Estudo de Projeto para Implementação para Desenvolvimento e Validação de Pacientes de Diagnósticos de Interruptores de Retenção de Pé Baseados em Papel

A RT-QPCR manteve-se como a tecnologia padrão-ouro para diagnósticos clínicos devido à sua excelente sensibilidade e especificidade. Embora altamente robusto, o método depende de equipamentos e reagentes caros e especializados que exigem distribuição e armazenamento com temperatura controlada. Isso apresenta barreiras significativas para a acessibilidade de diagnósticos de qualidade globalmente, particularmente em tempos de surtos de doenças e em regiões onde o acesso a laboratórios bem equipados é limitado ^1,2. Isso foi observado durante o surto do vírus Zika 2015/2016 no Brasil. Com apenas cinco laboratórios centralizados disponíveis para fornecer testes RT-qPCR, gargalos significativos resultaram, limitando o acesso ao diagnóstico. Isso foi especialmente desafiador para indivíduos em ambientes periurbanos, que foram mais severamente impactados pelo surto ^3,4. Em um esforço para melhorar o acesso aos diagnósticos, o protocolo mostra uma plataforma que foi desenvolvida com o potencial de fornecer diagnósticos descentralizados, de baixo custo e alta capacidade em ambientes com poucos recursos. Como parte disso, um pipeline de descoberta diagnóstica foi estabelecido, acoplando amplificação isotérmica e sensores sintéticos baseados em interruptores de RNA com sistemas de expressão livre de células baseados em papel ^5,6.

Os sistemas de síntese proteica sem células (CFPS), em particular os sistemas livres de células à base de E. coli, são uma plataforma atraente para uma ampla gama de aplicações de biossensoriamento, desde o monitoramento ambiental ^7,8 até o diagnóstico de patógenos 5,6,9,10,11,12 . Compreendendo os componentes necessários para a transcrição e tradução, os sistemas CFPS têm vantagens significativas sobre os biossensores de células inteiras. Especificamente, a detecção não é limitada por uma parede celular e, em geral, eles são modulares em design, biosseguros, baratos e podem ser liofilizados para uso portátil. A capacidade de congelar reações baseadas em circuitos gênicos em substratos, como papel ou têxteis, permite o transporte, o armazenamento a longo prazo à temperatura ambiente⁵ e até mesmo a incorporação em tecnologia vestível¹³.

Trabalhos anteriores demonstraram que sistemas livres de células de E. coli podem ser usados para detectar inúmeros analitos, por exemplo, metais tóxicos como mercúrio, antibióticos como tetraciclina 7,14, produtos químicos desreguladores endócrinos^15,16, biomarcadores como ácido hipúrico 17, moléculas de detecção de quórum associadas a patógenos ^9,18 e substâncias ilícitas como cocaína¹⁷ e gama-hidroxibutirato (GHB)¹⁹ . Para a detecção de ácidos nucleicos específicos por sequência, as estratégias dependeram, em sua maior parte, do uso de biossensores baseados em interruptores acoplados a técnicas de amplificação isotérmica. Os interruptores Toehold são riboreguladores sintéticos (também referidos simplesmente como "interruptores" no resto do texto) que contêm uma estrutura hairpin que bloqueia a translação a jusante, sequestrando o local de ligação ribossomal (RBS) e o códon inicial. Após a interação com o RNA de gatilho alvo, a estrutura do hairpin é aliviada e a tradução subsequente de um quadro de leitura aberto do repórter é habilitada²⁰.

A amplificação isotérmica também pode ser utilizada como diagnóstico molecular²¹; no entanto, esses métodos são propensos à amplificação inespecífica, o que pode reduzir a especificidade e, portanto, a acurácia do teste para abaixo da RT-qPCR ²². No trabalho aqui relatado, a amplificação isotérmica a montante dos sensores baseados em interruptor foi usada para fornecer amplificação de sinal combinada que permite a detecção clinicamente relevante de ácidos nucleicos (femtomolar a attomolar). Esse emparelhamento dos dois métodos também fornece dois pontos de verificação específicos da sequência que, em combinação, fornecem um alto nível de especificidade. Usando essa abordagem, trabalhos anteriores demonstraram a detecção de vírus como Zika⁶, Ebola⁵, Norovírus¹⁰, bem como bactérias patogênicas como C. difficile²³ e Typhoid resistente a antibióticos¹². Mais recentemente, os interruptores de retenção sem células foram demonstrados para a detecção de SARS-CoV-2 em esforços para fornecer diagnósticos acessíveis para a pandemia de COVID-19^11,12,13.

O protocolo a seguir descreve o desenvolvimento e a validação de um ensaio de interruptor de dedo sintético baseado em papel e livre de células para detecção do vírus Zika, desde o projeto de biossensores in silico , passando pelas etapas de montagem e otimização, até a validação de campo com amostras de pacientes. O protocolo começa com o projeto in silico de sensores baseados em interruptor de RNA e primers de amplificação isotérmica específicos para o RNA viral do Zika. Embora existam inúmeros métodos de amplificação isotérmica, aqui foi demonstrado o uso de amplificação baseada em sequência de ácido nucleico (NASBA) para aumentar a concentração de RNA viral alvo presente na reação, permitindo sensibilidade clinicamente significativa. Na prática, os métodos de amplificação isotérmica têm a vantagem de operar a uma temperatura constante, eliminando a necessidade de equipamentos especializados, como termocicladores, que geralmente são limitados a locais centralizados.

