Este protocolo descreve imagens de fluorescência e análise das aconzyomas metabólicas endógenas, dinucleotídeos de nicotinamida reduzida (fosfato) dinucleotídeos (NAD(P)H) e dinucleotídeo de adenina de flavina oxidada (FAD). A imagem de autofluorescência de NAD(P)H e FAD fornece um método sem rótulos e não destrutivo para avaliar o metabolismo celular.
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Artigo de método
Imagem de autofluorescência para avaliar o metabolismo celular
Neste artigo
Resumo
Resumo
O metabolismo celular é o processo pelo qual as células geram energia, e muitas doenças, incluindo o câncer, são caracterizadas pelo metabolismo anormal. Adenina de nicotinamida reduzida (fosfato) dinucleotídeo (NAD(P)H) e dinucleotídeo de adenina oxidada (FAD) são aconsetos de reações metabólicas. Nad(P)H e FAD exibem autofluorescência e podem ser isolados espectralmente por comprimentos de onda de excitação e emissão. Ambos os aconzymes, NAD(P)H e FAD, podem existir em uma configuração livre ou ligada à proteína, cada uma das quais tem uma fluorescência distinta ao longo da vida - o tempo para o qual o fluorohore permanece no estado animado. A imagem vitalícia da fluorescência (FLIM) permite quantificação da intensidade da fluorescência e das vidas de NAD(P)H e FAD para análise livre de rótulos do metabolismo celular. A intensidade da fluorescência e os microscópios de vida podem ser otimizados para a imagem NAD(P)H e FAD, selecionando os comprimentos de onda de excitação e emissão apropriados. Perturbações metabólicas por cianeto verificam protocolos de imagem de autofluorescência para detectar alterações metabólicas dentro das células. Este artigo demonstrará a técnica de imagem de autofluorescência de NAD(P)H e FAD para medir o metabolismo celular.
Introdução
Metabolismo é o processo celular de produção de energia. O metabolismo celular abrange múltiplas vias, incluindo glicólise, fosforilação oxidativa e glutaminolise. Células saudáveis usam essas vias metabólicas para gerar energia para proliferação e função, como a produção de citocinas por células imunes. Muitas doenças, incluindo distúrbios metabólicos, câncer e neurodegeneração, são caracterizadas pelo metabolismo celular alterado1. Por exemplo, alguns tipos de células cancerígenas têm elevadas taxas de glicólise, mesmo na presença de oxigênio, para gerar moléculas para a síntese de ácidos nucleicos, proteínas e lipídios2,3.<....
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Protocolo
1. Revestimento de células para imagem
- Aspire o meio a partir de um frasco T-75 confluente de 80-90% de células MCF-7, enxágue as células com 10 mL de soro fisiológico estéril tamponado (PBS) e adicione 2 mL de 0,25% de trippsina (1x) para desprender as células do fundo do frasco.
- Incubar o frasco a 37 °C por ~4 min. Verifique as células sob o microscópio para confirmar o desprendimento.
- Adicione imediatamente 8 mL de meio de cultura para desativar a trippsina.
- Coletar as células em um tubo cônico (15 mL ou 50 mL). Conte as células usando um hemócito.
- Centrifugar as células 200 × g por 5 min.<....
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Resultados
A linha de células cancerígenas de mama epitelial, MCF-7, foi cultivada em DMEM suplementada com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% penicilina-estreptomicina. Para a imagem de fluorescência, as células foram semeadas a uma densidade de 4 × 105 células por 35 mm de imagem de fundo de vidro 48 h antes da imagem. As células foram imagens antes e depois do tratamento com cianeto usando os protocolos acima indicados. O objetivo do experimento cianeto é confirmar o isolamento espectral da fluorescência NAD(P)H e FA.......
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Discussão
A intensidade da autofluorescência e a imagem vitalícia têm sido amplamente utilizadas para avaliar o metabolismo nas células21,55. FLIM é de alta resolução e, portanto, resolve células únicas, o que é importante para estudos de câncer, pois a heterogeneidade celular contribui para a agressão tumoral e resistência a medicamentos7,39,41,44,45,46,58.
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Agradecimentos
As fontes de financiamento incluem o Instituto de Prevenção e Pesquisa do Câncer do Texas (CPRIT RP200668) e a Texas A&M University. A Figura 1 foi criada com BioRender.com.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 2-desoxi-d-glicose (2-DG) | Sigma | AC111980000; AC111980010; AC111980050; | |
| Antimicrobiano antibiótico (caneta-estreptococo) | Gibco | 15240096 | |
| Cell Samples | American Type Culture Collection | N/A | MCF-7 cancer line |
| CellProfiler | Broad Institute | N/A | Software de análise de imagem |
| Tubo cônico | VWR | 89039-664 | Tubo cônico de 15 mL |
| DMEM | ThermoFisher | 11965092 | Meio de cultura |
| Espelho dicróico FAD | Semrock | FF495-Di03-25x36 Filtro de | de 495 nm |
| Semrock | FF01-550/88-25 Filtro de | de 550/88 nm | |
| Semrock | FF01-458/64-25 | 458/64 nm | |
| FBS | ThermoFisher | 16000036 | |
| Microscópio vitalício de fluorescência | 3i | N/A | |
| Prato de fundo de vidro | MatTek Corp | P35G-1.0-14-C | |
| Multifotônico Laser | Coerente | N/A | 2P Laser Coerente, Ajustável 680 nm-1080 nm |
| NAD(P)H espelho dicróico | Semrock | FF409-Di03-25x36 | 409 nm |
| Filtro de emissão NAD(P)H | Semrock | FF02-447/60-25 | 447/60 nm |
| Filtro de excitação NAD(P)H | Semrock | FF01-357/44-25 | 357/44 nm |
| PBS | ThermoFisher | 70011044 | |
| cianeto de potássio | Sigma-Aldrich | 380970 | |
| SlideBooks 6 | 3i | N/A | Software de aquisição de imagem |
| SPCImage | Becker & Hickl GmbH | N/A | Software de análise de vida útil de fluorescência |
| Incubadora de Palco | topo okoLab | N/A | |
| Tripsina | Biosciences | 786-262 | |
| Ureia | Sigma-Aldrich | U5128 | |
| YG beads | Polysciences | 19096-2 | Microesferas Yg (20.0 µ m) |
Referências
- Heikal, A. A. Intracellular coenzymes as natural biomarkers for metabolic activities and mitochondrial anomalies. Biomarkers in Medicine. 4 (2), 241-263 (2010).
- Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Optical imaging using en....
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Reimpressões e permissões
