Artigo de método

A aplicação de abordagens baseadas em pesquisa aberta para a identificação de Glycopeptides ligados ao Acinetobacter baumannii O

DOI:

10.3791/63242

⸱

2 de novembro de 2021

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, The University of Melbourne

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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A busca aberta permite identificar glycopeptídeos decorados com composições glican até então desconhecidas. Dentro deste artigo, uma abordagem simplificada para realizar buscas abertas e subsequentes pesquisas de gliocopeptídio focadas em glycan são apresentadas para amostras bacterianas usando Acinetobacter baumannii como modelo.

Resumo

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A glicossomilação proteica é cada vez mais reconhecida como uma modificação comum dentro de organismos bacterianos, contribuindo para a fisiologia procariótica e a ótima infectividade de espécies patogênicas. Devido a isso, há um crescente interesse em caracterizar a glicossylation bacteriana e a necessidade de ferramentas analíticas de alto rendimento para identificar esses eventos. Embora a proteômica de baixo para cima permita prontamente a geração de dados de glicopticídeos ricos, a amplitude e diversidade de glicanos observados em espécies procarióticas tornam a identificação de eventos de glicoslação bacteriana extremamente desafiadora.

Tradicionalmente, a determinação manual das composições glican dentro de conjuntos de dados proteômicos bacterianos fez desta uma análise em grande parte sob medida restrita a especialistas específicos de campo. Recentemente, abordagens abertas baseadas em busca surgiram como uma alternativa poderosa para a identificação de modificações desconhecidas. Ao analisar a frequência de modificações únicas observadas em sequências de peptídeos, técnicas de busca aberta permitem a identificação de glicanos comuns ligados a peptídeos dentro de amostras complexas. Este artigo apresenta um fluxo de trabalho simplificado para a interpretação e análise de dados glicoproteômicos, demonstrando como técnicas de busca aberta podem ser utilizadas para identificar glicocopeptídeos bacterianos sem conhecimento prévio das composições glicânicas.

Usando essa abordagem, os glicaptocidas dentro das amostras podem ser rapidamente identificados para entender as diferenças de glicoseção. Utilizando a Acinetobacter baumannii como modelo, essas abordagens permitem a comparação de composições glican entre cepas e a identificação de novas glicoproteínas. Em conjunto, este trabalho demonstra a versatilidade de técnicas abertas de busca de banco de dados para a identificação da glicossilção bacteriana, tornando a caracterização desses glicoproteomes altamente diversos mais fácil do que nunca.

Introdução

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A glicossomilação proteica, o processo de anexação de carboidratos a moléculas de proteínas, é uma das modificações pós-translacionais mais comuns (PTMs) na natureza 1,2. Em todos os domínios da vida, uma gama de máquinas complexas evoluiu dedicada à geração de glicoproteínas que impactam uma miríade de funções celulares 1,3,4,5. Enquanto a glicossilation proteica ocorre em uma gama de aminoácidos 6,7, eventos de glicosylation ligados a N são duas formas dominantes observadas na natureza. A glicosylação ligada a N envolve a fixação de glicocanos a um átomo de nitrogênio de resíduos de asparagine (Asn), enquanto na glicosylação ligada a O, os glicanos são ligados a um átomo de oxigênio deresíduos de serina (Ser), threonine (Thr) ou tyrosine (Tyr). Apesar das semelhanças nos resíduos visados pelos sistemas de glicoseção, as diferenças dentro dos glicanos ligados às proteínas resultam na glicossylation sendo a classe mais quimicamente diversificada de PTMs encontrados na natureza.

Embora os sistemas de glicoseção eucariótica possuam diversidade glican, esses sistemas são tipicamente restritos no número de carboidratos únicos utilizados. A diversidade resultante decorre da forma como esses carboidratos são dispostos em glicanos 8,9,10,11,12. Em contraste, as espécies bacterianas e arqueais possuem uma diversidade glican praticamente ilimitada devido à pura variedade de açúcares únicos gerados nesses sistemas 2,10,13,14,15,16,17. Essas diferenças na diversidade glican observada entre os domínios da vida representam um desafio analítico significativo para a caracterização e identificação dos eventos de glicosylation. Para a glicosylation eucariótica, a capacidade de antecipar composições glican facilitou o crescente interesse pela glicobiologia; no entanto, o mesmo não se aplica à glicossylation bacteriana, que ainda é amplamente restrita ao estudo por laboratórios especializados. Como a acessibilidade da instrumentação da espectrometria de massa (MS) aumentou nas biociências, as abordagens baseadas em MS são agora o principal método para análise glicoproteômica.