Em seguida, descreve-se o processo de montagem dos sensores sintéticos do interruptor do dedo do pé com sequências de codificação do repórter por meio da PCR de extensão de sobreposição e triagem dos sensores sintéticos do interruptor do dedo do pé para um desempenho ideal em sistemas livres de células usando RNA sintético. Para este conjunto de sensores do vírus Zika, selecionamos o gene lacZ que codifica a enzima β-galactosidase, que é capaz de clivar um substrato colorimétrico, clorofenol vermelho-β-D-galactopiranóssido (CPRG), para produzir uma mudança de cor amarela a roxa que pode ser detectada pelo olho ou com um leitor de placas. Uma vez que os interruptores sintéticos de alto desempenho são identificados, o processo de triagem de primers para amplificação isotérmica baseada em sequência de ácido nucleico da sequência alvo correspondente usando RNA sintético para encontrar conjuntos que fornecem a melhor sensibilidade é descrito.

Por fim, o desempenho da plataforma diagnóstica é validado in loco na América Latina (Figura 1). Para determinar a precisão do diagnóstico clínico, o ensaio sem células baseado em papel é realizado usando amostras do vírus Zika de pacientes; em paralelo, um ensaio de RT-qPCR padrão-ouro é realizado para comparação. Para monitorar ensaios colorimétricos livres de células, permitimos a quantificação no local dos resultados em regiões onde os termocicladores não estão disponíveis. O leitor de placas montado à mão chamado Portable, Low-Cost, User-friendly, Multimodal (PLUM; doravante referido como leitor de placas portátil) também é introduzido aqui²⁴. Inicialmente desenvolvido como um dispositivo complementar para diagnósticos de interruptores sintéticos sem células, o leitor de placas portátil oferece uma maneira acessível de incubar e ler resultados de maneira de alto rendimento, fornecendo análise de software integrada e baseada em visão computacional para os usuários.

Figura 1: Fluxo de trabalho para testar amostras de pacientes usando reações de interruptor de dedo do pé sem células baseadas em papel. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Todos os procedimentos que envolvam participantes humanos devem ser conduzidos de acordo com os padrões éticos e diretrizes relevantes, incluindo os princípios éticos para a pesquisa médica envolvendo seres humanos estabelecidos pela Declaração da Associação Médica Mundial de Helsinque. Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa com seres humanos sob o número de protocolo CAAE: 80247417.4.0000.5190. O consentimento informado de todos os pacientes incluídos neste estudo foi dispensado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Fiocruz-PE para amostras diagnósticas.

NOTA: O dispositivo PLUM será doravante referido como um "leitor de placas portátil".

1. Projeto computacional de primers de amplificação baseados em sequência de ácidos nucleicos

1. Escanear o genoma do Zika para identificar um conjunto de regiões candidatas à amplificação com aproximadamente 200 nucleotídeos (nt) a 300 nt de comprimento, colocando a sequência genômica no NCBI/Nucleotídeo BLAST^25,26. Compare o genoma com sequências de RNA de referência (refseq_rna) e procure locais que permaneçam altamente conservados e não tenham homologia com o genoma humano (outros parâmetros BLAST permanecem inalterados). Selecione pelo menos dois sites para projetar o interruptor sintético de retenção do dedo do pé.
2. Utilizar os critérios de seleção de Deiman et ^al.27 para gerar pares de iniciadores de amplificação baseados em sequência de ácidos nucleicos para frente e para trás para cada região de amplificação candidata. Em resumo, siga estes critérios para o desenho dos primers: (1) conteúdo de CG entre 40% e 60%; (2) 20 a 24 nt de comprimento com temperatura de fusão do ADN superior a 41 °C; (3) nenhuma corrida de quatro ou mais nucleotídeos idênticos; (4) o nucleotídeo final de 3' é uma base A; (5) estrutura secundária de baixo primer e probabilidade de formação de dímero. Tela de 8 a 10 pares de primer para cada região de destino (recomendado).
3. Anexar a sequência de prefixos contendo a sequência promotora T7 AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGG (T7 promoter sequence sublinhada) à extremidade 5' dos primers dianteiros para permitir a transcrição dos amplificadores usando T7 RNA polimerase (RNAP). Encomende os primers como oligos de DNA de uma empresa de síntese de DNA.

