Cesariana de modelo animal pré-clínico de corioamnionite desencadeada por estreptococos do grupo B (GBS)

Resumo

O objetivo deste protocolo é descrever um modelo animal pré-clínico de corioamnionite induzida por Streptococcus do grupo B (GBS). O estudo foi projetado para investigar processos mecanicistas, possíveis ligações causais com deficiências de desenvolvimento e, finalmente, desenvolver tratamentos anti-inflamatórios translacionais, placentos e neuroprotetores.

Resumo

O Streptococcus do grupo B (GBS) é uma das bactérias mais comuns isoladas durante a gravidez humana. É uma das principais causas de infecção/inflamação placentária, denominada corioamnionite. A corioamnionite expõe o feto em desenvolvimento a um alto risco de lesões orgânicas, morbidade e mortalidade perinatal, bem como deficiências neurocomportamentais ao longo da vida e outros problemas de desenvolvimento não neurológicos. Os dois subtipos mais frequentes de isolados de SGB de tecidos maternos e fetais são os sorotipos Ia (13%-23%) e III (25%-53%). Nosso laboratório desenvolveu e caracterizou um modelo de rato de corioamnionite induzida por GBS para estudar os impactos subsequentes no sistema nervoso central do feto em desenvolvimento e entender os aspectos mecanicistas subjacentes. Este artigo apresenta o design e os usos do modelo pré-clínico de ratos, que reproduz de perto a característica da corioamnionite induzida por GBS em humanos. Este artigo tem como objetivo ajudar os cientistas a reproduzir o projeto experimental, bem como fornecer suporte por meio de exemplos de solução de problemas. O presente modelo também pode contribuir para descobertas potenciais por meio da descoberta de causas, mecanismos e novas vias terapêuticas, que permanecem instáveis em muitas deficiências de desenvolvimento decorrentes da corioamnionite. Além disso, o uso desse modelo pode ser estendido aos estudos de morbidades perinatais não neurológicas comuns e graves que acometem, por exemplo, retina, intestino, pulmão e rim. O principal interesse desta pesquisa está no campo das deficiências do neurodesenvolvimento fetal induzidas por GBS, como paralisia cerebral (PC), transtorno de déficit de atenção e hiperatividade (TDAH) e transtorno do espectro autista (TEA). A justificativa que sustenta esse modelo é apresentada neste artigo, seguida de procedimentos e resultados.

Introdução

A ativação imune materna (MIA) tem sido descrita como um dos fatores de risco independentes mais críticos para parto prematuro, morte fetal e deficiências cognitivas e comportamentais ao longo da vida na progênie 1,2,3,4. Grande parte da pesquisa pré-clínica existente sobre o papel da inflamação gestacional nos resultados placentários e de desenvolvimento usa componentes patogênicos, como lipopolissacarídeo (LPS) de E. coli e o análogo sintético do RNA viral de fita dupla, poliinosínico: ácido policitidílico (Poli [I: C]), que imitam infecções virais. No entanto, embora o estreptococo do grupo B (SGB) seja a causa mais frequente de infecção perinatal, poucos modelos animais abordaram seu papel nos mecanismos inflamatórios em jogo e nos desfechos⁵.

O GBS é um coco gram-positivo encapsulado que coloniza o trato genital inferior em aproximadamente 15% a 30% das mulheres grávidas⁶. Leva à infecção/inflamação placentária, denominada corioamnionite ^7,8. Dos dez sorotipos de SGB, os dois sorotipos mais freqüentes Ia e III são os principais determinantes infecciosos de lesões em tecidos maternofetais ^9,10. A infecção por GBS demonstrou levar a uma maior resposta inflamatória na deficiência fetal de sangue e placenta, que são altamente suspeitas de estarem envolvidas em vários distúrbios do neurodesenvolvimento, como paralisia cerebral (PC), transtorno de déficit de atenção e hiperatividade (TDAH) e transtorno do espectro do autismo (TEA)^5,11.

