Summary
Detta protokoll beskriver en unik, kliniskt relevant modell av perifera kranskärlens sjukdom som kombinerar femorala gatan och ven elektrokoagulering med administrering av en kväveoxid syntas inhibitor att inducera hindlimb kallbrand i FVB möss. Intracardiac DiI perfusion används sedan för högupplöst, tredimensionell avbildning av fotplattan vaskulatur.
Abstract
Perifera kranskärlens sjukdom (PAD) är en betydande orsak till sjuklighet till följd av kronisk exponering för aterosklerotiska riskfaktorer. Patienter som lider av dess allvarligaste form, kronisk lemhotande ischemi (CLTI), står inför betydande försämringar i det dagliga livet, inklusive kronisk smärta, begränsat gångavstånd utan smärta och icke-healing sår. Prekliniska modeller har utvecklats i olika djur för att studera PAD, men mus hindlimb ischemi är fortfarande den mest använda. Det kan finnas betydande variation som svar på skandinaviska förolämpning i dessa modeller beroende på mus stam som används och platsen, antalet och medel för kranskärlens störningar. Detta protokoll beskriver en unik metod som kombinerar femorala gatan och ven elektrokoagulering med administrering av en kväveoxid syntas (NOS) hämmare att tillförlitligt inducera footpad kallbrand i Friend Virus B (FVB) möss som liknar vävnad förlust av CLTI. Medan traditionella metoder för att bedöma reperfusion såsom laser Doppler perfusion imaging (LDPI) rekommenderas fortfarande, intracardiac perfusion av lipophilic färgämnet 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanin perklorat (DiI) används för att märka vaskulaturen. Efterföljande helmonterade konfokala laserskanningsmikroskopi möjliggör högupplöst, tredimensionell (3D) rekonstruktion av fotplatta vaskulär nätverk som kompletterar traditionella sätt att bedöma reperfusion i hindlimb ischemia modeller.
Introduction
Perifer arteriell sjukdom (PAD), kännetecknas av minskat blodflöde till extremiteterna på grund av åderförkalkning, påverkar 6,5 miljoner människor i USA och 200 miljoner människor över hela världen1. Patienter med PAD upplever nedsatt lemfunktion och livskvalitet, och de med CLTI, den allvarligaste formen av PAD, löper ökad risk för amputation och död med en 5-årig dödlighet som närmar sig 50%2. I klinisk praxis anses patienter med ankel-brachial index (ABI) <0,9 ha PAD, och de med ABI <0,4 i samband med antingen vilosmärta eller vävnadsförlust som att ha CLTI3. Symtomen varierar mellan patienter med liknande ADI beroende på daglig aktivitet, muskeltolerans mot ischemi, anatomiska variationer och skillnader i säkerhet utveckling4. Siffer- och lem kallbrand är den allvarligaste manifestationen av alla vaskulär ocklusiva sjukdomar som resulterar i CLTI. Det är en form av torr nekros som mumifierar mjukvävnaderna. Förutom aterosklerotisk PAD kan det också observeras hos patienter med diabetes, vaskuliter som Buergers sjukdom och Raynauds fenomen, eller calciphylaxi i inställningen av njursjukdom i slutstadiet5,6.
Flera prekliniska modeller har utvecklats för att studera patogenesen vid PAD/CLTI och testa effekten av potentiella behandlingar, varav den vanligaste är mus hindlimb ischemi. Inducera hindlimb ischemi hos möss uppnås vanligtvis genom obstruktion av blodflödet från iliaca eller femorala artärer, antingen genom sutur ligatur, elektrokoagulering eller andra sätt att begränsa det önskade kärlet7. Dessa tekniker drastiskt minska perfusion till hindlimb och stimulera neovascularization i lår och kalv muskler. Det finns dock väsentliga murin stamberoende skillnader i känslighet för skandinavisk förolämpning delvis på grund av anatomiska skillnader i säkerhet distribution8,9. Till exempel är C57BL/6 möss relativt resistenta mot hindlimb ischemi, visar minskad lem funktion men i allmänhet inga tecken på kallbrand i fotplattan. Å andra sidan har BALB/c möss en inneboende dålig kapacitet att återhämta sig från ischemi och vanligtvis utveckla auto-amputation av foten eller underbenet efter femorala arteriell ligatur ensam. Detta allvarliga svar på ischemi begränsar det terapeutiska fönstret och kan utesluta longitudinell bedömning av lem reperfusion och funktion. Intressant nog har genetiska skillnader i en enda kvantitativ egenskap locus ligger på murine kromosom 7 varit inblandade i dessa differentiella känsligheter av C57BL/6 och BALB/c möss till vävnad nekros och lem reperfusion10.