2. Projeto computacional de interruptores de dedo do pé

1. Instale o NUPACK²⁸ versão 3.2 (suíte de design de ácido nucleico) com base nas instruções no site²⁹. Use um sistema operacional UNIX e MATLAB (plataforma de computação numérica) como a linguagem de programação (recomendado).
2. Identifique as sequências-alvo (por exemplo, genoma viral) específicas para o patógeno de interesse para os projetos de interruptores de dedo do pé, conforme na etapa 1.1. Escolha as sequências-alvo do Zika a partir dos amplificadores baseados em sequência de ácido nucleico gerados na etapa 1.2.
   NOTA: Na prática, os primers de amplificação baseados em sequência de ácido nucleico ou os interruptores sintéticos de dedo do pé podem ser projetados e testados primeiro, dependendo das necessidades dos usuários. Se regiões-alvo específicas de interesse já tiverem sido estabelecidas (por exemplo, a partir de publicações existentes ou protocolos diagnósticos), o projeto e a triagem do interruptor de dedo do pé podem ocorrer primeiro, seguidos pelo projeto e triagem de iniciadores de amplificação baseados em sequência de ácidos nucleicos. Se não houver regiões-alvo estabelecidas, primeiro rastreie os primers de amplificação baseados em sequência de ácido nucleico contra o genoma completo para restringir os alvos de escolha, selecionando a eficiência da amplificação do primer. Se várias sequências para o patógeno estiverem disponíveis, é melhor projetar primers de amplificação baseados em sequência de ácido nucleico que se concentrem em regiões altamente conservadas (em vez de rastrear todo o genoma).
3. Baixe e instale o software MATLAB necessário no computador.
4. Configure as variáveis de ambiente para permitir que as funções do conjunto de design de ácido nucleico sejam chamadas no software. Para fazer isso, abra o software e, em seguida, abra (ou crie) um arquivo startup.m na pasta de trabalho padrão. Em seguida, copie as seguintes linhas de código no arquivo startup.m e, finalmente, adicione a pasta que contém os binários do conjunto de design de ácido nucleico ao PATH:
   NUPACKINSTALL = '/Usuários/[user_name]/.../nupack3.2.2';
   setenv('NUPACKINSTALL',NUPACKINSTALL);
   setenv('PATH',[getenv('PATH'),sprintf(':%s/build/bin',NUPACKINSTALL)]);
5. Abra o software da plataforma de computação numérica e navegue até a pasta do software de design. Execute os algoritmos de design acessíveis em https://github.com/AlexGreenLab/TSGEN.
6. Insira as sequências de destino no design_input_file.csv localizado na subpasta de entrada. As entradas incluem Nome, Sequência externa, Sequência interna, Temperatura, Nome de saída e Sequência de saída, conforme definido na Tabela 1. Se nenhum local de escorva ainda estiver determinado para o alvo, mantenha as sequências internas e externas iguais. Apenas os primeiros 29 nt do repórter serão considerados durante o processo de design. Quando terminar, salve e feche a planilha atualizada.
   NOTA: A sequência de saída é a sequência da proteína repórter planejada para ser usada para o ensaio (por exemplo, lacZ). Especificar as sequências interna e externa garante que o algoritmo não gerará interruptores sintéticos de dedo do pé que se sobreponham a qualquer um dos iniciadores. Também garante que o ensaio reconheça três locais únicos no genoma do Zika para melhorar sua especificidade.
7. Selecione os parâmetros a serem usados para a função de design: toehold_switch_design_run(num_designs,input_file, options). Preencha os valores dos parâmetros como:
   1. num_designs - o número de projetos superiores para cada saída de destino pelo software. O padrão é 6 e pode ser alterado conforme necessário (recomenda-se um mínimo de seis designs para cada destino).
   2. input_file - esse parâmetro especifica o nome do arquivo que fornece as informações da sequência de entrada. O valor padrão é 'design_input_file.csv' e pode ser alterado conforme necessário.
   3. Escolha entre as seguintes opções - (1) SeriesA e SeriesB: a(s) versão(ões) do comutador de retenção de dedo do pé que o código gerará. Defina a Série B como 1 e a Série A como 0 para gerar o interruptor de retenção do pé da série B, que é o formato usado no diagnóstico do vírus Zika⁶; (2) Paralelo: definido como 1 para aproveitar vários núcleos para calcular os projetos; caso contrário, defina como 0; (3) Antisense: definido como 1 para gerar interruptores de dedo do pé que hibridizam a sequência antisense (ou seja, o complemento reverso) da entrada alvo; caso contrário, defina como 0.
8. Execute a função de design usando os parâmetros selecionados: toehold_switch_design_run(num_designs,input_file,options). O algoritmo começará então a gerar os designs de interruptores de dedo do pé para os alvos de interesse.
9. Após a conclusão do projeto, localize as sequências de design do interruptor de dedo do pé superior e as sequências de destino correspondentes na pasta final_designs na forma de planilhas de formato .csv. As sequências de DNA do interruptor do dedo do pé geradas pelo algoritmo conterão a sequência promotora T7 na extremidade 5' e a sequência de ligador conservada de 21 nt AACCTGGCGGCAGCGCAAAAG na extremidade 3'.
10. Filtre as sequências de design do interruptor de dedo superior resultantes contra outros vírus comuns, colocando-as no NCBI-BLAST e verificando a homologia da sequência. Aceite sequências com 40% de homologia ou menos.
11. Ordene as sequências de hairpin do interruptor do dedo do pé como oligos de DNA e depois monte-as com o gene repórter em interruptores totalmente funcionais. Encomende os primers de PCR necessários para a montagem subsequente do sensor, dependendo da proteína repórter de escolha.

Tabela 1: A definição de cada parâmetro utilizado no software toehold switchdesign.

3. Construção de interruptores de apoio por PCR

Observação : estas etapas descrevem a construção de switches de retenção de dedo do pé LacZ por PCR de extensão de sobreposição. Aqui, o oligo de DNA é usado como um primer para a frente e o terminador T7 é usado como um primer reverso. Usamos o plasmídeo pCOLADuet-LacZ como um modelo para o gene lacZ (addgene: 75006). Quaisquer outros modelos de DNA que contenham a sequência correspondente podem ser usados como modelos, desde que o terminador T7 seja incluído na construção final.

1. Uma vez que os oligos de DNA sintético tenham sido recebidos do fornecedor comercial, prepare soluções do DNA sintético e do primer de amplificação reversa a uma concentração de 10 μM em água livre de nuclease. Montar reações em tubos de PCR sobre gelo de acordo com a Tabela 2.
   NOTA: Os volumes de PCR podem ser dimensionados conforme necessário. Use uma quantidade mínima (0,1-1 ng) de molde de DNA pCOLADuet-LacZ para evitar a necessidade de uma etapa adicional de remoção de plasmídeo ou sinal LacZ de fundo. Para quantidades mais altas de molde de DNA, siga a PCR com um digesto de enzima de restrição DpnI para remover o modelo de plasmídeo residual.
2. Colocar as reações em um termociclador, seguindo as condições de ciclagem listadas na Tabela 3. Analise os produtos de PCR em um gel de agarose (Figura 2; ver Protocolo Suplementar e³⁰).
3. Purifice os produtos de PCR usando um kit de purificação de PCR baseado em coluna de spin e elimine o DNA em 15-30 μL de água livre de nuclease, de acordo com as instruções do fabricante. Quantifique o DNA usando um espectrofotômetro.

Tabela 2: Os componentes de PCR usados para construir interruptores de retenção de dedo do pé.

Tabela 3: Condições de ciclagem utilizadas durante a construção de interruptores de apoio por PCR.

