Method Article

In vitro Caracterização de Chaperones de Histonas utilizando Ensaios Analíticos, Pull-Down e Chaperoning

DOI:

10.3791/63218

⸱

December 29th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Life Sciences, 2Regional Centre for Biotechnology, 3School of Biotechnology, KIIT University, 4Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 5Department of Pharmacology, University of Vermont College of Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve uma bateria de métodos que inclui cromatografia analítica de exclusão de tamanho para estudar a oligomerização e estabilidade da histona chaperona, ensaio pull-down para desvendar interações histona-histona-histona, AUC para analisar a estequiometria dos complexos proteicos e ensaio de chaperoning de histonas para caracterizar funcionalmente uma suposta histona chaperone in vitro.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As proteínas histonas associam-se ao DNA para formar a cromatina eucariótica. A unidade básica da cromatina é um nucleossomo, composto por um octamero de histonas que consiste em duas cópias das histonas centrais H2A, H2B, H3 e H4, envolvidas pelo DNA. O octamero é composto por duas cópias de um dímero H2A/H2B e uma única cópia de um tetrâmero H3/H4. As histonas do núcleo altamente carregadas são propensas a interações inespecíficas com várias proteínas no citoplasma celular e no núcleo. As chaperonas de histona formam uma classe diversificada de proteínas que transportam histonas do citoplasma para o núcleo e auxiliam sua deposição no DNA, auxiliando assim o processo de montagem do nucleossomo. Algumas histonas acompanhantes são específicas para H2A/H2B ou H3/H4, e algumas funcionam como chaperonas para ambas. Este protocolo descreve como técnicas laboratoriais in vitro , como ensaios pull-down, cromatografia analítica de exclusão de tamanho, ultracentrifugação analítica e ensaio de chaperoning de histonas, podem ser usadas em conjunto para confirmar se uma determinada proteína é funcional como uma chaperona de histonas.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nucleossomos compostos de proteínas de DNA e histonas formam a unidade estrutural da cromatina e regulam vários eventos celulares críticos. Os nucleossomos são dinamicamente reposicionados e remodelados para tornar o DNA acessível a vários processos, como replicação, transcrição e tradução 1,2. As histonas altamente básicas tendem a interagir com proteínas ácidas no meio celular ou sofrem agregação, levando a vários defeitos celulares 3,4,5. Um grupo de proteínas dedicadas denominadas histonas chaperonas auxilia no transporte de histonas do citoplasma para o núcleo e previne eventos aberrantes de agregação histona-DNA 6,7. Fundamentalmente, a maioria das histonas acompanhantes armazena e transfere histonas para o DNA com força iônica fisiológica, auxiliando na formação de nucleossomos 8,9. Algumas histonas têm uma preferência definida pelos oligômeros de histonas H2A/H2B ou H3/H410.

As chaperonas de histona são caracterizadas com base em sua capacidade de montar nucleossomos dependentes ou independentes da síntese de DNA11. Por exemplo, o fator de montagem da cromatina-1 (CAF-1) é dependente, enquanto o regulador de histonas A (HIRA) é independente da síntese de DNA12,13. Da mesma forma, a família nucleoplasmina das histonas chaperonas está envolvida na descondensação da cromatina espermática e na montagem de nucleossomos14. Os membros da família da proteína de montagem de nucleossomos (NAP) facilitam a formação de estruturas semelhantes a nucleossomos in vitro e estão envolvidos no deslocamento de histonas entre o citoplasma e o núcleo15. As nucleoplasminas e as proteínas da família NAP são ambas chaperonas de histonas funcionais, mas não compartilham nenhuma característica estrutural. Essencialmente, nenhuma característica estrutural única permite a classificação de uma proteína como uma histona chaperona16. O uso de ensaios funcionais e biofísicos, juntamente com estudos estruturais, funciona melhor na caracterização de histonas acompanhantes.