Jämfört med C57BL/6 och BALB/c stammar, FVB möss visar ett mellanliggande men inkonsekvent svar på femorala gatan ligatur ensam. Vissa djur utvecklar fotpad kallbrand i form av svarta ischemiska naglar eller mumifierade siffror, men andra utan några stora tecken på ischemi11. Samtidig administrering av Nω-Nitro-L-arginin metylesterhydroklorid (L-NAME), en nitrisk oxidsyntas (NOS) hämmare12, förhindrar kompensatoriska vasodilatory mekanismer och ytterligare ökar oxidativ stress i hindlimb vävnad. I kombination med femorala gatan ligatur eller koagulering, producerar detta tillvägagångssätt konsekvent footpad vävnad förlust i FVB möss som liknar de bestod förändringarna av CLTI men sällan utvecklas till lem auto-amputation11. Oxidativ stress är ett av kännetecknen för PAD/CLTI och förökas av endotel dysfunktion och minskad biotillgänglighet av kväveoxid (NO)13,14. NEJ är en pluripotent molekyl som vanligtvis utövar positiva effekter på arteriellt och kapillärblodflöde, trombocyt vidhäftning och aggregering samt leukocytrekrytering och aktivering13. Minskade nivåer av NOS har också visat sig aktivera angiotensin-omvandla enzymet, som inducerar oxidativ stress och påskyndar utvecklingen av ateroskleros15.
När en modell av hindlimb ischemi är etablerad, övervakning efterföljande lem reperfusion och den terapeutiska effekten av eventuella behandlingar behövs också. I den föreslagna murin kallbrandsmodellen kan graden av vävnadsförlust först kvantifieras med hjälp av Faber-poängen för att bedöma fotens bruttoutseende (0: normalt, 1-5: förlust av naglar där poängen representerar antalet drabbade naglar, 6-10: atrofi av siffror där poängen representerar antalet siffror som påverkas, 11-12: partiell och fullständig fotatrofi, respektive)9. Kvantitativa mätningar av hindlimb perfusion görs sedan vanligtvis med hjälp av LDPI, som förlitar sig på Doppler interaktioner mellan laserljus och röda blodkroppar för att indikera pixelnivåperfusion i en region av intresse (ROI)16. Även om denna teknik är kvantitativ, icke-invasiv och idealisk för upprepade mätningar, ger den inte granulära anatomiska detaljer i hindlimb vaskulatur16. Andra bildframställning modaliteter, såsom mikro-datortomografi (micro-CT), magnetisk resonans angiografi (MRA) och röntgen mikroangiography, visar sig antingen kostsamma, kräver sofistikerad instrumentering, eller på annat sätt tekniskt utmanande16. 2008 beskrev Li et al. en teknik för märkning av blodkärl i näthinnan med det lipofila karbacyyaninfärgämnet DiI17. DiI införlivar i endotelceller och, genom direkt diffusion, fläckar vaskulär membran strukturer såsom angiogena groddar och pseudopodala processer17,18. På grund av dess direkta leverans till endotelceller och färgämnets mycket fluorescerande natur ger denna procedur intensiv och långvarig märkning av blodkärl. 2012 anpassade Boden et al. tekniken för DiI perfusion till murine hindlimb ischemi modellen via hela mount imaging av skördade lår adductor muskler efter femorala arteriell ligatur19.
Den nuvarande metoden ger ett relativt billigt och tekniskt genomförbart sätt att bedöma neovaskularisering som svar på hindlimb ischemi och gen- eller cellbaserade terapier. I en ytterligare anpassning beskriver detta protokoll tillämpningen av DiI perfusion för att avbilda footpad vaskulatur i hög upplösning och 3D i en murin modell av hindlimb kallbrand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök som beskrivs i protokollet godkändes av University of Miami Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). FVB-möss, både manliga och kvinnliga, i åldern 8-12 veckor, användes för studien.
