Artigo de método

Visualizando e quantificando compostos farmacêuticos dentro da pele usando imagens coerentes de dispersão de Raman

DOI:

10.3791/63264

⸱

24 de novembro de 2021

 ,  ,  , 
1Wellman Center for Photomedicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uma metodologia coerente de imagem de dispersão raman para visualizar e quantificar compostos farmacêuticos dentro da pele é descrita. Este artigo descreve a preparação do tecido da pele (humano e camundongo) e a aplicação da formulação tópica, aquisição de imagens para quantificar perfis de concentração esposteis e análises farmacocinéticas preliminares para avaliar a entrega de medicamentos tópicos.

Resumo

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Farmacocinética cutânea (cPK) após a aplicação da formulação tópica tem sido uma área de pesquisa de particular interesse para cientistas reguladores e de desenvolvimento de medicamentos para entender mecanicamente a biodisponibilidade tópica (BA). Técnicas semi-invasivas, como descascamento de fitas, microdiálise dérmica ou microperfusão de fluxo aberto dérmico, todas quantificam a macroescala cPK. Embora essas técnicas tenham proporcionado vasto conhecimento de CPK, a comunidade carece de uma compreensão mecanicista da penetração e permeação de ingredientes farmacêuticos ativos (API) no nível celular.

Uma abordagem não invasiva para abordar a microescala cPK é a imagem de dispersão raman coerente (CRI), que tem como alvo seletivamente vibrações moleculares intrínsecas sem a necessidade de rótulos extrínsecos ou modificações químicas. O CRI tem dois métodos principais de dispersão anti-Stokes Raman (CARS) e estimulado a dispersão de Raman (SRS) - que permitem quantificação sensível e seletiva de APIs ou ingredientes inativos. Os CARROS são normalmente utilizados para obter informações estruturais da pele ou visualizar contraste químico. Em contraste, o sinal srs, que é linear com concentração molecular, é usado para quantificar APIs ou ingredientes inativos dentro de estratificações de pele.

Embora o tecido do camundongo tenha sido comumente utilizado para cPK com CRI, BA tópico e bioequivalência (BE) devem, em última análise, ser avaliados em tecido humano antes da aprovação regulatória. Este artigo apresenta uma metodologia de preparação e imagem da pele ex vivo a ser utilizada em estudos cri farmacocinéticos quantitativos na avaliação da BA e DO tópicos. Essa metodologia permite quantificação de API confiável e reprodutível na pele humana e do rato ao longo do tempo. As concentrações dentro de compartimentos ricos em lipídios e lipídios, bem como a concentração total de API ao longo do tempo são quantificadas; estes são utilizados para estimativas de BA micro e macroescala e, potencialmente, BE.

Introdução

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Metodologias para avaliar a PP após a aplicação de produtos medicamentos tópicos se expandiram a partir de estudos clássicos de permeação in vitro (IVPT) estudos 1,2,3,4,5 e tape-stripping 6,7,8 para metodologias adicionais como microperfusão de fluxo aberto ou microdiálise dérmica 9,10,11,

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Protocolo

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O uso de tecido de orelha de rato nu foi aprovado pelo Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), enquanto o uso de tecido de pele humana foi aprovado pelo Massachusetts General Hospital Institutional Review Board (IRB). De acordo com os protocolos da IACUC, camundongos recém-eutanásiados foram obtidos de colaboradores com colônias de ratos nus. O tecido humano foi adquirido a partir de procedimentos eletivos de abdominoplastia no Hospital Geral de Massachusetts através de um protocolo aprovado. Além disso, tipos específicos de tecidos diferentes da pele abdominal foram adquiridos por meio de uma autoridade de doação corporal, ....

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Resultados

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A imagem é considerada bem sucedida se o tecido não tiver se movido significativamente tanto no axial (<10 μm) quanto na direção lateral após a conclusão do experimento (Figura 4). Esta é uma indicação imediata se a medição srs para a API de interesse não é representativa da profundidade inicial, para a qual a quantificação é específica de camada. Isso é mitigado por pilhas z de imagem para cada posição de interesse XY, com a compensação sendo a resolução temporal. Se a pele congelada for.......

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Discussão

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A avaliação da BA/BE atual é uma área de pesquisa que requer uma abordagem multifacetada, pois nenhum método único pode caracterizar totalmente in vivo cPK. Este protocolo apresenta uma metodologia para a avaliação da BA/BE de um produto de medicamentos tópicos com base em imagens raman coerentes. Um dos primeiros pontos que podem ser negligenciados é o quão finas as amostras de pele devem ser, especialmente para a transmissão quantitativa de imagens srs. Se a pele é muito grossa (ou seja, a luz não pod.......