Este trabalho descreve métodos bioquímicos e biofísicos para caracterizar uma proteína como uma chaperona de histonas que auxilia a montagem de nucleossomos. Primeiramente, foi realizada cromatografia analítica de exclusão de tamanho para analisar o estado oligomérico e a estabilidade das histonas chaperonas. Em seguida, um ensaio pull-down foi realizado para determinar as forças motrizes e a natureza competitiva das interações histona acompanhante-histona. No entanto, os parâmetros hidrodinâmicos dessas interações não puderam ser calculados com precisão usando cromatografia analítica de exclusão de tamanho devido à forma da proteína e seus complexos que afetam sua migração através da coluna. Para tanto, foi utilizada a ultracentrifugação analítica, que fornece propriedades macromoleculares em solução que incluem o peso molecular preciso, a estequiometria de interação e a forma das moléculas biológicas. Estudos anteriores utilizaram extensivamente o ensaio de chaperoning de histonas in vitro para caracterizar funcionalmente as chaperonas de histonas, como yScS116 17, DmACF18, ScRTT106p19, HsNPM120. O ensaio de chaperoning de histona também foi usado para caracterizar funcionalmente as proteínas como chaperonas de histonas.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Cromatografia analítica de exclusão de tamanho para elucidar o estado oligomérico e a estabilidade das chaperonas de histonas

  1. Análise do estado oligomérico das histonas chaperonas
    1. Equilibrar uma coluna de cromatografia analítica de exclusão de tamanho (SEC) de 24 mL com 1,2 volume de coluna (CV), ou seja, 28,8 mL de tampão SEC desgaseificado [20 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 300 de mM de NaCl e 1 mM de β-mercaptoetanol (β-ME)] a 4 °C (ver Tabela de Materiais).
      NOTA: O tipo de coluna, a composição do tampão e o pH do tampão podem ser selecionados com base na proteína de interesse. O volume de injeção da amostra não deve exceder 500 μL para uma coluna de 24 ml. Além disso, a pressão da coluna precisa ser mantida abaixo de 5 MPa.
    2. A partir de uma solução de reserva de proteína de maior concentração, preparar 500 μL de amostra de proteína de 0,5 mg/mL em tampão SEC desgaseificado e injetá-la na coluna pré-equilibrada usando um loop de injeção de 500 μL. Permitir que a cromatografia prossiga a um caudal isocrático de 0,2-0,3 ml/min com o tampão SEC a 4 °C.
    3. Monitorize o perfil de eluição da proteína medindo a absorvância a um comprimento de onda de 280 nm. Ao lidar com proteínas sem resíduos aromáticos, meça a absorvância a 214 nm.
    4. Utilizar o volume de eluição da proteína para calcular o seu peso molecular aproximado em kDa utilizando a curva de calibração padrão21.
      NOTA: A curva de calibração é preparada plotando o volume de retenção de proteínas de peso molecular conhecidas contra o log de seus respectivos pesos moleculares (log Mr), eluídas usando a mesma coluna.
  2. Análise da estabilidade térmica das chaperonas de histonas
    1. Tomar 500 μL de 0,5 mg/ml da amostra proteica preparada em tampão SEC desgaseificado (o mesmo utilizado no ponto 1.1.1) em tubos de microcentrífuga individuais e aquecer cada tubo a uma temperatura específica que varia entre 20 °C e 90 °C (20 °C, 40 °C, 60 °C e 90 °C) durante 10 minutos em banho-maria.
    2. Subsequentemente, centrifugar as amostras tratadas termicamente a 16.200 x g durante 10 min a 4 °C, recolher o sobrenadante com uma micropipeta e injectar cada amostra individualmente utilizando uma alça de injecção de 500 μL na coluna analítica, pré-equilibrada com o tampão SEC a 4 °C.
    3. Permitir que a cromatografia prossiga a um caudal isocrático de 0,2-0,3 ml/min com o tampão SEC a 4 °C.
    4. Observe a posição e a altura dos picos de eluição e procure o aparecimento de picos adicionais para as diferentes amostras.
  3. Análise da estabilidade química das chaperonas histonas
    1. Para examinar a estabilidade salina das chaperonas de histonas, incubar 500 μL de amostra de proteína de 0,5 mg/mL preparada em tampão Tris [20 mM de Tris-HCl (pH 7,5) e 1 mM de β-ME] suplementado com concentrações crescentes de NaCl (300 mM, 600 mM, 1 M, 1,5 M e 2 M) em tubos de microcentrífuga separados por 30 min a 4 °C. Centrifugar as amostras a 16,200 x g durante 10 min a 4 °C e reter o sobrenadante.
    2. Em seguida, carregar as amostras de proteína em diferentes concentrações de NaCl individualmente, usando um loop de injeção de 500 μL na coluna analítica pré-equilibrada com 1,2 CV (28,8 mL) do respectivo tampão contendo concentrações crescentes de NaCl a 4 °C.
    3. Permitir que a cromatografia prossiga a um caudal isocrático de 0,2-0,3 ml/min com 1 CV (24 ml) do respectivo tampão a 4 °C.
    4. Observe a posição e a altura dos picos de eluição e procure o aparecimento de picos adicionais para as diferentes amostras.
    5. Da mesma forma, para análise de estabilidade da ureia, incubar 500 μL de amostra de proteína de 0,5 mg/mL preparada em tampão Tris [20 mM de Tris-HCl (pH 7,5) e 1 mM de β-ME] suplementado com concentrações crescentes de ureia (1 M, 2 M, 3 M, 4 M e 5 M) em tubos microcentrífugos separados por 16 h à temperatura ambiente. Centrifugar as amostras a 16.200 x g durante 10 min à temperatura ambiente e reter o sobrenadante.
    6. Em seguida, carregue as amostras de proteína tratadas com ureia individualmente usando um loop de injeção de 500 μL na coluna analítica pré-equilibrada com 1,2 CV (28,8 mL) do tampão correspondente contendo diferentes concentrações de ureia à temperatura ambiente.
    7. Permitir que a cromatografia prossiga a um caudal isocrático de 0,2-0,3 ml/min com 1 CV (24 ml) do respectivo tampão à temperatura ambiente.
      CUIDADO: Não realize os experimentos com tampão contendo ureia a uma temperatura mais baixa, pois a ureia tende a cristalizar e danificar a coluna.
    8. Observe a posição e a altura dos picos de eluição e procure o aparecimento de picos adicionais para as diferentes amostras.