A ESM emergiu como a ferramenta quintessencial para a caracterização da glicosylation, com abordagens de cima para baixo e de baixo para cima agora comumente usadas para caracterizar glicoproteínas6. Enquanto a proteômica de cima para baixo é usada para avaliar padrões globais de glicosylação de proteínas específicas18,19, abordagens de baixo para cima são usadas para permitir a caracterização glican-específica de glicaptocidas, mesmo a partir de misturas complexas 6,20,21,22,23. Para a análise dos glicacopeptídeos, a geração de informações informativas de fragmentação é essencial para a caracterização dos eventos de glicossylation24,25. Uma série de abordagens de fragmentação agora é rotineiramente acessível em instrumentos, incluindo dissociação induzida por colisão baseada em ressonância ion trap (TI-CID), dissociação induzida por colisão do tipo feixe (CID) e dissociação de transferência de elétrons (ETD). Cada abordagem possui diferentes pontos fortes e fracos para a análise de glicocopepcida25,26, com progresso significativo na última década na aplicação dessas abordagens de fragmentação para analisar a glicosylação 6,20. No entanto, para a análise da glicostilação bacteriana, a limitação crítica não tem sido a capacidade de fragmentar glycopeptídeos, mas sim a incapacidade de prever as potenciais composições glica dentro das amostras. Dentro desses sistemas, a natureza desconhecida de diversos glicanos bacterianos limita a identificação de glicocopeptídeos, mesmo com ferramentas de busca focadas em glicosylation agora comuns para a análise de glicoptodides eucarióticos, como O-Par27, GlycopeptideGraphMS28 e GlycReSoft29. Para superar essa questão, é necessário um método alternativo de busca, com o uso de ferramentas de busca aberta emergindo como uma abordagem poderosa para o estudo da glicosylation bacteriana30.

A busca aberta, também conhecida como busca de curinga, permite a identificação de peptídeos com PTMs desconhecidos ou inesperados 21,30,31,32. Pesquisas abertas utilizam uma variedade de técnicas computacionais, incluindo pesquisas de modificação com curadoria, pesquisas de banco de dados multicamados ou pesquisa tolerante em larga massa 33,34,35,36,37. Embora a busca aberta tenha grande potencial, seu uso tem sido tipicamente dificultado pelo aumento significativo dos tempos de análise e perda de sensibilidade da detecção de peptídeos não modificados em comparação com pesquisas restritas31,32. A diminuição na detecção de partidas espectrais de peptídeos não modificados (PSMs) é resultado do aumento das taxas de PSM falso-positivo associadas a essas técnicas, o que requer uma filtragem rigorosa aumentada para manter as taxas de falsas descobertas desejadas (FDRs)33,34,35,36,37 . Recentemente, várias ferramentas se tornaram disponíveis que melhoram significativamente a acessibilidade da pesquisa aberta, incluindo Byonic31,38, Open-pFind39, ANN-SoLo40 e MSFragger21,41. Essas ferramentas permitem a identificação robusta de eventos de glicosylation, reduzindo significativamente os tempos de análise e implementando abordagens para lidar com composições glicas heterogêneas.