4. Preparação do alvo de RNA sintético (Trigger)

1. Usando um software de design de biologia molecular, modifique os modelos sintéticos de RNA de gatilho (selecionados na etapa 1.1) para incluir uma sequência promotora T7 a montante, garantindo que o modelo completo permaneça curto (<200 pb). projete primers para frente e trás amplificar o primer de sequência gatilho (para sequências oligo, consulte Protocolo Suplementar).
2. Ordene as sequências como oligos de DNA. Uma vez recebidos, reconstituem o DNA de gatilho sintético e os primers de amplificação a 10 μM em água livre de nuclease. Montar as PCRs correspondentes em tubos de parede fina sobre gelo de acordo com a Tabela 2 e usar 0,5 μL do ultramero de DNA desencadeante (concentração final de 0,1 μM) como DNA modelo.
3. Coloque as reações em um termociclador e use as condições de ciclagem listadas na Tabela 3. Use um tempo de extensão de 15 s. Avaliar a qualidade e purificar os produtos de PCR de gatilho, conforme descrito na etapa 3.3 e no Protocolo Suplementar.
   NOTA: Para agilizar o processo, os produtos de PCR de gatilho purificados por coluna também podem ser usados diretamente para a triagem inicial do interruptor de retenção do dedo do pé.

5. Transcrição in vitro de sequências de gatilho selecionadas

1. Montar os componentes da reação no gelo de acordo com a Tabela 4.
2. Incubar reações de transcrição invitro (TVI) a 37 °C durante 4 h, seguidas de tratamento com DNase I para remover o ADN modelo. Para a etapa DNase I, adicionar 70 μL de água livre de nuclease, 10 μL de 10x DNase I Buffer e 2 μL de DNase I (livre de RNase) e incubar a 37 °C por 15 min. Se não prosseguir para a etapa 5.4 imediatamente, inative a DNase I com a adição de 50 mM EDTA e inativação por calor a 65 °C por 10 min.
3. Etapa opcional: Realizar a eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante (por exemplo, ureia-PAGE) nos produtos IVT para avaliar a qualidade do RNA, conforme descrito no Protocolo Suplementar.
4. Purifice os produtos IVT de gatilho usando um kit de limpeza de RNA baseado em coluna de acordo com as instruções do fabricante e, em seguida, quantifique a concentração e a pureza do RNA usando espectrofotometria. Consulte Protocolo Suplementar para obter instruções sobre como determinar a molaridade e o número de cópia/μL do RNA.

Tabela 4: Transcrição in vitro (TVI) de sequências de gatilho selecionadas.

6. Rastreio inicial dos interruptores

NOTA: Esta seção descreve as etapas associadas à configuração de reações de interruptor de retenção de dedo do pé sem células e como rastrear interruptores de retenção de dedo do pé de alto desempenho. O papel de filtro bloqueado pela BSA utilizado no passo 6.10 deve ser preparado com antecedência, conforme descrito no Protocolo Suplementar.

1. Preparar uma solução-mãe de CPRG dissolvendo 25 mg do pó em 1 ml de água isenta de nuclease. Mantenha a solução no gelo em todos os momentos e armazene a -20 °C para uso a longo prazo.
2. Determine o número de reações a serem configuradas. Para cada interruptor de dedo avaliado, inclua um controle sem modelo (sem interruptor e sem RNA de destino - também conhecido como controle isolado livre de células) para explicar qualquer sinal de fundo que possa surgir da mixagem principal. Inclua um controle somente de interruptor para avaliar o vazamento do interruptor de fundo ou a taxa de OFF na ausência de RNA alvo.
3. Montar uma mistura mestre de reação livre de células da solução A, solução B, inibidor de RNase e CPRG no gelo de acordo com o protocolo padrão listado na Tabela 5.
   NOTA: As etapas descritas aqui são para uma mistura mestre que será suficiente para um conjunto triplicado de reações de 1,8 μL com volume adicionado de 10% para explicar o erro de pipetagem. O volume da mistura principal deve ser ajustado conforme necessário, dependendo do número de interruptores de retenção de dedo do pé examinados.
4. Para cada reação triplicada livre de células, dispense a mistura mestra em um tubo de PCR, mantendo todos os tubos no gelo. Para o tubo reservado como controle isolado livre de células, adicione água livre de nuclease a um volume final de 5,84 μL, misture pipetando para cima e para baixo e centrifugar brevemente. Para o restante dos tubos, adicione o DNA do interruptor de dedo do pé purificado por PCR a uma concentração final de 33 nM.
5. Para tubos reservados como controles de interruptor sozinhos, adicione água livre de nuclease a um volume final de 5,84 μL. Para os tubos reservados para testar o interruptor de apoio e a combinação de ARN alvo, adicionar ARN-alvo transcrito in vitro a uma concentração final de 1 μM. Em seguida, adicione água livre de nuclease a um volume final de 5,84 μL. Misture todas as reações completamente pipetando para cima e para baixo e centrifugar brevemente.
6. Adicione 30 μL de água livre de nuclease aos poços que cercam os poços de reação em uma placa de fundo transparente e preta de 384 poços. Isso minimiza a evaporação ao longo do experimento e melhora a reprodutibilidade.
   NOTA: Se estiver usando o dispositivo leitor de placas portátil, coloque uma folha de PCR sobre a placa e use uma faca de precisão para cortar os poços destinados à sua reação, bem como cada um dos quatro poços de canto. A folha de PCR evita a superexposição da câmera leitora de placas portátil de poços vazios.
7. Usando um punção de biópsia de 2 mm e uma pinça, corte os discos de papel de filtro bloqueados por BSA e coloque-os nos poços de reação, ejetando o punção ou usando pinças (consulte Protocolo Suplementar para preparar papel de filtro bloqueado por BSA). Dispensar triplicar volumes de 1,8 μL de cada tubo de reação nos discos de papel de filtro na placa de 384 poços, mantendo todas as amostras, bem como a placa de 384 poços, no gelo em todos os momentos.
   NOTA: Se estiver usando o dispositivo leitor de placas portátil, adicione 1,8 μL de CPRG (0,6 mg/mL) a cada um dos quatro cantos da placa de 384 poços. A cor amarela do CPRG fornece reconhecimento de padrões para o leitor de placas portátil para alinhamento do modelo de placa digital de vários poços na análise de imagens. Cubra os poços da placa com filme de PCR para evitar a evaporação.
8. Coloque a placa num leitor de placas, leia OD₅₇₀ a 37 °C a cada minuto durante 130 minutos.

