Método de eletroporação eficiente e econômico para estudar vias de sinalização dependentes de cítio primário no precursor da célula de grânulo

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo de eletroporação in vitro reprodutível para manipulação genética de precursores primários de células de grânulo cerebelar (GCPs) que é econômico, eficiente e viável. Além disso, este protocolo também demonstra um método simples para o estudo molecular de vias primárias de sinalização de Ouriço dependentes de cílios em células GCP primárias.

Abstract

O cílio primário é uma organela de sinalização crítica encontrada em quase todas as células que transduzem os estímulos de sinalização de Hedgehog (HH) da superfície celular. No precursor da célula de grânulo (GCP), o cílio primário atua como um centro de sinalização crucial que orquestra a proliferação de células precursoras modulando a via de sinalização HH. A investigação do maquinário de sinalização HH, dependente do cítio primário, é facilitada pela manipulação genética in vitro dos componentes da via para visualizar sua localização dinâmica para o círio primário. No entanto, a transfecção de transgenes nas culturas primárias dos GCPs usando os métodos de eletroporação atualmente conhecidos é geralmente cara e muitas vezes resulta em baixa viabilidade celular e eficiência de transfecção indesejável. Este artigo introduz um protocolo de eletroporação eficiente, econômico e simples que demonstra uma alta eficiência de transfecção de ~80-90% e a viabilidade celular ideal. Trata-se de um método de modificação genética simples, reprodutível e eficiente que é aplicável ao estudo da via de sinalização de Ouriço dependente do cilium primário nas culturas primárias do GCP.

Introduction

Os GCPs cerebelares são amplamente utilizados para estudar o maquinário da via de sinalização HH em tipos de células progenitoras neuronais devido à sua alta abundância e alta sensibilidade à via de sinalização HH em vivo1,2,3,4. Em GCPs, o cílio primário atua como um hub de transdução de sinal HH ^crucial5 que orquestra a proliferação das células precursoras6,7,8. A visualização in vitro de componentes de si....

Protocol

Todos os procedimentos relacionados aos animais foram realizados em conformidade com as diretrizes de manejo animal e o protocolo aprovado pelo Departamento de Saúde de Hong Kong. Licenças de experimentos em animais após a Portaria Animal (Controle de Experimentos) (Cap. 340) foram obtidas do Departamento de Saúde, governo de Hong Kong. O trabalho animal foi realizado em conformidade com a ética de segurança animal aprovada pelo Escritório de Pesquisa da HKBU e pelo Comitê de Segurança laboratorial. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais utilizados neste protocolo.

1. Preparação pr....

Results

Utilizando o Opti-MEM (ver a Tabela de Materiais) como reagente universal, esta metodologia de eletroporação proposta poderia alcançar eficiência de eletroporação consistentemente alta em ~80-90% (Figura 1). A eficiência de eletroporação do vetor Smo-EGFP foi determinada em DIV 2 pós eletroporação por quantificação da porcentagem de células positivas de fluorescência verde em todas as células GCP que expressam proteína de caixa emparelhada-6 (Pax6). A eficiência de eletropor.......

Discussion

A transfecção de transgenes na cultura GCP primária pelo método de eletroporação é tipicamente associada à baixa viabilidade celular e à baixa eficiência de transfecção9,10. Este artigo introduz um protocolo de eletroporação econômico e reprodutível que demonstrou alta eficiência e viabilidade. Além disso, também demonstramos um método simples de estudar a via de sinalização HH dependente do círio primário nas células GCP primárias.

Ou.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cultura GCP
B27 suplemento	Life Technologies LTD	17504044
Filtro de células, 70 µ m	Corning	352350
DNase I de pâncreas bovino	Roche	11284932001
Earle' s Solução salina balanceada	Gibco, Life Technologies	14155063
FBS, qualificado	Thermo Scientific	SH30028.02
GlutamMAXTM-I, 100x	Gibco, Life Technologies	35050061	substituto de L-glutamina
L-cisteína	Sigma Aldrich	C7352
Matrigel	BD Biosciences	354277	Matriz da membrana basal
Neurobasal	Gibco, Life Technologies	21103049
Papaína, suspensão	Worthington Biochemical Corporation	LS003126
Bromidrato de poli-D-lisina	Sigma Aldrich	P6407
SAG	Cayman Chemical	11914-1	Agonista suavizado
IF coloração
Albumina de soro bovino	Sigma Aldrich	A7906
Paraformaldeído	Sigma Aldrich	P6148
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
Mistura de anticorpos primários
Anti-GFP-goat ab	Rockland	600-101-215	Fator de diluição: 1: 1000
do ab monoclonal do rato anti-Arl13b	NeuroMab	75-287	1: 1000
do ab policlonal do coelho anti-Pax6	Covance	PRB-278P	: 1: 1000
Secondary antibody mix
Alexa Fluor 488 burro anti-cabra IgG	Invitrogen	A-11055	Fator de diluição: 1: 1000
Alexa Fluor 555 Fator de diluição IgG anti-rato para burros	Invitrogen	A-31570	1 : 1000
Alexa Fluor 647 anti-coelho para burros IgG	Invitrogen	A-31573	Fator de diluição: 1 : 1000
DAPI	Thermo Scientific	62247	Fator de diluição: 1 : 1000
Electroporation
500 câmara de cubeta	Nepagene	CU500
Cubeta de eletroporação EPA (lacuna de 2 mm)	Nepagene	EC-002
Opti-MEM	Life Technologies LTD	31985070	meio de soro reduzido para transfecção
pEGFP-mSmo	Addgene	25395
Super Eletroporador NEPA21 TIPO II Eletroporador In Vitro e In Vivo	Nepagene	NEPA21