Este artigo apresenta um método simplificado para a identificação de glicoptocidas bacterianos por busca aberta, utilizando como modelo o patógeno nosocomial Gram-negativo, Acinetobacter baumannii. A. baumannii possui um sistema de glicoslação orientado ligado a O responsável pela modificação de múltiplos substratos proteicos, conhecido como sistema de glicoslação de proteínasPGLL 42,43,44. Embora proteínas semelhantes sejam destinadas à glicosylation entre cepas, o sistema de glicosylation pglL é altamente variável devido à biossíntese do glicano usado para glicossite de proteínas derivadas do locus cápsula (conhecido como K-locus)44,45,46. Isso resulta em diversos glicocanos (também conhecidos como unidade K), derivados de unidades K polimerizadas únicas ou limitadas, sendo adicionados a substratos proteicos 30,44,46. Dentro deste trabalho, o uso da ferramenta de pesquisa aberta, MSfragger, dentro do software FragPipe, é usado para identificar glycans em cepas A. baumannii. Combinando buscas abertas e curadoria manual, "pesquisas focadas em glycan" podem ser realizadas para melhorar ainda mais a identificação de glycopeptídeos bacterianos. Em conjunto, essa abordagem de identificação multistep permite a identificação de glycopeptídeos sem ampla experiência na caracterização de novos eventos de glicosylação.

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Protocolo

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NOTA: A preparação e análise de amostras de glicoptocida bacteriano podem ser divididas em quatro seções (Figura 1). Para este estudo, foi avaliada a glicosylation de três cepas sequenciadas de A. baumannii (Tabela 1). Os bancos de dados Proteome FASTA de cada uma dessas cepas são acessíveis via Uniprot. Consulte a Tabela 2 para a composição dos buffers utilizados neste protocolo.

1. Preparação de amostras de proteínas para análise proteômica

  1. Isolamento de amostras de proteome de interesse
    1. Se usar células inteiras, certifique-se de que as células foram lavadas com uma solução salina tamponada com fosfato (PBS) para remover potenciais contaminantes proteicos presentes na mídia. Estomular células inteiras após a lavagem e armazená-las a -80 °C até que seja necessário.
    2. Se forem utilizadas amostras fracionadas (como preparações de membrana), certifique-se de que os reagentes utilizados não interferirão na análise50 da cromatografia líquida a jusante (LC-MS).
    3. Se detergentes, como o dodecyl-sulfato de sódio (SDS), Triton X-100, NP-40 ou lauroylsarcosine, forem usados, remova esses detergentes usando precipitação de acetona, métodos de preparação de amostras SP351 ou colunas de limpeza proteômicas comerciais, como s-traps52. Alternativamente, substitua detergentes incompatíveis por um detergente compatível com MS ou removível, como desoxicolato de sódio (SDC) ou glucopyranoside octil.
    4. Certifique-se de que todos os plásticos e vidros a serem usados para a preparação da amostra não foram autoclavados. Vidros e plásticos autoclavados são tipicamente fortemente contaminados com pequenos compostos de peso molecular, como polímeros, que são facilmente detectados dentro do MS.
  2. Solubilização de amostras de células inteiras
    1. Resuspend ~10 mg de células lavadas e congeladas em 200 μL de tampão de desoxicolato de sódio recém-preparado (tampão de lise SDC: 4% SDC em 100 mM Tris, pH 8.5).
      NOTA: Os inibidores de protease podem ser adicionados ao tampão de lise SDC para limitar a degradação da proteína.
    2. Ferva as amostras por 10 min a 95 °C com agitação (2000 rpm em um termomixer), e depois deixe no gelo por 10 minutos. Repita este processo duas vezes para garantir a lise eficiente e a solubilização das amostras.
      NOTA: As amostras podem ser armazenadas a longo prazo neste ponto a -80 °C. Se armazenado, resolubilize por aquecimento a 95 °C antes de processamento posterior.
  3. Quantifique as concentrações de proteínas amostrais usando um ensaio proteico bicinchonínico (BCA)53. Armazene amostras no gelo enquanto realiza quantificação para limitar a degradação da proteína.
    NOTA: Para a análise proteome total, 20-100 μg de proteína é mais do que suficiente para nano LC-MS, que normalmente requer menos de 2 μg de digestão proteica por análise. A preparação do peptídeo em excesso permite a análise de replicação ou fracionamento posterior se for necessária uma cobertura proteômica profunda. Para análise baseada em enriquecimento de glicopticida utilizando cromatografia de interação hidrofílica (HILIC), é necessário 100-500 μg de proteína.
  4. Reduzir e aquilar amostras.
    1. Adicionar 1/10do volume de 10x de redução/tampão de alquilação (100 mM Tris 2-carboxyethyl phosphine cloridide; 400 mM 2-cloroacetamida em 1 M Tris, pH 8.5) para amostras para uma concentração final de 1x e incubar amostras no escuro por 30 min a 45 °C com agitação a 1.500 rpm.
      NOTA: Verifique o pH do buffer de redução/alquilação de 10x para garantir um pH de aproximadamente 7,0-8,0 antes de adicionar às amostras, pois um pH mais baixo fará com que o SDC precipitasse.
  5. Gire brevemente as amostras e adicione os proteases Trypsin/Lys-C (~10 μL, resuspended em 100 mM Tris, pH 8.5) para uma razão final protease:proteína de 1:100. Incubar os digestos durante a noite a 37 °C com agitação a 1.500 rpm (até 18 h). Para garantir a digestão completa da proteína, use uma razão de protease trypsin/lys-C: proporção de proteína de 1:50 a 1:200.
  6. A saciar digere adicionando 1,25 volumes de isopropanol 100% às amostras. Vórtice as amostras por 1 min para misturar e rapidamente rodá-las.
    NOTA: As amostras podem ser armazenadas a -20 °C para serem processadas posteriormente.
  7. Acidificar as amostras adicionando 0,115 volumes de ácido trifluoroacético de 10% (TFA; concentração final de ~1% TFA), vórtice das amostras e rapidamente spin-los para baixo.