Tabela 5: Componentes da reação de transcrição-tradução livre de células PURExpress.

7. Identificando interruptores de retenção de alto desempenho

Observação : esta seção descreve como analisar dados da etapa 6 para selecionar as opções de melhor desempenho para avançar.

1. Inicie a análise de dados primeiro normalizando para a absorvância OD₅₇₀ em segundo plano. Para fazer isso, subtraia as medições OD 570 de reações que não têm nenhum interruptor ou RNA alvo (ou seja, poços isolados livres de células) das outras medições do OD₅₇₀.
2. Suavize os dados normalizados usando uma média móvel de três pontos e ajuste o valor mínimo de cada poço a zero. Consulte a Figura 3 para obter um exemplo de dados normalizados de curso de tempo coletados para os switches de retenção 27B, 33B e 47B.
3. Usando esses dados processados, calcule a mudança de dobra (ou relação ON/OFF) determinando a diferença na taxa de mudança de cor (ou seja, mudança no OD₅₇₀ ao longo do tempo) entre o interruptor de retenção e os poços de destino e interruptor sozinhos (consulte Protocolo Suplementar para calcular a proporção; Figura 4).
4. Selecione os interruptores com a maior mudança de dobra ON/OFF para caracterização adicional. Omita os interruptores de retenção de dedo do pé com baixo desempenho que exibem a menor troca de dobra.

8. Triagem e sensibilidade do primer de amplificação baseado em sequência de ácidos nucleicos

NOTA: Nas etapas a seguir, primeiro uma tela para iniciadores de amplificação isotérmica funcional é feita e, em seguida, sua sensibilidade é avaliada determinando o número de cópias de RNA alvo por μL de RNA sintético que um determinado interruptor de retenção de dedo do pé pode detectar de forma confiável quando acoplado à amplificação isotérmica. Após a amplificação isotérmica, realize reações livres de células para identificar conjuntos bem-sucedidos de iniciadores de amplificação baseados em sequência de ácidos nucleicos. No entanto, pode ser mais econômico executar géis de poliacrilamida ou agarose em reações de amplificação baseadas em sequência de ácido nucleico para primeiro estreitar o conjunto de conjuntos de iniciadores candidatos. Nesse caso, os conjuntos de iniciadores de amplificação baseados em sequência de ácidos nucleicos que geram uma banda no gel no tamanho apropriado do amplificador podem ser pré-selecionados para triagem subsequente sem células.

1. Fazer uma solução-mãe de 25 μM de todos os conjuntos de iniciadores para a frente e para trás em água isenta de nuclease (ver Protocolo Suplementar). Determine o número de reações de amplificação baseadas em sequência de ácidos nucleicos e reações subsequentes livres de células que precisam ser configuradas. Isso dependerá do número de interruptores de apoio e respectivos conjuntos de primer.
   NOTA: Ao examinar os primers, é importante sempre incluir um controle sem modelo para cada conjunto de primer para levar em conta quaisquer artefatos de plano de fundo que possam surgir devido à amplificação inespecífica associada ao primer.
2. Configure uma reação de 5 μL da seguinte forma (dimensione-a conforme necessário). Descongele todos os reagentes no gelo. Monte uma mistura mestre de reação do tampão de reação, mistura de nucleotídeos e inibidor de RNase de acordo com a Tabela 6. Misture bem pipetando para cima e para baixo até que o precipitado branco seja solubilizado e, em seguida, distribua alíquotas em tubos de PCR.
   1. Se a mistura principal for para a triagem de primers de amplificação baseados em sequência de ácido nucleico, exclua os primers da mistura mestre no início (dispense 2,55 μL de master mix). Caso contrário, se for realizada a análise de sensibilidade do primer, os primers podem ser incluídos na master mix (caso em que dispensam alíquotas de 2,75 μL). Adicione a mistura enzimática após as etapas de desnaturação e equilíbrio.
3. Se os primers de amplificação baseados em sequência de ácido nucleico de triagem, adicione os primers para frente e para trás aos tubos apropriados. Em um termociclador, configure o protocolo de incubação conforme descrito na Tabela 7.
4. Adicione 1 μL de água livre de nuclease ou 1 μL de RNA de gatilho alvo a 2 pM ou aproximadamente 10⁶ cópias/μL, certificando-se de rotular os tubos de acordo. Misture suavemente pipetando e gire brevemente os tubos.
   NOTA: Para a triagem do conjunto de iniciadores, use uma concentração de RNA de gatilho alvo que seja alta o suficiente para não colidir com o limite inferior de detecção do método de amplificação isotérmica, mas não alta o suficiente para fornecer ativação do interruptor de retenção se nenhuma amplificação ocorrer.
5. Mova os tubos para o termociclador e inicie a incubação. Após 12 min, retire os tubos e adicione 1,25 μL da mistura enzimática a cada tubo. Misture pipetando para cima e para baixo e centrifugar brevemente os tubos.
   NOTA: Neste ponto, os tubos podem ser mantidos à temperatura ambiente; no entanto, a mistura enzimática deve ser mantida no gelo até ser adicionada aos tubos.
6. Devolva os tubos ao termociclador, ignorando a etapa de retenção de 41 °C para iniciar a incubação da reação de 1 h.
   NOTA: Após a incubação, as reações podem ser colocadas no gelo para processamento no mesmo dia ou congeladas a -20 °C para processamento posterior.
7. Siga as etapas 6.2-6.7 e a Tabela 8 para montar as reações de interruptor de dedo do pé sem células à base de papel para avaliar o desempenho do primer. Analise os dados conforme descrito nas etapas 7.1-7.2 e na Figura 3.
   NOTA: Além dos controles mencionados anteriormente, é importante incluir também o controle negativo para explicar qualquer sinal de fundo que possa surgir da reação. Além disso, é importante incluir também um controle com o interruptor e 2 pM (concentração final) do RNA alvo, como um controle de amplificação sem NASBA.
8. Identifique os pares de primer candidatos para avançar com a análise de sensibilidade. Os pares de iniciadores são selecionados com base no fato de a ativação do interruptor de retenção ocorrer após a adição da reação incubada. Se necessário, repita a tela do primer com mais combinações de primer.
9. Mantendo as amostras de RNA no gelo em todos os momentos, faça o seguinte conjunto de diluição serial de RNAs alvo em água livre de nuclease: 10⁴, 10³, 10 2, 10¹ e 10⁰ cópias de RNA/μL. Repita a amplificação baseada em sequência de ácido nucleico e as reações livres de células com os conjuntos de primer selecionados (etapas 8.2-8.7), testando a série de diluição em série para identificar os conjuntos de primer que fornecem a melhor sensibilidade. Consulte a Figura 5 para obter um exemplo de resultados para determinar a sensibilidade do conjunto de iniciadores.
   NOTA: Idealmente, o interruptor de retenção do dedo selecionado e o par de iniciadores devem detectar apenas 1-100 cópias de RNA alvo por μL do RNA (concentração de solução de estoque).
10. Repita o experimento de sensibilidade de amplificação baseado em sequência de ácidos nucleicos em triplicado biológico. Esta etapa serve para confirmar a reprodutibilidade dos resultados antes de passar para experimentos com amostras de pacientes.
11. Opcional: Para ter uma fonte confiável do DNA do interruptor para uso a longo prazo e para transporte, clone a(s) sequência(s) de interruptor selecionada(s) em um plasmídeo usando qualquer método de clonagem convencional. Da mesma forma, a sequência de RNA de gatilho alvo também pode ser clonada em um plasmídeo de escolha para armazenamento.

