O presente protocolo descreve um método para induzir lesões específicas de tecido e altamente reprodutíveis em larvas de zebrafish usando um sistema de lesão a laser combinado com uma plataforma microfluida automatizada para o manuseio de larvas.
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Artigo de método
Lesões semi-automatizadas semi-automatizadas controladas por laser para estudar a regeneração da medula espinhal em larvas de zebrafish
Neste artigo
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Resumo
Resumo
As larvas de zebrafish possuem um sistema nervoso central totalmente funcional (SNC) com alta capacidade regenerativa apenas alguns dias após a fertilização. Isso torna este modelo animal muito útil para estudar lesão medular e regeneração. O protocolo padrão para induzir tais lesões é transectar a parte dorsal do tronco manualmente. No entanto, essa técnica requer treinamento extensivo e danifica tecidos adicionais. Um protocolo foi desenvolvido para lesões induzidas por laser para contornar essas limitações, permitindo alta reprodutibilidade e completude da transeção da medula espinhal sobre muitos animais e entre diferentes sessões, mesmo para um operador não treinado. Além disso, os danos teciduais são limitados principalmente à medula espinhal em si, reduzindo os efeitos de confusão de ferir diferentes tecidos, por exemplo, pele, músculo e CNS. Além disso, são possíveis lesões hemi-lesões da medula espinhal. A melhoria da preservação da integridade tecidual após lesão a laser facilita novas dissecções necessárias para análises adicionais, como a eletrofisiologia. Assim, este método oferece um controle preciso da extensão da lesão que é inalcançável manualmente. Isso permite novos paradigmas experimentais neste modelo poderoso no futuro.
Introdução
Em contraste com os mamíferos, o zebrafish (Danio rerio) pode reparar seu sistema nervoso central (SNC) após lesões1. O uso de larvas de zebrafish como modelo de regeneração da medula espinhal é relativamente recente. Provou-se valioso para investigar os mecanismos celulares e moleculares subjacentes ao reparo2. Isso se deve à facilidade de manipulação, ao curto ciclo experimental (novas larvas a cada semana), à transparência óptica dos tecidos e ao pequeno tamanho das larvas, idealmente adequada para microscopia de fluorescência in vivo .
No caso da regeneração da medula esp....
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Protocolo
Todos os estudos em animais foram realizados com aprovação do Ministério do Interior do Reino Unido e de acordo com suas regulamentações, sob licença de projeto PP8160052. O projeto foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Edimburgo. Para análises experimentais, larvas de zebrafish até 5 dias de idade de ambos os sexos foram utilizadas das seguintes linhas transgênicas disponíveis: Tg (Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP), Tg (Xla.Tubb:DsRed), Tg (betaactin:utrophin-mCherry), Tg (Xla.Tubb:GCaMP6s) e Tg(mnx1:gfp) (ver Arquivo Suplementar 1 sobre a geração das linhas de zebrafish transgênicos). Um esquema do protocolo ....
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Resultados
Validação da transeção da medula espinhal
Foram realizadas investigações estruturais e funcionais para avaliar se o protocolo permite uma transeção completa da medula espinhal.
Primeiro, verificar se a perda de fluorescência no local da lesão foi devido a danos no tecido neuronal e não à fotoblemação da fluorescência da iluminação laser, foi realizada a imunostenção utilizando um anticorpo contra tubulina acetilada (ver Tabela de Materiais e Arquivo.......
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Discussão
Há uma necessidade urgente de uma compreensão mais profunda dos processos em jogo durante a regeneração em zebrafish. Este modelo animal oferece muitos benefícios para a pesquisa biomédica, em especial para lesões medular1. A maioria dos estudos envolve lesões manuais que requerem um operador bem treinado e induzem danos multi tecidos. Aqui é apresentado um protocolo de lesão a laser, permitindo o controle sobre as características da lesão e danos reduzidos aos tecidos circundantes. Além disso, es.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado pelo BBSRC (BB/S0001778/1). A CR é financiada pelo Princess Royal TENOVUS Scotland Medical Research Scholarship Program. Agradecemos a David Greenald (CRH, Universidade de Edimburgo) e Katy Reid (CDBS, Universidade de Edimburgo) pelo tipo de presente de peixe transgênico (Ver Arquivo Suplementar). Agradecemos a Daniel Soong (CRH, Universidade de Edimburgo) pelo tipo de acesso ao 3i spinning-disk confocal.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Software | |||
| Microscópio software Zen Blue 2.0 | Carl Zeiss | ||
| ImageJ/FIJI | Código Visual Studio de código | ||
| Microsoft | |||
| Microscópio e acessórios | |||
| ApoTome microscópio | Lente de imersão Carl Zeiss | ||
| C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) | Zeiss | ||
| dual AxioCam 506 m | Carl Zeiss | ||
| LSM880 | Carl Zeiss | ||
| Módulo de disco giratório CSU-X1 | Yokogawa | ||
| Microscópio verticalAxio Examiner D1 | Carl Zeiss | ||
| Laser UV | Micropoint | ||
| VAST BioImager | Union Biometrica | ||
| Labware | |||
| 90 mm Placa de Petri | Thermo-Fisher | 101R20 | |
| Placa de 96 poços | Corning | 3841 | |
| Chemicals | |||
| Kit de imagem Click-It EdU | Invitrogen | C10637 | |
| ácido aminobenzóico-etil metil-éster (MS222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| feniltioureia (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Anticorpos | |||
| Donkey anti-frango Alexa Fluor 488 | Jackson | 703-545-155 | |
| Burro anti-rato Cy3 | Jackson | 715-165-150 | |
| Rato anti-GFP | Abcam | AB13970 | |
| Rato anticorpo acetilado anti-tubulina Sigma | T6793 | ||
| Linhagens de peixe-zebra transgênico | |||
| Tg(beta-actina:utrofina-mCherry) | N/A | Estabelecido por David Greenhald, Universidade de Edimburgo | |
| Tg(mnx1:gfp) | N/A | Descrito pela primeira vez em [Flanagan-Steet et al. 2005] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed) | N/A | Descrito pela primeira vez em [Peri e Nusslein-Volhard 2008] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed; mpeg1:GFP) | N/A | Estabelecido por Katy Reid, Universidade de Edimburgo | |
| Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) | N/A | Estabelecido por David Greenhald, Universidade de Edimburgo |
Referências
- Becker, C. G., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
- Ohnmacht, J., et al. Spinal motor ne....
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Reimpressões e permissões
Errata
Formal Correction: Erratum:Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
Posted by JoVE Editors on 4/07/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae. The title was updated.
The title was updated from:
Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
to:
Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