2. Processamento de amostras de proteome

  1. Limpeza de peptídeos de amostras de proteome
    1. Prepare uma ponta de sulfonato de fase inversa (SDB-RPS) Para cada amostra, conforme descrito anteriormente54.
      1. Empiricamente, para ligar 50 μg de peptídeo, extirpa três discos SDB-RPS de uma membrana SDB-RPS de 47 mm2 usando uma agulha cega (14 G). Para maiores quantidades de peptídeos, aumente o número de discos em conformidade.
    2. Antes de usar as Dicas de Estágio SDB-RPS, prepare as dicas adicionando sequencialmente pelo menos dez volumes de cama dos seguintes buffers e girando o buffer através da coluna por centrifugação (25 °C, 3 min, 500 × g) ou empurrando o buffer através da coluna aplicando suavemente a pressão usando uma seringa.
      1. Molhe as pontas com 150 μL de 100% acetonitrila.
      2. Lave as pontas com 150 μL de 30% de metanol, 1% TFA em 18,2 MΩ H2O.
      3. Equilibre as pontas com 150 μL de isopropanol de 90%, 1% TFA equilibrada com 18,2 MΩ H2O.
    3. Carregue as amostras (contendo isopropanol de 50%, 1% TFA) nas Pontas de Estágio SDB-RPS por centrifugação (25 °C, 3 min, 500 × g) ou aplicando suavemente a pressão usando uma seringa.
    4. Lave as Dicas de Estágio SDB-RPS com os seguintes buffers por centrifugação (25 °C, 3 min, 500 × g) ou aplicando suavemente a pressão usando uma seringa.
      NOTA: Lavagens adicionais ou tampões alternativos podem ser usados para remover contaminantes não peptídeos, como o uso de acetato etílico em vez de isopropanol55.
      1. Lave as pontas com 150 μL de isopropanol de 90%, 1% TFA.
      2. Lave as pontas com 150 μL de 1% TFA em 18,2 MΩ H2O.
    5. Elute os peptídeos das Pontas de Estágio SDB-RPS com 150 μL de hidróxido de amônio de 5% em 80% de acetonitrila por centrifugação ou aplicando suavemente pressão usando uma seringa. Coletar as amostras em tubos individuais.
      NOTA: Prepare 5% hidróxido de amônio em 80% de acetonitrilo em um recipiente plástico imediatamente antes de usar dentro de um capô de fumaça.
    6. Seque os peptídeos elucidos por centrifugação de vácuo a 25 °C.
      NOTA: Se realizar o enriquecimento HILIC, 1-10% dos eluatos de peptídeos podem ser removidos neste momento, secos e usados como controles totais de entrada proteome.
  2. Enriquecimento de amostras de glicoptoptida
    1. Prepare dicas de estágio de cromografia líquida de interação hidrofínica zwitteriônica (ZIC-HILIC) como descrito anteriormente54,56.
      1. Resumidamente, extirpa um disco C8 de uma membrana de 47 mm2 C8 usando uma agulha cega (14 G) e embale o disco em uma ponta P200 para criar um frit. Adicione aproximadamente 5 mm de material ZIC-HILIC, resuspended em acetonitrilo de 50%, 50% 18,2 MΩ H2O, no frit aplicando suavemente a pressão usando uma seringa.
    2. Antes de usar as Pontas de Estágio ZIC-HILIC, condicionar a resina adicionando sequencialmente os seguintes buffers e aplicando suavemente a pressão usando uma seringa.
      NOTA: Para garantir a integridade da camada pseudo-água na superfície da resina ZIC-HILIC (necessária para enriquecer glycopeptídeos), a resina deve permanecer sempre molhada. Ao lavar a resina, deixe sempre ~10 μL de solvente acima da resina e certifique-se de que as lavagens/amostras sejam encanar diretamente neste solvente residual.