1. Beredning av L-NAME-lösning
- Under sterila förhållanden i en laminär flödeshuv bereder du en L-NAME-stamlösning genom att lösa upp 1 g L-NAME-pulver (se Materialtabell) med 20 ml sterilt vatten för att göra en lösning på 50 mg/ml. Förvara lagerlösningen i 300-500 μL alikvoter vid -20 °C i upp till 3 månader.
- För att göra en fungerande L-NAME-lösning, tina upp en alikvot L-NAME-stamlösning och späd med PBS (1:4) under sterila förhållanden för att erhålla en slutlig koncentration på 10 mg/ml.
- För att förbereda PBS (pH 7.4), lös upp 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 och 0,23 g NaH2PO4 i 800 ml destillerat vatten. Justera pH till 7,4 med HCl. Tillsätt vatten till en total volym på 1 000 ml och filtrera genom ett flaskfilter på 0,22 μm.
OBS: Intraperitoneal (IP) injektion av 4 μL/g L-NAME arbetslösning motsvarar önskad 40 mg/kg dos av L-NAME. L-NAME arbetslösning bör förvaras på is under användning och nya utspädningar bör göras dagligen med hjälp av nyupptinade alikvoter av lagerlösning.
2. Kemisk och kirurgisk induktion av baklimb kallbrand
- Skaffa FVB-möss i åldern 8-12 veckor, antingen från en uppfödare eller uppfödd anläggning (se Materialförteckning). 2 h före operationen, administrera en IP-dos på 40 mg/kg av L-NAME.
- Bedöva möss med IP-injektion på 100 mg/kg ketamin och 10 mg/kg xylazin (se Tabell över material) utspädd i PBS. Bekräfta adekvat sedering genom avsaknad av toe-pinch reflex och fortsätt att övervaka andningsfrekvensen under förfarandet.
- Ta bort hår från bilaterala bakben och ljumskar med sax och/eller depilatorisk kräm. Placera djuret under ett kirurgiskt mikroskop supine; förlänga och tejpa extremiteterna på plats. Sterilisera det kirurgiska fältet genom att omkrets applicera povidone-jodlösningen på operationsstället.
- Under 10-20x förstoring, använd sax eller en skalpell för att göra ett 1 cm snitt längs ljumsken som är bara sämre än det inguinala ligamentet. Använd fina tångar och en steril bomullsspetsapplikator för att trubbigt dissekera den inguinally fettkudden från inguinally ligament och exponera den underliggande femorala slidan så att lårbensartären, venen och nerven är tydligt identifierade (figur 1).
- Använd fina tångar, genomborra lårbensslidan. Borsta försiktigt lårbensnerven bort från lårbensartären. Identifiera start av den laterala cirkumflex grenen av lårbensartären (LCFA) djupt till lårbensnerven (figur 1).
- Fortsätt med elektrokoagulering av lårartären och venen som bara är proximal till LCFA genom att aktivera cautery-enheten (se Materialtabellen) och försiktigt kontakta kärlen med en rörelse från sida till sida, vilket säkerställer att lårbensnerven är väl isolerad och förblir skyddad från termisk skada. Dela det koagellerade kärlsegmentet med sax.
- Fortsätt med exponeringen av den distala femorala artären och venen genom att mobilisera inguinal fett pad medially. Identifiera den ytliga epigastric gatan och saphenopopliteal korsningen mer distally.
- Genomborra lårbensslidan mellan dessa två platser och dissekera försiktigt lårbensnerven bort från lårbenskärlen. Fortsätt med koagulering och transection av lårbensartären och venen enligt beskrivningen i steg 2.4.1.
- Bevattna operationsfältet med en spruta fylld med steril PBS. Få hemostas genom att applicera mjukt tryck med en bomullsspetsapplikator i 3-5 min till alla blödningsområden.
- Fortsätt med stängningen av snittet med absorberbar 5-0 sutur på ett enkelt kontinuerligt sätt. Administrera en subkutan dos på 1 mg/kg av buprenorfin med ihållande frisättning (se materialtabell) för postoperativ smärtlindring.