2. Ensaios pull-down baseados em gradiente de sal para entender o tipo de interações que contribuem para a formação complexa entre oligômeros de histonas e uma chaperona de histonas

  1. Para cada reação de ensaio pull-down, pipetar 40 μL de resina Ni-NTA em uma coluna de rotação e lavar com água estéril de dupla destilação. Posteriormente, equilibre a resina com 100 CV (4 mL) de tampão de equilíbrio [20 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 300 mM de NaCl, 10 mM de imidazol, 10 μg/mL de BSA e 1 mM de β-ME] (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: O pull-down também pode ser realizado em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  2. Preparar a amostra misturando 5 μM da chaperona de histona marcada com His com 20 μM de dímero H2A/H2B ou tetrâmero H3/H4 no tampão de equilíbrio. Incubar a amostra no gelo durante 1 h.
    NOTA: O dímero H2A/H2B e o tetrâmero H3/H4 são preparados a partir de histonas humanas recombinantes21, e a integridade dos oligômeros é confirmada com base nas massas moleculares estimadas por ultracentrifugação analítica (AUC). Os mesmos oligômeros de histonas foram usados para todos os experimentos mencionados abaixo.
  3. Carregar as amostras em colunas de rotação pré-equilibradas separadas com resina Ni-NTA a partir da etapa 2.1, cada uma rotulada para uma determinada concentração de sal, e manter as colunas durante 30 minutos a 4 °C. Centrifugar as colunas a 1000 x g durante 1 min.
  4. Em seguida, lave as colunas com 100 CV (4 mL) de tampão de lavagem [20 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM de imidazol, 0,2% de Tween-20 e 1 mM de β-ME] contendo diferentes concentrações de sal (ou seja, 300 mM, 500 mM, 600 mM, 700 mM, 800 mM, 900 mM e 1 M de NaCl). Lavar cada coluna com um tampão com uma concentração de sal específica.
  5. Após a etapa de lavagem salina, eluir a proteína das diferentes colunas usando 100 μL de tampão de eluição [20 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 300 mM de NaCl, 300 mM de imidazol e 1 mM de β-ME].
  6. Posteriormente, sujeitar as amostras eluídas a 18% de SDS-PAGE22 e visualizar o gel após coloração com Coomassie Brilliant Blue R250 (ver Tabela de Materiais). Alternativamente, você pode carregar diretamente a resina no gel SDS-PAGE em vez de eluír a proteína ligada da resina Ni-NTA.
    NOTA: As composições do tampão de equilíbrio, lavagem e eluição e o pH podem ser modificados dependendo da proteína de interesse.