      1. Equilibre a resina com 20 volumes de cama (200 μL) de tampão de eluição ZIC-HILIC (0,1% TFA em 18,2 MΩ H2O).
      2. Lave a resina com 20 volumes de cama (200 μL) de tampão de preparação ZIC-HILIC (95% de acetonitrilo em 18,2 MΩ H2O).
      3. Lave a resina com 20 volumes de cama (200 μL) de tampão de carga/lavagem ZIC-HILIC (80% de acetonitrilo, 1% TFA equilibrado com 18,2 MΩ H2O).
    3. Resuspend as amostras digeridas secas (da etapa 2.1.6) em zic-HILIC carregando/lavando tampão para uma concentração final de 4 μg/μL (por exemplo, para 200 μg de peptídeo, resuspend em 50 μL de suporte/tampão de lavagem ZIC-HILIC). Vórtice brevemente por 1 min para garantir que as amostras sejam resuspended, e gire para baixo por 1 min a 2.000 × g a 25 °C.
    4. Carregue a amostra de peptídeo resuspended em uma coluna ZIC-HILIC condicionada.
      1. Lave três vezes com 20 volumes de cama (200 μL) de tampão de carga/lavagem ZIC-HILIC (para 60 lavagens de volume de cama total) aplicando suavemente a pressão usando uma seringa.
      2. Glicopeptídeos eluto com 20 volumes de cama (200 μL) de tampão de eluição ZIC-HILIC em um tubo de 1,5 mL aplicando suavemente a pressão usando uma seringa e, em seguida, seque o elunato por centrifugação de vácuo a 25 °C.

3. LC-MS de amostras enriquecidas com proteome/glicoptopídio

  1. Resuspenque as amostras em Buffer A* (2% acetonitrilo, 0,1% TFA) a uma concentração final de 1 μg/μL (por exemplo, para 50 μg de peptídeo, resuspend em 50 μL de Buffer A*).
  2. Carregue as amostras em um HPLC/UPLC acoplado a um MS para permitir a separação e identificação de glicoptocidas.
    NOTA: Os parâmetros da coluna, incluindo diâmetro interno, comprimento, taxas de fluxo, tipo de resina cromatografia e quantidades necessárias de injeção de peptídeo, devem ser otimizados para a configuração analítica e comprimento de gradiente a ser utilizado; para um exemplo de como empreender a otimização de configurações analíticas, consulte57.
  3. Monitore a coleta dos dados de MS resultantes garantindo que os dados sejam coletados com os parâmetros desejados.
    NOTA: Para análise composicional, a fragmentação do CID é suficiente. Devido à adição de glicídeos aos glicopeptídeos, íons de glicoptoptídeos são tipicamente observados com uma densidade de carga maior e menor do que os peptídeos não dilatados. Para garantir que esses íons sejam observáveis, permita uma faixa de massa MS1 de 400 a 2.000 m/z.
  4. Fragmentos selecionados ions utilizando CID, garantindo a coleta de íons de fragmentos de m/z baixos que contêm íons de oxonium importantes para a caracterização dos glicanos.
    NOTA: A fragmentação dos glicoptocidas utilizando CID é influenciada tanto pelas sequências de peptídeos e glicocanos, quanto pela energia aplicada durante a fragmentação 25,58,59. Embora uma gama de diferentes energias de colisão possa ser usada, uma estratégia ideal para fragmentar glycopeptídeos é o uso de energias de colisão escalonada combinando o uso de múltiplas energias de colisão 25,59,60.
  5. Use métodos alternativos de fragmentação, se disponíveis, como ETD para localização do local ou TI-CID para auxiliar na determinação de composições glicanas.
    NOTA: Nenhuma dessas abordagens de fragmentação são essenciais para a análise composicional, mas podem ser coletadas para permitir um interrogatório adicional de glycopeptídeos de interesse.

