locomoção retrógrada em uma roda. O DTSC tem sido usado agora para descobrir como o aprendizado associativo altera a atividade cerebelar e os padrões de expressão genética20.
Neste trabalho, foi desenvolvido um método para aplicar de forma flexível o DEC ou DTSC em uma única plataforma. Os atributos de estímulo e plataforma são esquematizados na Figura 1. O design incorpora a capacidade de rastrear o comportamento animal com uma câmera, bem como um codificador rotativo para rastrear a locomoção do rato em uma roda. Todos os aspectos da estrutura de registro e ensaio de dados são controlados por microcontroladores emparelhados (Arduino) e um computador de placa única (SBC; Raspberry Pi). Esses dispositivos podem ser acessados através de uma interface de usuário gráfica fornecida. Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho para configuração, preparação e execução de experimentos e um pipeline de análise personalizado para visualização de dados.
Os protocolos animais descritos aqui foram aprovados pelos Comitês de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Princeton.
1. Configuração do SBC
2. Hardware de estímulo de fiação e estágio de montagem
3. Preparar e executar experimentos de comportamento
4. Exportar e analisar dados
Fluxo de trabalho para experimentos e análises de DEC
A seleção adequada de parâmetros experimentais é importante para o treinamento bem sucedido de condicionamento de de atmoscção (DEC). Para os dados aqui apresentados, a GUI foi utilizada para escolher uma duração CS de 350 ms e uma duração norte-americana de 50 ms. Essa combinação resulta em um intervalo de inter-estímulo de 300 ms: tempo suficiente para evitar a produção de CR de baixa amplitude10 e curto o suficiente para evitar entrar no regime de má aprendizagem ou condicionamento de traços, um processo que envolve regiões cerebrais adicionais11. O tempo entre os ensaios foi definido usando os campos baixo e alto iti para ser escolhido aleatoriamente uniformemente de uma faixa de 5-15 s. A randomização dos intervalos de inter-ensaio torna impossível que os sujeitos animais usem pistas de tempo que não o CS e os próprios EUA para o desempenho da tarefa.
Incluindo ensaios que omitem o CS ou EUA permite a avaliação da cinemática CR e UR mesmo em animais treinados. O usuário pode definir a proporção de ensaios nos quais CS e EUA são emparelhados ou apresentados isoladamente. Nos dados aqui apresentados, fizemos todas as sessões em ensaios 10% somente CS com ensaios emparelhados que constituem o resto e nenhum teste somente para os EUA. Observe que incluir um número excessivo de ensaios não pagos pode impactar negativamente o treinamento. Por exemplo, sessões com mais de 50% dos ensaios não pagos são comumente usadas para conduzir a extinção de CRs em animais treinados 19,26.
As condições de preparação e iluminação da câmera também são fundamentais para a aquisição de dados de alta qualidade. A taxa de quadros de aquisição pode ser ajustada no software de aquisição picamera. Nos dados aqui apresentados, estabelecemos uma taxa de quadros de 120 Hz para experimentos DEC. O módulo Picamera em si permite taxas de quadros de até ~200 Hz, mas descobrimos que taxas mais baixas evitam a perda de quadros e dão resolução temporal adequada para rastreamento das pálpebras. A luz infravermelha deve ser colocada para iluminar a pele periocular uniformemente sem criar reflexo excessivo da córnea quando o olho estiver aberto. A Figura 3A mostra uma imagem de amostra de uma sessão de gravação com iluminação aceitável. O software de aquisição picamera (picameraStream.py) foi projetado para fornecer configurações consistentes em uma sessão, configurando e segurando o balanço de branco da câmera e ganho com base nas condições de iluminação quando a câmera é inicializada.
Uma vez iniciada uma sessão comportamental, os dados da câmera e de outros componentes de hardware da plataforma serão automaticamente registrados. Os registros de dados são criados em um diretório nomeado pela data e entrada de valor para o campo de 800 800 animais na GUI. Os quadros da câmera e os carimbos de tempo para cada teste são armazenados em arquivos individuais que são nomeados usando o ID animal, data do experimento e número de teste. Os eventos da plataforma para cada sessão, incluindo velocidade da roda, partidas de teste, paradas de teste e tempo CS e US, são salvos como um único arquivo .txt.