Tabela 6: Componentes da reação NASBA.

Tabela 7: Condições de reação para o NASBA.

Tabela 8: Componentes de reação sem células à base de papel.

9. Coleta de amostras de pacientes e extração de RNA viral

NOTA: Esta seção descreve o protocolo para coletar amostras de pacientes e extrair o RNA usando um kit de purificação de RNA. O protocolo abaixo é usado para obter soro do sangue periférico. As amostras utilizadas neste estudo foram coletadas de pacientes com febre, exantema, artralgia ou outros sintomas relacionados à infecção por arbovírus no estado de Pernambuco, Brasil.

1. Coletar amostras de sangue periférico de pacientes suspeitos de infecção por arbovírus. Realizar punção venosa (tubo de sangue total) usando uma técnica asséptica padrão. Rotule os tubos de amostra com um código anônimo e a data de coleta da amostra.
2. Centrifugar o sangue para separar o soro a 2.300 x g durante 10 minutos. Usando uma pipeta, prepare alíquotas de soro (200 μL) que serão usadas para extração de RNA em tubos de 1,5 mL.
   NOTA: Se não for possível efectuar a extracção de ARN logo após a colheita das amostras, as amostras de soro devem ser armazenadas a -80 °C antes das aplicações a jusante.
3. Pipeta 560 μL de Buffer AVL (tampão de lise viral) preparado contendo o RNA transportador em um tubo de 1,5 mL. Adicionar 140 μL de soro à mistura de AVL/ARN transportador do tampão no tubo. Misture por pulso-vórtice por 15 s.
4. Incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, centrifugar brevemente a amostra para recolher o conteúdo no fundo do tubo. Adicionar 560 μL de etanol (96%-100%) à amostra e misturar por pulso-vórtice por 15 s. Após a mistura, centrifugar a amostra para recolher o conteúdo no fundo do tubo.
5. Adicionar cuidadosamente 630 μL da solução do passo 9.4 à coluna de rotação sem molhar a jante. Após esta etapa, feche a tampa e centrifugar a 6.000 x g por 1 min. Coloque a coluna de rotação num tubo de recolha limpo de 2 ml e descarte o tubo de recolha utilizado que contém o filtrado.
6. Abra cuidadosamente a coluna de rotação e repita o passo 9.5. Abra cuidadosamente a coluna de rotação e adicione 500 μL de buffer AW1 (buffer de lavagem 1). Feche a tampa e centrifugar a 6.000 x g por 1 min. Coloque a coluna de rotação num tubo de recolha limpo de 2 ml e descarte o tubo de recolha utilizado que contém o filtrado.
7. Abra cuidadosamente a coluna de rotação e adicione 500 μL de buffer AW2 (buffer de lavagem 2). Feche a tampa e centrifugar a 20.000 x g por 3 min. Coloque a coluna de rotação em um tubo de coleta limpo de 2 mL e descarte o tubo de coleta usado que contém o filtrado.
8. Para evitar a contaminação pelo tampão residual AW2, que poderia causar problemas nas reações enzimáticas a jusante, coloque a coluna de spin em um tubo de coleta limpo de 2 mL e descarte o tubo de coleta usado com o filtrado. Centrífuga a 20.000 x g por 1 min.
9. Coloque a coluna de rotação num tubo limpo de 1,5 ml e descarte o tubo de recolha utilizado com o filtrado. Abra cuidadosamente a coluna de rotação e adicione 60 μL de Buffer AVE (buffer de eluição) equilibrado à temperatura ambiente. Após esta etapa, feche a tampa e incube à temperatura ambiente por 1 min.
10. Centrífuga a 6.000 x g por 1 min. O RNA eluído pode então ser usado como uma entrada para o NASBA e RT-qPCRs em paralelo.
11. Siga as etapas 8.3 a 8.11 para realizar a amplificação baseada em sequência de ácido nucleico e reações livres de células à base de papel usando 1 μL de RNA extraído do paciente, garantindo a inclusão de reações de controle negativas e positivas. Após as reacções, preparar a placa de reacção de 384 poços e efectuar o ensaio no dispositivo leitor de placas portátil a 37 °C (ver pormenores no Protocolo Suplementar).
    NOTA: Duas concentrações de RNA de 10⁴ e 10² UFP/mL, extraídas do vírus Zika cultivado, são usadas como controles positivos para todos os experimentos durante a validação clínica. Além dos controles mencionados anteriormente, é importante incluir também o gatilho (10 ng/μL) como controle positivo.
12. No final de cada experimento, os dados brutos (.csv arquivo) do leitor de placas prtable podem ser carregados em um banco de dados seguro on-line. Além disso, o leitor de placas portátil gera um relatório indicando se as amostras são positivas ou negativas para o vírus Zika (Figura 6); ver a secção de resultados representativos para exemplos de todos os gráficos obtidos durante a incubação (Figura 7).
    NOTA: Os usuários também podem transferir arquivos do leitor de placas portátil para o seu próprio computador através do USB.