4. Análise de amostras enriquecidas com proteome/glicoptopídio

  1. Pré-filtramento de arquivos de dados para permitir a pesquisa no FragPipe
    1. Se as varreduras ETD ou IT-CID tiverem sido adquiridas nos conjuntos de dados, filtre esses eventos de varredura dos arquivos de dados usando o MSConvert61 antes de pesquisar com o FragPipe.
      NOTA: Para os parâmetros de pesquisa abertos descritos abaixo, são necessários apenas dados de CID do tipo feixe.
  2. Realizando buscas abertas no FragPipe
    1. Abra FragPipe e clique na guia Fluxo de trabalho . No menu de retirada do fluxo de trabalho, selecione a opção Abrir e clique em Adicionar arquivos para importar os arquivos de dados a serem pesquisados no FragPipe (Figura 2A).
    2. Clique na guia Banco de dados e inicie o gerenciador de downloads clicando em Download. Isso permite que os bancos de dados proteome sejam baixados da Uniprot usando um ID Uniprot Proteome. Clique na opção Adicionar isca e contaminantes dentro do gerenciador de downloads para incorporar proteínas chamariz e contaminantes em bancos de dados.
    3. Para obter limites FDR mais rigorosos, clique na guia Validação e modifique o valor do filtro e do relatório de 0,01 para o FDR necessário.
      NOTA: As configurações padrão do FragPipe garantirão um FDR de 1% no nível da proteína.
    4. Clique na guia MSfragger . Dentro da caixa de correspondência Peak , aumente a tolerância de massa precursora do padrão de 500 Da para 2.000 Da para permitir a identificação de grandes modificações (Figura 2A).
    5. Clique na guia Executar e defina a localização das saídas do FragPipe. Clique no botão Executar para iniciar a pesquisa.
  3. Utilizando os PSMs identificados entre conjuntos de dados (contidos nas saídas psm.tsv do FragPipe), identifique potenciais glicocanos plotando a frequência de massas delta observadas dentro dos conjuntos de dados (Figura 3). Crie plots de massa delta a partir de saídas MSfragger usando os scripts R acessíveis através da adesão do PRIDE PXD027820.
    NOTA: O pósprocessamento mínimo dos resultados de pesquisa aberta é realizado dentro desses scripts, pois o principal objetivo desses scripts é auxiliar na visualização de perfis de massa delta. É importante ressaltar que a observação de massas delta abundantes por si só não é a prova de que uma modificação é um potencial glicano, pois atribuir massas delta como glicanos requer uma análise mais aprofundada dos eventos MS2 correspondentes.
  4. Para permitir a caracterização de glycopeptides dentro das amostras, foque em identificações de massa delta de alta confiança, correspondendo a atribuições com hiperescores elevados.
    1. Para auxiliar na avaliação dos espectros de glicopticida, use ferramentas de anotação de peptídeos, como o Anotador Espectral De Peptídeo Interativo63, que permite a atribuição de íons associados ao peptídeo dentro de espectros, permitindo a identificação manual dos íons associados ao glicano (Figura 4).
      NOTA: Dentro dos conjuntos de dados aqui apresentados, hiperscores de >30 são considerados de alta pontuação, pois correspondem a pontuações entre os 50% mais altos de todos os glipcopeptídeos identificados (Figura 5).
  5. Com glycopeptides de alta confiança atribuídos, identifique íons glicanos comumente observados (Figura 4) para melhorar a identificação de glicoptocidas.
    NOTA: Ao incorporar íons associados ao glicano dentro das pesquisas, conhecidas como pesquisas focadas em glycan, a qualidade das atribuições de glicocopeptodo pode ser melhorada.
    1. Clique na guia MSfragger de FragPipe, incorpore as massas delta determinadas dos glicanos observados nas seções De modificações variáveis e deslocamentos em massa . Adicione essas massas digitando valores nas seções De modificações variáveis e deslocamentos em massa com massas individuais separadas com a /. Adicione as massas de fragmentos associadas ao glicano desses glicanos na seção de mods Glyco/Labile do MSFragger.
      NOTA: A Figura 2B descreve as principais informações necessárias para uma pesquisa focada em glycan da cepa A. baumannii AB307-0294.
  6. Carregue todos os dados de MS associados a estudos proteômicos para repositórios proteômicos centralizados, como os repositórios PRIDE ou MASSIVE.
    NOTA: Todos os dados associados a este estudo foram depositados no repositório proteômico do PRIDE e podem ser acessados através da adesão ao PRIDE: PXD027820.