3. Ensaio pull-down competitivo para identificar a preferência de uma chaperona de histonas por H2A/H2B ou H3/H4

  1. Preparar a coluna de rotação conforme descrito na etapa 2.1
  2. Incubar 5 μM da chaperona de histonas com 20 μM de dímero H2A/H2B em 300 μL de tampão de equilíbrio (preparado na etapa 2.1) por 30 min sobre gelo.
    NOTA: A proporção de oligômero de histona para chaperona de histona na reação pode ser escolhida com base em dados conhecidos de estequiometria de ligação; use cinco vezes mais histona em excesso se não houver informações disponíveis.
  3. Centrifugar o complexo histona chaperona-H2A/H2B a 16,200 x g durante 5 min a 4 °C para remover qualquer precipitado. Em seguida, carregar a amostra na coluna de rotação pré-equilibrada com tampão de equilíbrio (preparado na etapa 2.1) e incubar durante 30 minutos a 4 °C.
  4. Lavar a coluna com 100 CV (4 mL) de tampão de lavagem [20 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 300 mM de NaCl, 50 mM de imidazol, 0,2% de Tween-20 e 1 mM de β-ME] para remover o excesso de dímero H2A/H2B. Em seguida, misture o complexo histona chaperona-H2A/H2B com 20-60 μM de tetrâmero H3/H4 e incube por 30 min no gelo.
  5. Lavar novamente a coluna com 100 CV (4 ml) de tampão de lavagem (preparado na etapa 3.4) para remover qualquer tetrâmero H3/H4 não ligado e eluir a amostra utilizando tampão de eluição (preparado na etapa 2.5). Submeta as amostras eluídas a 18% de SDS-PAGE e visualize após a coloração com Coomassie Brilliant Blue R250.
    NOTA: O ensaio pode ser invertido em que, primeiro, o tetrâmero H3/H4 pode ser misturado com a chaperona, o complexo pode se ligar a contas de Ni-NTA e o complexo então ser incubado com concentrações variáveis de dímero H2A/H2B.

4. Experimentos analíticos de ultracentrifugação - velocidade de sedimentação (AUC-SV) para analisar a estequiometria de ligação entre chaperonas de histonas e histonas