- Bekräfta förlust av fotplattan perfusion i ligated hindlimb av LDPI (se Tabell över material). Medan du fortfarande sövde, placera djuret på en mörk skumplatta i en benägen position under LDPI-maskinen och använd slingor av elektrisk tejp för att säkra fötterna på plats.
- Fortsätt med LDPI av bilaterala fötter. När skanningen är klar ritar du en ROI runt varje fotplatta och får medelvärdesvärdena.
- Beräkna perfusionsindexet som förhållandet mellan medelvärdesflödesvärden från det ligerade till icke-ligerade fotplattan. Kontrollera att perfusionsindexet är mindre än 0,1.
- Överför djuret tillbaka till en ren bur med en värmeplatta eller overheadlampa för att bibehålla kärntemperaturen. Se till fullständig återhämtning från anestesi innan du överför möss tillbaka till djuranläggningen.
3. Postoperativ administrering av L-NAME och övervakning av kallbrand
- Under postoperativa dagar 1-3, administrera ytterligare 40 mg/kg IP-dos av L-NAME till varje djur. Samtidigt noggrant utvärdera foten från den ischemiska delen.
- Kvantifiera graden av hindlimb ischemi och kallbrand med hjälp av Faber hindlimb ischemia score9. Poäng 1-5: antal ischemiska naglar; poäng 6-10: 1-5 ischemiska siffror; poäng 11 och 12: partiell och fullständig fotatrofi. Spela in Faber poäng på postoperativa dagar 1-3 och sedan varje vecka.
4. Beredning av DiI och arbetslösningar för djurperfusion
- För att förbereda DiI-stamlösningen, lös upp 100 mg DiI-kristaller (se Materialtabell) i 16,7 ml 100% etanol. Täck i aluminiumfolie och lämna på en gungplattform över natten i mörkret vid rumstemperatur.
- För att förbereda spädningen, lös upp 50 g glukos i 1 000 ml destillerat vatten för att ge en 5% glukoslösning. Filtrera genom ett 0,22 μm flaskfilter. Blanda PBS och 5% glukoslösningar i ett 1:4-förhållande för att förbereda en fungerande spädninglösning.
5. Utrustningsinställning och DiI perfusion
- Gör DiI-arbetslösningen genom att tillsätta 200 μL DiI-buljonglösning till 10 ml av den fungerande späddluentlösningen (beredd i steg 4.2) omedelbart före användning. Skaka för hand för att blanda väl.
- Anslut två eller tre 3-vägs kranar och en 25 G fjärilsnål i serie. Förbered 10 ml sprutor med 4 ml PBS, 10 ml DiI-lösning och 10 ml 10 % neutralt buffrat formalin (se Materialtabell).
- Anslut sprutan med formalin till den proximala inflödesporten och injicera lösningen för att spola luft från linjen; vrid på kranen för att stänga porten. Upprepa samma procedur sekventiellt, anslut sprutorna med DiI och sedan PBS till mitten respektive distala inflödesportar, var noga med att spola alla luftbubblor genom kranenheten.
OBS: Se till att det inte finns några luftbubblor i någon del av kranenheten eller slangen. Luftbubblor kan ockluderade små artärer under perfusion vilket resulterar i dålig intravaskulära DiI distribution och komprometterade bildframställning resultat. - När installationen är klar, avliva djuret genom CO2-överdosering i en induktionskammare.
- Placera djuret som ska perfunderas i ett supinläge på en absorberande dyna och säkra axiller och nedre extremiteter med nålar.
- Använd sax, gör ett tvärgående snitt för att öppna bukhålan. Exponera och dela sedan vänster och höger membran för att komma åt brösthålan.
- Skär bröstväggen på vardera sidan av bröstbenet från de nedre revbenen till det första eller andra revbenet och undvik de inre bröstartärerna medialt. Använd en hemostat (se Materialtabell) för att greppa bröstbenets nedre ände och reflektera den mot djurets huvud för att exponera brösthålan.
- Identifiera den vänstra ventrikeln, som verkar ljusare i färg än höger kammare. Ta försiktigt tag i hjärtat med trubbiga tångar och sätt in fjärilsnålen i vänster kammare.