Nos últimos dez anos, desenvolvemos um modelo de rato de corioamnionite induzida por GBS que leva a vários prejuízos de desenvolvimento na prole¹². Este modelo pré-clínico demonstra a ligação causal entre a inflamação placentária induzida por GBS e uma série de deficiências de neurodesenvolvimento específicas do sexo na prole 13,14,15. O objetivo deste artigo é fornecer aos leitores uma visão sobre o design de um modelo pré-clínico de rato de infecção gestacional no final da gestação e deficiências neurocomportamentais resultantes na prole. O presente protocolo visa mimetizar a realidade clínica da corioamnionite induzida por SGB.

Os resultados deste modelo pré-clínico mostram que a inoculação intraperitoneal (IP) no final da gestação (Figura 1) de GBS leva a (i) infecção e inflamação placentária, preenchendo os critérios diagnósticos de corioamnionite¹⁶; (ii) uma regulação positiva maciça de IL-1β e moléculas inflamatórias a jusante da via IL-1, dentro da placenta¹²; (iii) deficiências no desenvolvimento neurológico da prole¹²; (iv) diferenças sexuais nas respostas imunes e subsequentes deficiências neurocomportamentais, como prole feminina apresentando traços semelhantes ao TDAH adulto, enquanto os descendentes masculinos apresentam traços semelhantes ao TEA de início precoce e duradouro; (v) resultados neurocomportamentais distintos na progênie, dependendo do sorotipo de EGB usado para induzir a corioamnionite^14,15. De acordo com esses achados, os principais próximos passos utilizando este modelo serão testar, em primeiro lugar, o papel do andrógeno na corioamnionite induzida por GBS e, em segundo lugar, o papel placentário e neuroprotetor de moléculas direcionadas a vias inflamatórias específicas, na esperança de levar algumas dessas moléculas ao limiar de ensaios clínicos terapêuticos.

Protocolo

Todos os experimentos foram aprovados pelo Instituto de Pesquisa do Centro de Saúde da Universidade McGill (RI-MUHC). Todos os experimentos foram realizados de acordo com o Conselho Canadense de Cuidados com Animais.

1. Ratos Lewis grávidas

1. Obter ratos Lewis de fontes comerciais no dia gestacional (G)14. Alojá-los em um biotério apropriado (biotério RI-MUHC) em um ambiente controlado a 20-23 ° C com um ciclo claro/escuro de 12 h e acesso a água e comida ad libitum¹⁷.
2. Pesar as barragens diariamente para detectar qualquer comportamento de doença de G14 (ou seja, o dia da chegada) até G22 (ou seja, o dia da cesariana)

2. Crescimento bacteriano

1. No G18, prepare dois tubos de ensaio estéreis com 5 mL de caldo estéril de infusão de coração cerebral (BHI). Pegue uma pequena porção de estoque de bactérias congeladas (sorotipo capsular β-hemolítico Ia em BHI e glicerol^{14 a 15}%) de -80 ° C e adicione-o em tubos BHI de 5 mL (Figura 2).
2. Coloque os tubos no agitador (240 rpm) por 18 h a 37 °C.
3. Em G19, prepare uma solução a 3% de GBS em caldo BHI estéril, coletando 1,5 mL da solução incubada em 48,5 mL de caldo BHI estéril.
4. Colete 1,5 mL da solução de 3% GBS mais BHI em uma cubeta. Registar a absorção inicial como T₀ (densidade óptica (OD)_{600 nm}, utilizando um espectrofotómetro).
   NOTA: Um blank feito com caldo BHI estéril foi usado a cada vez para equilibrar o espectrofotômetro.
5. Colocar a solução a 3% na incubadora a 37 °C com agitação de 240 rpm durante aproximadamente 2 h.Verificar a absorção de 20 em 20 minutos após 2 h até atingir uma medida de absorvância entre 0,6 e 0,8 (OD_{600 nm}).
6. Depois de atingir a absorbância desejada, colete 20 mL de solução de GBS a 3% mais BHI e adicione-os a um tubo de 50 mL.
7. Centrifugue (1792 x g) as amostras a 4 ° C por 13 min e lave o GBS precipitado duas vezes com 20 mL de solução salina estéril a 0,9%.
8. Suspenda o GBS precipitado em 2 mL de solução salina estéril a 0,9%. Manter esta alíquota no gelo até ao momento da injecção.
9. Injetar (intraperitonealmente) o grupo controle com 100 μL de solução salina estéril a 0,9% e o grupo GBS com 100 μL de sorotipo β-hemolítico Ia GBS suspenso em solução salina estéril a 0,9%.
   NOTA: A dose injetada foi de 10^{a 8} unidades formadoras de colônias (UFCs) de GBS ou solução salina (para controle). A inoculação de 10⁸ UFC foi bem estabelecida como um modelo de corioamnionite humana. A inoculação com uma dose mais alta de GBS provavelmente causará mortalidade por barragens. Injetar menos do que a dose mencionada não imitará a infecção e a inflamação.
10. Fazer diluições entre ^10-5 e ^10-10 e colocar as diluições em triplicado em placas de ágar BHI. Para descartar a contaminação, faça dois controles negativos (sem qualquer adição de substância), um em uma placa de ágar BHI e outro em uma placa de ágar CHROMID Strepto B. Faça dois controles positivos colocando as bactérias preparadas na placa de ágar BHI e na placa de ágar CHROMID Strepto B. Coloque todas as placas na incubadora durante a noite a 37 °C (Figura 3).
    NOTA: As placas de ágar Strepto B CHROMID são um meio seletivo para triagem de GBS no qual as colônias de GBS aparecem em vermelho.