Os dados transferidos para a máquina host podem então ser analisados conforme descrito na seção 4 do protocolo. A execução analyzeData.py em um diretório de destino criará um recipiente .npy para posição das pálpebras versus tempo para todos os testes em uma matriz baseada na análise dos arquivos da câmera. Este arquivo de contêiner é criado no diretório analisado. Uma vez que todas as sessões tenham sido analisadas para um determinado animal, todas as sessões podem ser alinhadas e concatenadas usando summarizeSessions.py. Os resultados de um animal treinado para 8 sessões de DEC são mostrados na Figura 3B. Além disso, os ensaios individuais podem ser renderizados como arquivos .mp4 visualizados usando o utilitário session2mp4s.py. Este utilitário imprime um quadrado no canto superior esquerdo do filme para indicar quando o CS e os EUA são aplicados. Os ensaios DE DEC de amostra preparados desta forma são apresentados lado a lado como Vídeo Suplementar 1. O painel esquerdo mostra um ensaio no qual o animal fecha seu olho com sucesso em resposta ao LED CS. No painel direito, o animal não pisca até que os EUA comecem.
Os animais treinados em DEC seguindo os protocolos da seção 3 e registrados com as considerações anteriores devem apresentar evidências claras de CRs bem cronometradas adquiridas gradualmente ao longo de vários dias de treinamento. Exemplos de traços comportamentais sem CRs em um animal não treinado e vestígios contendo CRs robustos de um animal treinado são apresentados na Figura 3B. Como esses traços mostram, animais ingênuos não devem mostrar nenhuma resposta ao CS, mas uma resposta robusta aos EUA. As RCs devem aumentar progressivamente em tamanho e frequência através de sessões comportamentais realizadas ao longo dos dias (Figura 3B-D). Em contrapartida, as condições de iluminação subótima limitam severamente a qualidade dos dados adquiridos. Quando o contraste entre o olho e a pele circundante é baixo (Figura 3E), pequenas alterações na imagem podem alterar significativamente a forma registrada da UR em uma única sessão e diminuir a relação sinal-ruído para detectar posição pálpebra (Figura 3F-G).
Para garantir gravações de pálpebras de alta fidelidade, a colocação ideal da fonte de luz é crítica. O LED de iluminação deve ser treinado diretamente no olho gravado. Se a colocação resultar em brilho excessivo na superfície da córnea, um difusor pode ser colocado sobre a matriz LED para reduzir esse efeito.
Fluxo de trabalho para experimentos e análises de DTSC
Muitas das considerações para seleção experimental de parâmetros são semelhantes entre o condicionamento de início tátil de atraso (DTSC) e o DEC. Aqui, vamos apontar aqueles que diferem. Nos dados de exemplo, a duração do CS DTSC foi definida como 250 ms com uma duração de 50 ms nos EUA. Este intervalo inter-estímulo mais curto foi escolhido para alinhar-se estreitamente com a duração mais curta descrita como ideal para o aprendizado DTSC20. Outros parâmetros de plataforma definidos através da GUI eram idênticos aos utilizados para o DEC.
A colocação adequada do estímulo tátil é fundamental para o aprendizado no DTSC. Montamos o estímulo tátil de tal forma que a extremidade da espuma esteja centrada ligeiramente acima do nariz do animal a uma distância de aproximadamente 1,5 cm quando na posição neutra. Uma vez montado, o estímulo pode ser virado à mão quando uma sessão não está em execução. Durante as sessões, o motor do estepe mantém o estímulo em um local preciso até que um US seja acionado. Para garantir que o posicionamento esteja correto, executamos uma sessão preparatória de cerca de três ensaios. Os eventos registrados no codificador rotativo são impressos na tela do terminal, e este printout pode ser usado para monitorar a amplitude dos URs animais em tempo real. Embora a amplitude máxima varie de ensaio para ensaio, animais com um máximo médio de ~40 contam com o codificador ao longo da sessão curta devem ter um bom desempenho na tarefa DTSC. Com base nas configurações de controle do codificador rotativo, esse valor corresponde a 24 cm/s, com um valor negativo indicando que o animal está se movendo para trás na roda.