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Resultados

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Para ilustrar a utilidade da busca aberta por análise de glicoptocida bacteriano, a diversidade química de glicocanos ligados a O dentro de três cepas de A. baumannii-AB307-0294, ACICU e D1279779-- foi avaliada. Os glicoproteomes ligados ao O são altamente variáveis entre as cepas de A. baumannii, pois os glicos usados para glicossolation são derivados da cápsula altamente variável loci 44,45,46.

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Discussão

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A busca aberta é um método eficaz e sistemático para a identificação de modificações desconhecidas. Embora a identificação de glícans desconhecidos em amostras de proteome bacteriano tenha sido tradicionalmente um empreendimento demorado e tecnicamente especializado, os recentes desenvolvimentos de ferramentas como MSfragger21,41 e Byonic31,38 agora permitem a identificação rápida e eficaz de massas delta...

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse.

Agradecimentos

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A N.E.S é apoiada por uma Bolsa futura do Conselho de Pesquisa Australiano (FT200100270) e uma subvenção do Projeto ARC Discovery (DP210100362). Agradecemos ao Centro de Espectrometria de Massa de Melbourne e Proteômica do Instituto bio21 de ciência molecular e biotecnologia pelo acesso à instrumentação de MS.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
14 G Kel-F Estilo de ponto de cubo 3Hamilton companyhanc90514
2-CloroacetamidaSigma Aldrich Pty LtdC0267-100G
AcetonitrilaSigma Aldrich Pty Ltd34851-4L
Hidróxido de amônio (28%)Sigma Aldrich Pty Ltd338818-100ML
BCA Protein Assay Reagent APierce23228
O reagente B do ensaio da proteína de BCAperfura23224
C8de Um fornecedor alternativo para o material C8 é
MetanolSigma Aldrich Pty Ltd5,33002
IsopropanolSigma Aldrich Pty Ltd650447-2.5L
M/4058/17
SDB-RPS Empore SPE (Sulfonato de Fase Reversa)Sigma Aldrich Pty Ltd66886-UUm fornecedor alternativo para SDB-RPS é Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)
Desoxicolato de SódioSigma Aldrich Pty LtdD6750-100G
ThermoMixer CEppendorf2232000083
ácido trifluoroacéticoSigma Aldrich Pty Ltd302031-10X1ML
Tris 2-carboxietil fosfina cloridratoSigma Aldrich Pty LtdC4706-2G
Tris (hidroximetil) aminometanoSigma Aldrich Pty Ltd252859-500G
Mistura de proteasePromegaV5073
Concentrador de vácuoLabconco7810040
ZIC-HILICA resina 1504580001 da Merckpara uso em colunas SPE de uso único pode ser obtida esvaziando uma coluna de forma maior e usando a resina livre
o Ltd 66882-U do Sigma Aldrich Pty do SPE produto químico do Fisher do Ltd 5,33002 de Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)

Referências

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