3. Técnica de injeção

1. No G19, remova o rato suavemente da gaiola e coloque-o em uma superfície plana. Imobilize o rato usando uma toalha para cobrir a cabeça e a parte superior do corpo. Levante a perna traseira para permitir um acesso fácil ao local da injeção.
   NOTA: Certifique-se de que a área anatómica apropriada para a injeção se encontra no quadrante inferior direito do abdómen para evitar a perfuração de órgãos como a bexiga urinária e o ceco (Figura 1).
2. Use uma seringa de insulina U-100 com uma agulha de 29 G 1/2 polegada. Insira o chanfro da agulha voltado para cima em direção à cabeça em um ângulo de 40-45° em relação à horizontal, conforme mostrado na Figura 1. Realize injeções de GBS uma vez para cada barragem. Certifique-se de realizar injeções a cada 1 h para evitar um efeito de tempo entre as barragens inoculadas.
   NOTA: As injeções devem variar entre os lados esquerdo e direito nos dias em que é realizada mais de uma injeção por dia.

4. Determinação da dose

1. No G20, verifique quatro controles (etapa 10.2) e conte as colônias bacterianas em cada placa de ágar BHI.
2. Calcular a média das colónias de GBS para cada factor de diluição (^10-5 a ^10-10) para determinar a dose exacta injectada de GBS