10. Dispositivo leitor de placa portátil

1. O dispositivo leitor de placas portátil (Figura 8) pode ser utilizado como alternativa a um leitor de placas convencional²⁴. Para o protocolo e os resultados representativos, consulte Protocolo Suplementar.

11. RT-qPCR para detecção do vírus Zika

NOTA: Esta seção descreve as etapas para executar o RT-qPCR para detecção do vírus Zika a partir de amostras de pacientes (consulte Protocolo Suplementar).

1. Para evitar a contaminação, monte os componentes RT-qPCR em uma área isolada do processo de amplificação (por exemplo, capuz limpo). Coloque o tampão RT-qPCR, as enzimas e o primer/sondas no gelo ou em um bloco frio. Em seguida, adicione as reações a uma placa de 384 poços no gelo de acordo com a Tabela 9.
   NOTA: Controles negativos (controle de extração e controle não molde [NTC]) e positivos (10⁴ UFP/mL) são recomendados para todos os experimentos.
2. Depois de adicionar os reagentes a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, misture a reação pipetando para cima e para baixo (não vortex) e dispense 6,5 μL em cada poço. Adicionar 3,5 μL de cada molde de ARN em triplicado.
3. Coloque um filme de PCR sobre a parte superior da placa. Centrifugar a placa de 384 poços a 600 x g por 2 min.
4. Coloque a placa em uma máquina RT-qPCR usando as seguintes condições de ciclagem descritas na Tabela 10. Para analisar os resultados, use o software de projeto e análise de máquinas RT-qPCR e considere o limite automático e a linha de base (consulte os detalhes no Protocolo Suplementar).

Tabela 9: Componentes RT-qPCR para amplificar o RNA do vírus Zika com base no protocolo Centers for Disease Control and Prevention-CDC USA para detectar o vírus Zika a partir de amostras de pacientes³¹.

Tabela 10: Condições de ciclismo para RT-qPCR.

Seguindo o pipeline de projeto computacional, a construção de três interruptores de dedo do pé foi realizada por PCR. Os produtos de PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose (Figura 2). A presença de uma banda clara em torno de 3.000 pb, aproximadamente do tamanho do gene lacZ acoplado a um interruptor de dedo do pé, normalmente indica uma reação bem-sucedida. Como alternativa, uma faixa sem uma banda, várias bandas ou uma faixa do tamanho incorreto indica uma PCR com falha. No caso de uma PCR com falha, as condições de reação e/ou sequências de iniciadores devem ser otimizadas.

Os interruptores de dedo montados foram triados para avaliar cada sensor em relação ao seu respectivo RNA desencadeante transcrito in vitro (Figura 3). Enquanto todos os três sensores exibiam uma maior absorvância OD570, o interruptor 27B (Figura 3A) tinha a taxa de ativação mais rápida. Os interruptores 33B e, em menor grau, 47B mostraram um aumento da absorbância OD570 na ausência de RNA de gatilho alvo, indicando que esses interruptores possuem alguma atividade de fundo ou vazamento (Figura 3B,C) - uma característica não desejada em um sensor candidato, pois pode reduzir a especificidade. Para identificar mais claramente o sensor com a maior relação de sinal ON/OFF, a mudança de dobra da absorbância OD570 foi calculada (ver informações suplementares seção 5) e plotada (Figura 4). A partir desta análise, fica claro que o switch 27B é o sensor que tem o melhor desempenho com uma relação ON/OFF de cerca de 60.

A sensibilidade do interruptor de dedo do pé de melhor desempenho (27B) foi então avaliada determinando a menor concentração de RNA necessária para ativar o interruptor de retenção do dedo do pé quando acoplado a uma reação NASBA. O gráfico ilustra que os sensores de Zika de melhor desempenho podem detectar RNA em concentrações tão baixas quanto 1,24 moléculas por μL (equivalente a ~2 aM; Figura 5).

Após a identificação e validação do switch 27B, os materiais do sensor foram distribuídos aos membros da equipe em Recife, no estado de Pernambuco. No Brasil, a acurácia diagnóstica clínica da plataforma diagnóstica do vírus Zika foi avaliada por meio de amostras de pacientes com o vírus Zika, em paralelo com a RT-qPCR para comparação. Para validar a plataforma de diagnóstico de Zika baseada em papel, foi utilizado o leitor de placas portátil, que é capaz de incubar e ler a saída colorimétrica de sensores à base de papel. A mudança de cor de amarelo para roxo é usada para identificar uma amostra positiva, enquanto uma amostra negativa permanece amarela (Figura 6). Uma opção adicional para visualizar os resultados gerados pelo leitor de placas portátil (Figura 8) é plotar a resposta colorimétrica para cada reação baseada em papel ao longo do tempo. As amostras foram testadas em triplicado e aquelas que excederam o limiar (linha vermelha definida como 1) foram consideradas positivas, enquanto as amostras abaixo do limiar foram consideradas negativas (Figura 6 e Figura 7).