  1. Preparação da amostra para AUC
    1. Dialise o dímero H2A/H2B de histona reconstituído, o tetrâmero H3/H4 e a chaperona de histona separadamente através de um tubo de diálise de corte de 7 kDa 23, contra um tampão de diálise [20 mM de Tris (pH 7,5), 300 mM de NaCl e 1 mM de β-ME] (ver Tabela de Materiais). Para minimizar o erro de fundo devido à incompatibilidade do tampão, realize diálise extensivamente contra o tampão de diálise, de preferência três vezes durante um período de 24 horas.
      NOTA: A OD 280 inicial das amostras de proteína deve ter um valor de duas a três vezes maior para alcançar uma OD280 final de 0,3-0,5. Isso é feito essencialmente para anular os efeitos da diluição.
    2. Purificar o dímero H2A/H2B, o tetrâmero H3/H4 e a chaperona de histonas individualmente com o tampão de diálise, utilizando cromatografia analítica de exclusão de tamanho (conforme mencionado na etapa 1). Salve o buffer da corrida para preparar diluições adicionais mais tarde e para usar como referência na célula AUC.
  2. Carregamento de amostra para AUC
    1. Misture as proteínas purificadas em um volume final de 450 μL usando tampão de diálise da etapa 4.1.1 para atingir um OD280 de 0,3-0,6. Misture a chaperona de histonas com o dímero H2A/H2B ou o tetrâmero H3/H4 para formação complexa em tubos de reação separados. Incubar as misturas de proteínas por 2-3 h.
      NOTA: Alternativamente, os dados de sedimentação podem ser adquiridos com um sistema de varredura óptica de interferência na ultracentrífuga analítica. Separadamente, para misturar proteínas purificadas, fixar a concentração de histona chaperona e incubá-la com concentrações crescentes dos oligômeros de histonas para obter a estequiometria exata.
    2. Montar a célula com uma peça central de setor duplo e janelas de quartzo para o experimento AUC-SV usando um detector de absorbância da ultracentrífuga analítica, conforme descrito anteriormente em detalhes24.
    3. Encher 400 μL da solução da amostra e 420 μL de tampão de diálise nos dois sectores (sectores da amostra e de referência, respectivamente) da célula.
      NOTA: Um volume maior de tampão é usado no setor de referência para manter o menisco de referência acima do menisco da amostra. No entanto, ao usar um sistema de interferência óptica, preencha os dois setores com o mesmo volume.
    4. Pese e equilibre com precisão as células e carregue-as em um rotor de titânio de quatro lugares (consulte Tabela de materiais). Alinhe as células usando as marcas fornecidas na parte inferior das células e do rotor. Carregue o rotor na centrífuga, feche a tampa e deixe desenvolver um vácuo até que a pressão caia para menos de 15 mícrons de Hg e a temperatura do rotor se estabilize para 20 °C (geralmente leva 2-2,5 h).
      NOTA: Os parâmetros de operação da AUC incluem temperatura experimental, velocidade do rotor, o intervalo entre as varreduras e o número de varreduras a serem coletadas. No caso de experimentos de SV, o intervalo de varredura é dado de acordo com a massa molecular da proteína; proteínas menores requerem intervalos de tempo maiores entre os exames. A velocidade do rotor também é definida de acordo com a massa molecular esperada da proteína, e o experimento é conduzido a 20 °C. Os dados de absorbância são monitorados a 280 nm.
    5. Para obter a estequiometria exata, mantenha a concentração de histona chaperona constante e incube com concentrações crescentes de oligômeros de histonas para atingir a saturação.
  3. Análise de dados AUC
    1. Realizar a análise dos dados conforme descrito anteriormente25. Resumidamente, calcule a densidade e a viscosidade dos componentes do buffer usando o programa SEDNTERP26 (consulte Tabela de Materiais). Da mesma forma, calcule o volume específico parcial da proteína com base em sua composição de aminoácidos, também usando SEDNTERP.
    2. Carregue os dados da máquina AUC no programa SEDFIT27 e defina o menisco (linha vermelha), a parte inferior da célula (linha azul) e os limites da análise de dados (linhas verdes). Escolha a distribuição C(s) contínua como modelo.
    3. Em seguida, defina a resolução máxima até 100; definir coeficiente(s) de sedimentação, s min: 0 e s max: 10-15; definir a razão de atrito para 1,2 inicialmente e optar por flutuar para derivar a razão dos dados; definir o nível de confiança (razão F; que determina a magnitude da regularização) para 0,68 para a regularização 1 sigma; definir valores parciais de volume específico, densidade do tampão e viscosidade do buffer obtidos do SEDNTERP.
    4. Pressione RUN para permitir que o software resolva a equação de Lamm27. Ajuste os parâmetros se houver uma incompatibilidade significativa de dados. Depois de ajustar os parâmetros, pressione FIT para refinar todos os parâmetros. Avalie a qualidade do ajuste com base no valor de desvio quadrado médio da raiz (RMSD), que deve ser inferior a 0,01 unidades de sinal.
    5. Estime as massas moleculares dos picos escolhendo a opção: mostrar o pico "Mw em c(s)" na função de exibição da barra de ferramentas principal, que fornecerá informações sobre os 's' da molécula/complexo.