5. Cesariana e coleta de tecidos

1. Realizar cesarianas no G22 (72 h pós-injeção) e realizar cirurgias subsequentes com 1 h entre as barragens de acordo com o tempo de inoculação de cada barragem.
2. Anestesiar a barragem em câmara de eutanásia com isoflurano a 2% e 1,5% de O_2, para anestesia geral.
3. Coloque a barragem em uma almofada de aquecimento coberta com um curativo cirúrgico apropriado e aplique a pomada oftálmica no olho para evitar o ressecamento.
4. Prepare a área cirúrgica removendo os pelos da região abdominal inferior usando uma lâmina ou bisturi.
5. Limpe a área cirúrgica com gaze estéril embebida em desinfetante.
6. Usando um bisturi estéril e uma tesoura de ponta fina, faça uma incisão horizontal na parte inferior do abdômen do rato. Faça uma incisão vertical em ambos os lados do abdômen para revelar os órgãos subjacentes.
7. Separe amostras de placenta dos fetos. Registre os pesos dos fetos, placentas e a proporção feto/placenta.
8. Usando um bisturi estéril, corte a placenta em duas metades.
   1. Utilizar 2-metilbutano para congelar rapidamente metade da placenta e manter a -80 °C até à necessidade de determinação dos níveis de proteínas utilizando ELISA.
   2. Fixe a outra metade da placenta em formaldeído tamponado a 4% para análise in situ por imuno-histoquímica (IHQ) para estudar a expressão de GBS e células polimorfonucleares (PMNs) em placentas coletadas.
9. Decapite para coletar sangue de fetos vivos e transferir o sangue para tubos separadores de gel de heparina de lítio.
10. Centrifugar (18,928 x g) amostras de sangue a 4 °C para separar o plasma e armazenar as amostras de plasma a -80 °C até uma análise posterior.
    NOTA: As amostras de plasma sanguíneo fetal coletadas serão usadas para ELISA para verificar os níveis de proteína de diferentes citocinas no sangue do feto.
11. Coletar caudas fetais para determinar o sexo dos fetos por amplificação de uma sequência dentro do gene SRY, usando os seguintes primers (primer direto: 5' - TAC AGC CTG AGG ACA TAT TA3'; primer reverso: 5' - GCA CTT TAA CCC TTC GAT GA -3') conforme descrito anteriormente¹⁸.
12. Usando uma agulha de 5 mL 23 G, colete sangue da mãe por punção cardíaca para verificar e comparar os níveis de proteína de diferentes citocinas no sangue da mãe com as do sangue fetal. Eutanasiar as barragens pelo método de punção e decapitação do diafragma.
    NOTA: Entre os animais, limpe todos os instrumentos usados com tecido estéril e soro fisiológico estéril. Para a realização de estudos neuropatológicos e comportamentais na progênie, as mães deram à luz naturalmente no G23. Após a eutanásia da prole no dia pós-natal (NP) 80, os cérebros foram coletados para estudos moleculares e histológicos.

Resultados

A inoculação IP de GBS resultou em infecção placentária
A coloração por imuno-histoquímica (IHQ) (usando anticorpos policlonais direcionados ao sorotipo Ia do GBS) mostrou que a infecção por GBS atingiu o compartimento decidual da placenta. A infecção também se espalhou da decídua para o labirinto, placa coriônica e, em alguns casos, para fetos, levando à morte fetal (5,8 ± 0,8 em GBS expostos vs. 9,3 ± 0,6 filhotes em ninhadas de controle (CTL)¹⁸. Assim, o tamanho da ninhada d...

Discussão

Etapas críticas no protocolo
Várias etapas do protocolo são críticas e requerem alguns controles de qualidade. Por exemplo, existe o risco de contaminação do estoque de GBS por outros patógenos. Isso pode ser rapidamente identificado usando a técnica apropriada de identificação microbiana de GBS, como aspecto da colônia em ágar BHI (por exemplo, tamanho, forma, cor), plaqueamento em duplicata da dose de GBS β-hemolítico em ágar sangue Columbia com meio de sangue de ov...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo estéril de 5 mL	BD Biosciences
Tubos de falcão de 50 ml	Thermo Fisher	339652
Lâmina ou bisturi	BD Medical	371716
Brain Heart Infusion Critério de caldo	(diagnóstico Hardy)	C5141
Placa de ágar CHROMID Strepto B	BioMèrieux, Saint-Laurent	43461
Ágar Columbia 5% com meio de sangue de ovelha	Thermo Scientific	R01215
Primer dianteiro	5' - TAC AGC CTG AGG ACA TAT TA3'Sigma
Seringa de insulina	Becton, Dickinson and Co(BD)	324702
Lewis	ratos Charles River Laboratories
Metilbutano	Sigma Aldrich	M32631
Tubos de coleta de sangue Microtainer	Becton, Dickinson and Co(BD)	365965
Reverse primer	5' - GCA CTT TAA CCC TTC GAT GA -3'Sigma
Pipetas Sorológicas 1 ML	Thermo Fisher	170353N
Pipetas Sorológicas 10 ML	Thermo Fisher	170356N
Pipetas Sorológicas 25 ML	Thermo Fisher	170357N
Pipetas serológicas 5 ML	Thermo Fisher	170355N
Superfrost Plus Micro Slide, Premium	VWR	CA48311-703