- Använd en sax eller en 18 G nål för att punktera rätt förmak, så att blod- och perfusionslösningar kan återvända till hjärtat för att dräneras. Stabilisera nålen med en eller två händer, var försiktig så att du inte oavsiktligt punkterar höger kammare och perfuserar lungan snarare än systemcirkulationen.
- Öppna porten till sprutan med PBS och injicera manuellt 2-4 ml med en hastighet av 1-2 ml/min i 1-2 min för att spola blod från kärlsystemet. Säkerställ framgångsrik perfusion genom att observera blödning från rätt förmak. Stäng sedan injektionen porten på PBS-sprutan.
- Öppna porten till sprutan med DiI och injicera 5-10 ml med en hastighet av 1-2 ml/min i 5 min. Övervaka öron, näsa och handflator som ska bli något rosa med injektionen av DiI-lösning. Efter injektionen stänger du diI-sprutans port och väntar i 2 minuter för att tillåta inkorporering av färgämnet före injektion av fixativ.
- Öppna porten till sprutan med formalin och injicera 5-10 ml med en hastighet av 1-2 ml/min i 5 minuter. Efter injektionen, ta bort nålen från vänster kammare och fortsätt att skörda vävnaderna av intresse.
- Använd tung sax, flytta skenbenet vid fotleden, helt separera vänster och höger fot från underbenen. Placera skördade fötter i en 6- eller 12-välplatta med 1-2 ml 10% formalinlösning. Linda plattan med folie och förvara vid 4 °C över natten.
6. Beredning av fotplatta vävnad för konfokal laser scanning mikroskopi
- Nästa dag, byt ut den fixativa lösningen i 6- eller 12-brunnsplatta med 1-2 ml PBS per brunn.
- För att flå foten, gör först ett längsgående snitt med en skalpell på plantaren och dorsala aspekter av foten. Sedan, med tandade tångar och en liten hemostat, ta försiktigt bort all hud från foten och siffrorna, vilket inte skadar de underliggande mjuka vävnaderna.
- Fortsätt till montering och avbildning av vävnader, helst inom 1-2 dagar efter perfusion och skörd. Alternativt kan du returnera fotplattor till 6- eller 12-brunnsplattor med 1-2 ml PBS; täck med folie och förvara vid 4 °C för att bibehålla fluorescensen i upp till 1 månad.
- För att montera vävnader placerar du fötterna individuellt mellan två glasmikroskopbilder med en skumbiopsiplatta vikt över sig själv (en eller två gånger beroende på vävnadstjocklek) i varje ände (se Materialtabell). Använd två små bindemedelsklämmor för att komprimera glasglasen i varje ände (slutlig tjocklek ca 1 mm).
OBS: Tjockare vävnader kräver längre skanningstider. Den flådda fotplattan kan komprimeras mellan glasrutschbanor en dag före avbildning för att minska vävnadens tjocklek.
7. Konfokal laserskanningsmikroskopi
- Förbered avbildningssessionen: slå på bildsystemet och starta anskaffningsprogrammet (se Tabell över material). Använd ett mål med låg förstoring/låg numerisk bländare (t.ex. x5/0.15) för att ta bilder eftersom linser med lägre förstoring vanligtvis har längre arbetsavstånd som krävs för det här experimentet.
- Klicka på Ja till dialogrutan Aktivera scen. Aktivera 561 nm-lasern på fliken Konfiguration. Aktivera en synlig strålbana på huvudskärmen genom att klicka på knappen Synlig . Ställ in en detektor på intervallet 570-600 nm genom att klicka på motsvarande aktiv kryssruta.
- Välj ikonen Panelsökning på fliken Hämta > förvärv och ange önskad upplösning (512 x 512 eller 1024 x 1024).
- Placera torrmonterat (inget vatten eller PBS tillsatt) vävnadsprov komprimerat mellan glasrutschbanor på mikroskopstadiet och sätt vävnaden i fokus.
- Om du vill ange skanningsgränserna navigerar du till det övre vänstra eller högra hörnet av exemplet. Klicka på knappen Markera position under menyn Panelsökning på fliken Förvärv. Navigera till det motsatta hörnet (nedre högra respektive vänster) och klicka på knappen Markera position igen.