A organização e a nomeação de arquivos produzidos no curso das sessões do DTSC são as mesmas produzidas em DEC. Running analyzeSession.py criará um recipiente .npy para velocidade de roda versus tempo para todos os testes em um array a partir da análise dos dados registrados no arquivo .csv. Uma vez que todas as sessões tenham sido analisadas para um determinado animal, todas as sessões podem ser alinhadas e concatenadas usando summarizeSession.py. Os resultados de um animal treinado para 5 sessões de DEC são apresentados na Figura 4A. Quanto ao DEC, as capturas da câmera do DTSC podem ser convertidas em arquivos .mp4 viável. Os ensaios de DTSC da amostra são mostrados lado a lado no Vídeo Suplementar 2. O painel esquerdo mostra um ensaio no qual o animal apoia com sucesso a roda em resposta ao LED CS. No painel direito, o animal não move a roda até que o estímulo tátil dos EUA seja aplicado.
O curso de tempo e amplitude em relação à UR de respostas em animais treinados no paradigma DTSC mostram semelhanças qualitativas com os treinados em DEC. Animais ingênuos não devem mostrar resposta ao CS, e aprender a mover a roda para trás em resposta ao CS somente após repetidas exposições ao CS emparelhado e eua. A frequência e amplitude das RCs aumentam à medida que o treinamento prossegue (Figura 4A,B). No caso do DTSC, descobrimos que a amplitude ur no início do treinamento é um bom preditor do sucesso da aprendizagem. Em uma coorte de animais treinados com um EUA que produziu URs de baixa amplitude (<20 cm/s), nenhum animal aprendeu a produzir consistentemente CRs após 4 dias de treinamento (Figura 4C,D).
Diferenças entre o treinamento dec e DTSC
O DEC e o DTSC diferem de maneiras importantes. Em primeiro lugar, o aprendizado do DTSC nesta plataforma ocorre mais rapidamente, com a maioria dos animais alcançando um alto grau de proficiência em tarefas até o terceiro dia de treinamento e desempenho assintotótico até o quinto dia. O aprendizado de DEC é mais lento para a maioria dos animais em pelo menos 3 dias. Em segundo lugar, o sistema DTSC incorpora a detecção automática de CRs bem sucedidas, que servem como um sinal de feedback para o aparelho para diminuir a amplitude do estímulo tátil. Este procedimento de treinamento imita o condicionamento dos olhos, no qual o melhor desempenho do CR fornece proteção parcial contra um sopro de ar córnea aversivo. Em contraste, os animais com cabeça fixa no paradigma DTSC são incapazes de se proteger do estímulo tátil apenas por sua resposta motora. Ao basear a amplitude dos EUA na presença de um CR, os animais têm a oportunidade de se proteger do estímulo aversivo.
Figura 1: Atributos da plataforma e design. (A) Elementos da plataforma para registrar o comportamento animal em condições fixas na cabeça. O mouse foi adaptado de uma imagem biorender. (B) Tempo e estímulos para condicionamento DEC e DTSC. Um intervalo inter-estímulo (ISI) definido pelo usuário determina quanto tempo dura apenas a época cs. As épocas CS e US são projetadas para co-terminar. (C) Imagem demonstrando colocação de elementos-chave da plataforma. 1) Motor stepper para o controle do DTSC US. 2) Roda de corrida para o animal. 3) Codificador rotativo para rastreamento do movimento da roda. 4) Espuma colada sobre um braço acrílico que serve como estímulo tátil DTSC. 5) LED CS. 6) Válvula e saída solenoide que fornece o DEC US. 7) Picamera para registro de comportamento animal. 8) LED infravermelho para iluminação do estágio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fiação de elementos de hardware de plataforma. (A) Diagrama de fiação de fritzing do hardware da plataforma quando totalmente montado. Os fios são coloridos por módulos com módulo laranja = Câmera; amarelo = módulo DEC US; azul = módulo LED CS; módulo roxo = DTSC US; verde = Módulo codificador rotativo. A picamera é excluída, mas se conecta à interface serial da câmera localizada na superfície do Raspberry Pi. As baterias indicam fontes de alimentação de corrente direta na tensão especificada. (B-F) Esquema de fiação equivalente para módulos isolados. Os fios foram recoloridos, de modo que o vermelho e o preto sempre indicam um trilho de abastecimento positivo e o solo, respectivamente, enquanto outros fios são coloridos para permitir fácil acompanhamento do circuito. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Resultados representativos do treinamento DEC. (A) Exemplo de quadro de câmera de uma sessão com condições aceitáveis de iluminação. Note o alto contraste entre o olho e a pele periocular. (B) Desempenho de um único animal durante as sessões realizadas ao longo dos dias no paradigma DEC. As linhas horizontais indicam desempenho em cada ensaio, com cores quentes indicando mais fechamento das pálpebras. A linha vertical preta mais à esquerda indica o início do CS, enquanto a linha pontilhada indica o início dos EUA. A segunda linha sólida indica a cessação do CS e dos EUA. Observe que o número de ensaios com respostas bem-sucedidas durante o CS aumenta em todas as sessões de treinamento. (C) Desempenho animal de (B) com traços individuais derivados da média de ensaio para a sessão a cada dia. A saturação da tonalidade indica número de sessão com maior saturação para sessões posteriores. (D) Desempenho para todos os animais do grupo DEC (n = 7). As linhas finas indicam a porcentagem de ensaios com um CR detectável de cada sessão para cada animal. As linhas grossas indicam que a sessão significa em todos os animais. (E) Exemplo de quadro da câmera de uma sessão com condições de iluminação abaixo do ideal. (F) Quantificação de ensaios únicos registrados com pouca iluminação. O UR é detectável, mas com menor contraste e maior variabilidade do que em condições de luz ideais. (G) Traços médios da sessão dos ensaios apresentados em (F). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Resultados representativos do treinamento DTSC. (A) Desempenho de um único animal durante as sessões realizadas ao longo dos dias no paradigma DTSC. As linhas horizontais indicam desempenho em cada ensaio, com cores quentes indicando movimento da roda traseira. A linha vertical preta mais à esquerda indica o início do CS, enquanto a linha pontilhada indica o início dos EUA. A segunda linha sólida indica a cessação do CS e dos EUA. (B) Desempenho animal de (A) com traços individuais derivados da média de ensaio para a sessão todos os dias. A saturação da tonalidade indica número de sessão com maior saturação para sessões posteriores. (C) Desempenho para todos os animais do grupo DTSC (n = 6). As linhas finas indicam a porcentagem de ensaios com um CR detectável de cada sessão para cada animal. As linhas grossas indicam que a sessão significa em todos os animais. (D) Ensaios únicos como em (A) de uma coorte onde a intensidade dos EUA provocou URs de baixa amplitude. (E) Traços médios de sessão apresentados como em (B) para os animais submetidos aos EUA fracos. (F) Desempenho para todos os animais em DTSC com EUA fracos (n = 6). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo suplementar 1: Teste de DEC e teste de erro. Os ensaios DEC são comparados no vídeo 1. Cada vídeo mostra ensaios em que o sujeito faz (Esquerda) ou não faz (Direita) o CR alvo sincronizado e jogado lado a lado para comparação. O LED CS acende quando o quadrado azul aparece no canto superior esquerdo de cada vídeo. O sinal de controle dos EUA está ativo quando um quadrado branco substitui o quadrado azul. Os sinais de controle CS e DOS EUA terminam quando o quadrado desaparece. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo suplementar 2: Amostra DTSC hit and miss trials. O vídeo 2 mostra a comparação do teste DTSC. Cada vídeo mostra ensaios em que o sujeito faz (Esquerda) ou não faz (Direita) o CR alvo sincronizado e jogado lado a lado para comparação. O LED CS acende quando o quadrado azul aparece no canto superior esquerdo de cada vídeo. O sinal de controle dos EUA está ativo quando um quadrado branco substitui o quadrado azul. Os sinais de controle CS e DOS EUA terminam quando o quadrado desaparece. Clique aqui para baixar este vídeo.
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Desenvolvemos uma única plataforma para rastrear o comportamento animal durante duas tarefas de aprendizagem associativa dependentes de fibras. O design de baixo custo permite a integração com experimentos optogenéticos ou de imagem direcionados à atividade cerebelar associada à fibra.
Este trabalho é apoiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde Mental NRSA F32 MH120887-03 (para G.J.B.) e R01 NS045193 e R01 MH115750 (para S.S-H.W.). Agradecemos aos Drs. Bas Koekkoek e Henk-Jan Boele por discussões úteis para otimizar a configuração do DEC e os Drs. Yue Wang e Xiaoying Chen por discussões úteis para otimizar a configuração do DTSC.
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