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Divulgações

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A CLE é uma inventora de patentes para microscopia CARS que foram licenciadas para vários fabricantes de microscópio. Todos os outros autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Agradecimentos

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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Fotis Iliopoulos e Daniel Greenfield do Grupo Evans por sua discussão e revisão deste manuscrito. Além disso, os autores gostariam de reconhecer o apoio da LEO Pharma. A Figura 2 foi criada com BioRender.com.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tissue Preparation
Autoclavable Biohazard BagsFisherBrand22-044562Conforme referido no texto: biohazard bags
https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-polyethylene-biohazard-autoclave-bags-without-sterilization-indicator-8/22044562?searchHijack=true&searchTerm= 22044562& searchType=RAPID& matchedCatNo=22044562
Tampões de cultura de células: Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco 1xCorningMT21030CVConforme referido no texto: PBS
https://www.fishersci.com/shop/products/corning-cellgro-cell-culture-buffers-dulbecco-s-phosphate-buffered-salt-solution-1x-8/MT21030CV?searchHijack=true&searchTerm= 21-030-cv& searchType= RAPID& matchedCatNo=21-030-cv
Bisturis DescartáveisExel International14-840-00Como referido no texto: bisturi
https://www.fishersci.com/shop/products/exel-international-disposable-scalpels-3/1484000?keyword=true
Alta Precisão 45° Pinça/fórceps de ponta larga angularFisherbrand12-000-132Conforme referido no texto: fórceps
https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-45-angle-broad-point-tweezers-forceps/12000132#?keyword=
Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-PlyKimberly-Clark Professional Kimtech Science06-666Conforme referido no texto: task wiper
https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/06666
Parafilm M Filme de Embalagem de LaboratórioBemis13-374-12Conforme referido no texto: parafilm
https://www.fishersci.com/shop/products/curwood-parafilm-m-laboratory-wrapping-film-4/1337412
Placa de Petri (35 mm x 10 mm)FisherbrandFB0875711YZConforme referido no texto: placa de Petri pequena
https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-specialty-6/FB0875711YZ?keyword=true
Placa de Petri (60 mm x 15 mm)FisherbrandFB0875713AConforme referido no texto: placa de Petri grande
https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/FB0875713A?keyword=true
Tesoura CirúrgicaRobozNC9411473Conforme referido no texto: tesoura
https://www.fishersci.com/shop/products/scissors-327/NC9411473?searchHijack=true&searchTerm= RS-5915SC& searchType=RAPID& matchedCatNo=RS-5915SC
strong>Laser/microscópio
650/60 nm BrightLine filtro passa-banda de banda únicaSemrockConforme referido no texto: Filtro CARS - vibrações CH2 (filtro de 645nm/60nm)
Caixa de controle IX2-UCBOlympusConforme referido no texto: Caixa de controle
D700/30mChromaConforme referido no texto: Filtro CARS - banda deuterada
https://www.chroma.com/products/parts/d700-30m
DeepSee InsightSpectra-PhysicsConforme referido no texto: Laser
https://www.spectra-physics.com/f/insight-x3-tunable-laser
Console do medidor de energia e potência óptica portátil digitalThorLabsPM100DConforme referido no texto: medidor de potência
https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341
Fluoview SoftwareOlympusConforme referido no texto: Software de controle de microscópio
Lâminas de microscópio foscoFisherBrandConforme referido no texto: lâminas de microscópio
https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/22265446
FV1000OlympusConforme referido no texto: Câmara
de IncubaçãoTokai HitGM-800Conforme referido no texto: câmara de incubação
Esfera Integradora Sensor de Potência de FotodiodoThorLabsS142CConforme referido no texto: fotodiodo
https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341
Fonte de alimentação FV31-PSUOlympusConforme referido no texto: Fonte de
Alimentação Precision 4063, Gerador de Função de Canal Duplo de 80MHzBK PrecisionConforme referido no texto: gerador de função
ProScan - ndash; Automação de Microscópio de PrecisãoInstrumentos Científicos AnterioresConforme referido no texto: controlador de platina
https://www.prior.com/microscope-automation/inverted-microscope-systems/proscan-linear-stage-highest-precision-microscope-automation
Espaçadores de imagem SecureSealGrace Biolabs654004Conforme referido no texto: spacer
https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654004/
Kit de Detecção SRSAPEComo referido no texto: Detector SRS
UPLSAPO 20X NA:0.75OlympusComo referido no texto: 20X Objective
https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/uplsapo/
Lipid/Drug Imaging
  Prato de 35 mm, Nº 0 Lamínula não revestida, Diâmetro de vidro de 14 mmMatTek CorporationNC9711297Conforme referido no texto: Prato com fundo de vidro
https://www.fishersci.com/shop/products/glass-bottom-mircrowell-dish/nc9711297
Aplicadores com ponta de algodãoFisherBrandConforme referido no texto: Aplicador com ponta de algodão
Distriman Pipeta de deslocamento positivoGilsonConforme referido no texto: Pipeta de Deslocamento Positivo
https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distriman-positive-displacement-repetitive-pipette/F164001G#?keyword=
Distriman Pontas de Pipeta de Deslocamento PositivoGilsonConforme referido no texto: Pontas para pipeta
https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distritip-syringes-6/f164100g?keyword=true
Análise de Dados
FIJIOpen-sourceConforme referido no texto: FIJI/ImageJ
https://imagej.net/software/fiji/
Jupyter-Labopen-sourceConforme referido no texto: JupyterLab
https://jupyter.org/
RstudioOpen-sourceConforme referido no texto: Rstudio
https://www.rstudio.com/
< de Microscópio

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Finnin, B., Walters, K. A., Franz, T. J. In vitro skin permeation methodology. In Transdermal and topical drug delivery: principles and methodology. Transdermal and topical drug delivery: principles and practice. Benson, H. E., Watkinson, A. C. , John Wiley & Sons. Hoboken NJ USA. 85-108 (2012).
  2. Shin, S. H., et al.

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