Finalmente, para avaliar e comparar o desempenho clínico do sensor de interruptor de dedo do pé Zika com o atual método padrão-ouro para diagnosticar a infecção pelo vírus Zika, todas as amostras de pacientes foram testadas em paralelo com RT-qPCR. O gráfico de amplificação de duas amostras representativas de pacientes foi testado em triplicado para a detecção do vírus Zika por RT-qPCR (Figura 9). As amostras são consideradas positivas quando o valor do limiar de ciclo (Ct) é ≤38; a linha vermelha indica uma amostra positiva e a linha azul indica uma amostra negativa para o vírus Zika.

Figura 2: Eletroforese em gel de agarose para avaliar a qualidade dos produtos de PCR. Os produtos de PCR são analisados em um gel de agarose a 1% em TAE 1X, executado a 80 V por 90 min. Uma única faixa clara normalmente indica uma reação bem-sucedida. Faixa 1: escada de DNA de 1 kb; Faixas 2-4: 27B mudam de DNA, 33B desencadeiam DNA e 47B desencadeiam DNA, respectivamente. Os números no lado esquerdo representam o tamanho da banda em bp. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Prototipagem de três interruptores de dedo do pé para sensores Zika baseados em papel. O desempenho de três sensores de interruptor de retenção de RNA baseados em papel foi medido a 37 °C por mais de 130 min. Cada gráfico contém dois rastreamentos, um representa apenas o controle switch, enquanto o outro representa o switch e o gatilho. Os três gráficos representam dados adquiridos usando os sensores de interruptor de dedo do pé 27B (A), 33B (B) e 47B (C). As barras de erro representam o erro padrão da média (MEV) de três replicações. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Os sensores de melhor desempenho são identificados calculando a mudança de dobra na absorbância a 570 nm. A mudança de dobra (ou relação ON/OFF máxima) é calculada medindo a razão de absorvância (OD570) a 130 minutos entre o controle somente do interruptor e o teste CFPS do interruptor mais gatilho. As barras de erro representam o SEM de três replicações. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Avaliação da sensibilidade do interruptor de alto desempenho. O RNA de Zika transcrito in vitro é titulado em reações NASBA. Após uma incubação de 1 h, as reações foram adicionadas às reações PURExpress livres de células em discos de papel na proporção de 1:7. A mudança de dobra após 130 min a 37 °C é plotada. Este número foi reproduzido a partir de24. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Página de captura do leitor de placas portátil carregada com dados de imagem capturados. Esta figura mostra uma imagem de amostra da imagem final capturada pelo leitor de placas portátil durante uma execução de coleta de dados. O carimbo de data/hora original é visível na parte superior da imagem. A cor amarela indica controle ou reações negativas, e a cor roxa indica uma reação positiva. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Modo de análise de dados. À esquerda, os usuários selecionam os conjuntos de dados que gostariam de plotar; os gráficos são então exibidos à direita com cores exclusivas para cada amostra ou conjunto de controle. A linha vermelha tracejada serve como um limite para determinar amostras positivas e negativas. As amostras testadas em triplicado que excedam o limiar são consideradas positivas, enquanto as amostras abaixo do limiar são consideradas negativas. As barras de erro representam o desvio padrão (DP) de três replicações. Ctrl 1 a Ctrl 5 indica controles. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8. PLUM, um leitor de placas portátil. Este leitor de placas portátil atua como um lab-in-a-box e serve como um leitor de placas com temperatura controlada para incubar e monitorar reações colorimétricas. Este dispositivo portátil pode fornecer medições quantitativas e de alto rendimento dos sensores Zika baseados em papel no local. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: Gráfico RT-qPCR da amplificação de duas amostras de pacientes testadas em triplicado para a detecção do vírus Zika. As amostras são consideradas positivas quando o valor do limiar de ciclo (Ct) é ≤38. A linha vermelha pontilhada serve como um limiar para determinar amostras positivas e negativas. O traço vermelho indica uma amostra positiva e o traço azul indica uma amostra negativa. O valor de ΔRn (delta Rn) representa a magnitude normalizada do sinal de fluorescência detectado pelo instrumento RT-qPCR para todas as amostras testadas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo de Protocolo Suplementar. Clique aqui para baixar este arquivo.

Números Suplementares. Por favor, clique aqui para baixar esses números. 

K.P. e A.A.G. são co-inventores de tecnologias relacionadas a sensores de retenção de dedo do pé baseadas em papel. Y.G., S.C. e K.P. são co-fundadores da LSK Technologies, Inc. e são co-inventores das tecnologias relacionadas com o PLUM. M.K., K.P. e A.A.G. são co-fundadores da En Carta Diagnostics Ltd. Outros autores não têm conflitos de interesse. Patentes: Dispositivo PLUM: O pedido de patente Y.G., S.C. e K.P. foi depositado pela Universidade de Toronto e atribuído à LSK Technologies Inc. U. S. Provisional Patent Application No. 62/982,323 arquivado em 27 de fevereiro de 2020; Patente do interruptor Toehold: A.A.G., P.Y. e J.J. C. "Riboregulator compositions and methods of use", Patente. WO2014074648A3 arquivado em 6 de novembro de 2012; Patente de diagnóstico baseada em papel: K.P. e J.J.C. "Paper-based synthetic gene networks" Patente dos EUA pendente No. US15/963.831 arquivado em 6 de dezembro de 2013; Patente Zika 1: K.P., A.A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F. e J.J.C., "Portable, Low-Cost Virus Detection and Strain Identification Platform", Pedido de Patente Provisória dos EUA nº 62/403.778 arquivado em 4 de outubro de 2016; Patente Zika 2: K.P., A. A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F. e J.J.C., "Portable, Low-Cost Virus Detection and Strain Identification Platform", Pedido de Patente Provisória dos EUA nº 62/341.221 arquivado em 25 de maio de 2016.