5. Ensaio de superenrolamento plasmídico para confirmar a função de chaperoning de histonas

  1. Reação de montagem de nucleossomos
    1. Misture 2 μM de tetrâmero H3/H4 e 4 μM de dímero H2A/H2B com concentrações crescentes de chaperona de histona (1-6 μM) em um tampão de montagem [20 mM de Tris HCl (pH 7,5), 1 mM de TDT, 1 mM de MgCl2, 0,1 mg/mL de BSA e 100 mM de NaCl] até um volume final de 50 μL. Incubar a mistura a 4 °C por 30 min.
    2. Simultaneamente, numa reacção separada, pré-tratar 500 ng do plasmídeo pUC19 superenrolado negativamente com 1 μg de enzima topoisomerase I (ver Tabela de Materiais) no tampão de montagem num volume final de 50 μL e incubar a 30 °C durante 30 min.
      NOTA: A topoisomerase I relaxa o DNA plasmidial de fita dupla superenrolado gerando um nick de fita simples. Poderia ser utilizada uma enzima topoisomerase I de origem eucariótica, como a topoisomerase I do gérmen de trigo comercialmente disponível ou a Drosophila melanogaster topoisomerase I expressa de forma recombinante.
    3. Em seguida, combinar o tetrâmero H3/H4, o dímero H2A/H2B, a mistura de chaperona de histonas (a partir do passo 5.1.1), a mistura de reação de DNA plasmídico relaxado (a partir do passo 5.1.2) e incubar ainda mais a 30 °C durante 90 min.
      NOTA: Configure duas reações de controle para o ensaio; um com a histona chaperona e o DNA plasmidial relaxado (mas não as histonas) e o outro com os oligômeros de histonas e o DNA plasmidial relaxado (mas não a chaperona de histonas).
    4. Parar a reação de montagem adicionando 100 μL de tampão de parada 2x (40 mM de EDTA, 2% de SDS e 0,4 mg/mL de proteinase K) e incubar a 37 °C por 30 min.
      NOTA: O tampão Stop desproteiniza o DNA plasmidial por desnaturação e proteólise de histonas ligadas.
  2. Extração de fenol-clorofórmio e precipitação de etanol
    1. Adicionar um volume igual de fenol saturado de Tris no tubo que contém a mistura de reacção da etapa 5.1.4 e misturar bem, seguido de centrifugação a 16,200 x g durante 10 min à temperatura ambiente.
    2. Recolha suavemente a fase aquosa superior com o ADN plasmídico com uma micropipeta e misture com um volume igual de clorofórmio. Vórtice da mistura e centrifugar a 16.200 x g durante 10 min à temperatura ambiente.
      NOTA: O álcool isoamílico pode ser incluído nesta etapa para evitar uma interface difusa entre as fases aquosa e orgânica.
    3. Em seguida, coletar a fase aquosa superior, adicionar 1/10 volume de acetato de sódio 3 M (pH 5,5) e 2,5 volumes de etanol gelado (ver Tabela de Materiais). Misture bem a solução invertendo o tubo 3-4 vezes e mantenha a mistura num congelador de -20 °C durante 30 min para uma precipitação completa do ADN plasmídico.
    4. Centrifugar a amostra da etapa 5.2.3 a 16200 x g durante 10 minutos e rejeitar suavemente o sobrenadante. Mantenha os tubos abertos à temperatura ambiente até que até mesmo vestígios de etanol evaporem, deixando o DNA plasmidial precipitado no tubo.
  3. Realize a eletroforese em gel de agarose para observar o efeito de superenrolamento do plasmídeo.
    1. Dissolver o ADN plasmídico precipitado a partir da etapa 5.2.4 em água estéril de dupla destilação.
    2. Resolver as amostras com um gel de agarose a 1% em 1x tampão Tris-acetato-EDTA (TAE) (40 mM de Tris, 20 mM de ácido acético e 1 mM de EDTA) (ver Tabela de Materiais).
    3. Coloração do gel com concentração de 0,2-0,5 μg/mL de brometo de etídio e observar sob UV para visualizar as bandas de DNA no gel.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O domínio da nucleoplasmina N-terminal recombinante da proteína FKBP53 de Arabidopsis thaliana foi submetido à SEC analítica. O volume de pico de eluição foi plotado contra a curva padrão para identificar seu estado oligomérico. Os resultados analíticos da SEC revelaram que o domínio existe como pentâmero em solução, com massa molecular aproximada de 58 kDa (Figura 1A,B). Além disso, o domínio nucleoplasmina foi analisado quanto à estabilidade térmica e química em c...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho demonstra e valida um conjunto abrangente de protocolos para a caracterização bioquímica e biofísica de uma suposta histona acompanhante. Aqui, proteínas da família NAP recombinantemente expressas e purificadas, AtNRP1 e AtNRP2, e o domínio N-terminal nucleoplasmina de AtFKBP53 foram utilizados para demonstrar os protocolos. O mesmo conjunto de experimentos poderia muito bem ser usado para delinear os atributos funcionais de acompanhantes de histonas previamente descaracterizadas de qualquer organismo.

...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Não foi declarado qualquer conflito de interesses.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As subvenções extramuros a Dileep Vasudevan do Conselho de Pesquisa em Ciência e Engenharia, Governo da Índia [CRG/2018/000695/PS] e do Departamento de Biotecnologia, Ministério da Ciência e Tecnologia, Governo da Índia [BT/INF/22/SP33046/2019], bem como o apoio intramural do Instituto de Ciências da Vida, Bhubaneswar são muito reconhecidos. Agradecemos à Sra. Sudeshna Sen e à Sra. Annapurna Sahoo por sua ajuda com a preparação de histonas. As discussões com nossos colegas Dr. Chinmayee Mohapatra, Sr. Manas Kumar Jagdev e Dr. Shaikh Nausad Hossain também são reconhecidas.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ácido acético (glacial)SigmaA6283
AcrilamidaMP Biomedicals814326
AgaroseMP Biomedicals193983
AKTA Pure 25M FPLCCytiva29018226Instrumento para purificação de proteínas
Persulfato de amônio (APS)Rotor
An-60TiBeckman Coulter361964 Rotor para ultracentrifugação analítica
Albumina de soro bovino (BSA)SigmaA7030
ClorofórmioSigmaC2432
Coomassie azul brilhante R 250Sigma1.15444
Tubo de diálise (corte de 7 kDa)Thermo Fisher68700Para diálise de amostras de proteínas
Ditiotreitol ( DTT)MP Biomedicals100597
Corante de carregamento de DNANew England BiolabsB7025S
EDTA sal dissódicoMP Biomedicals194822
Balança eletrônicaShimadzuATX224R
EtanolSigmaE7023
Brometo de etídio (EtBr)SigmaE8751
Gel Doc SistemaBio-Rad12009077Para géis de imagem após coloração
Aparelho de eletroforese em gel horizontalBio-Rad1704405Instrumento para eletroforese em gel de agarose
Ácido clorídrico (HCl)Sigma320331
ImidazoleMP Biomedicals102033
Cloreto de magnésio (MgCl2)SigmaM8266
MicropipetasEppendorfZ683779Para pipetagem de microvolumes
Sistema de eletroforese Mini-PROTEANBio-Rad1658000Instrumento para SDS-PAGE
N,N-metileno-bis-acrilamidaMP Biomedicals800172
Nano dropThermo FisherND-2000Para medição de concentrações
Ni-NTA agaroseInvitrogenR901-15Grânulos de resina para ensaio pull-down
Ultracentrífuga analíticaOptima AUC Beckman CoulterB86437Instrumento para ultracentrifugação analítica
Medidor de pH MettlerToledoMT30130863
Fenol SigmaP4557
Kit de isolamento de plasmídeoQiagen27104
Proteinase KSigma-Aldrich1.07393
pUC19Thermo FisherSD0061Plasmídeo para ensaio de superenrolamento
Centrífuga refrigerada de alta velocidade ThermoFisher75002402
marcador de proteína SDS-PAGEBio-Rad1610317
SEDFITPrograma de software gratuito para dados analíticos de ultracentrifugação análise
SEDNTERPPrograma de software livre para estimar a viscosidade e densidade do tampão e volume específico parcial de uma proteína
SigmaPrep Spin ColumnsSigmaSC1000Para ensaio pull-down
Acetato de sódioSigmaS2889
Cloreto de sódio (NaCl)MerckS9888
Dodecil sulfato de sódio (SDS)MP Biomedicals102918
Superdex 200 Increase 10/300 GLCytiva28990944Coluna para cromatografia analítica de exclusão de tamanho
Superdex 75 Increase 10/300 GLCytiva29148721Coluna para cromatografia analítica de exclusão de tamanho
TEMEDSigma1.10732
Topoisomerase IInspiralisWGT102Enzima usada em ensaio de superenrolamento de plasmídeo
Base Tris MerckT1503
Tween-20SigmaP1379
UreiaMP Biomedicals191450
Banho-mariaNü veNB 5Para tratamento térmico de amostras de proteínas
β-mercaptoetanol (β-ME)SigmaM6250
Sigma A3678 de proteínas e DNA

References

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