- Om du vill ställa in djupet på Z-stacken klickar du på Live-knappen längst ned till vänster på skärmen och navigerar till mitten av exemplet. Använd z-axelratten för att bläddra igenom till botten av provet.
- Klicka på knappen Börja under Z-Stack-menyn på fliken Förvärv. Bläddra igenom till toppen av exemplet och klicka på slutknappen . Klicka på Z-stegstorlek och ställ in önskad värde (t.ex. 50 μm).
- I det nedre högra hörnet av skärmen klickar du på Start för att börja bildförvärv.
8. Kvantitativ analys och 3D-rekonstruktion av fotplatta vaskularitet
- Ladda ner och installera den senaste versionen av Fiji (ImageJ) samt Vessel Analysis plugin20. Öppna mikroskopibildfiler i Fiji, som kombinerar enskilda Z-serier till Z-staplar som kan ses i z-axeln med skjutreglaget längst ner i bilden.
- Markera den sammansatta Z-stackbilden och välj sedan Staplar > Z-projekt under menyn Bild för att skapa en tvådimensionell projektion. Konvertera sedan Z-projektionen till binär under Process > Binary > Make Binary.
- Kör vaskulära densitet plugin under Plugins > Vaskulär densitet. När du uppmanas att använda markören för att spåra en ROI runt omkretsen av fotplattan och siffrorna. Notera den fartygstäthet som rapporteras, som uttrycks som en procentandel av avkastningen (vaskulär områdesfraktion).
- Om du vill skapa 3D-rekonstruktioner i Fiji väljer du Staplar > 3D-projekt och ställer in önskad rotationsaxel, vinkel och hastighet under menyn Bild. Du kan också välja Volymvisare under Plugins-menyn för att visualisera bilder som segment eller manipulera rekonstruktionen i önskade axlar.
- För mer involverad 3D-rendering, använd alternativ bildanalys och bearbetningsprogram (se Tabell över material). Konvertera filer till önskad programvaras format och sy enskilda kakelskanningar med hjälp av kakelsömfunktionen.
- När du har sytt ihop enskilda kakelskanningar öppnar du den sammansatta filen och fortsätter med volymytans rendering. Klicka på Lägg till ny yta för att öppna guiden Skapa Surface och använda pilarna för att växla igenom menyer, särskilt genom att ställa in AVKASTNINGEN och tröskelvärdesintensiteten. När du är nöjd med ytåtergivningen använder du animeringsfunktionen för att skapa videor av den bearbetade bilden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll beskriver ett tillförlitligt sätt att inducera ischemi och vävnad förlust i murine fotplattan med hjälp av en kombination av femorala gatan och ven koagulering med L-NAME administration, en kväveoxid syntas inhibitor, i mottagliga FVB möss. Figur 1 beskriver anatomin hos murine hindlimb vaskulaturen och anger platserna för femorala gatan och ven koagulering (gul X), bara proximal till den laterala cirkumflex femorala gatan (LCFA) och proximal till saphenopopliteal korsningen. LCFA måste identifieras, och koagulering platser respektive denna struktur hålls konsekvent under alla kirurgiska ingrepp. Som beskrivits, 2 h före kirurgiska ingrepp och på postoperativa dagar 1-3, möss administrerades också 40 mg/kg IP av L-NAME för att upprätthålla förhöjda vävnad nivåer av oxidativ stress. Figur 2 visar variationen i vävnadsförlust som kan förväntas från denna modell en vecka efter operationen, med Faber-poäng9 inspelade i det nedre högra hörnet av varje bild.
DiI perfusion utfördes i FVB möss 5 och 20 dagar efter femorala gatan och ven koagulering att bedöma hindlimb reperfusion efter induktion av ischemi. Figur 3A illustrerar murin anatomi efter dissekering för att exponera brösthålan. En fjärilsnål sätts in i den vänstra ventrikeln för att påbörja hjärtperfusion. Observera att den vänstra ventrikeln verkar något blekare i färg än höger ventrikel. Figur 3B visar utrustningen som är inställd med kranar anslutna i serie och tre sprutor fyllda med PBS, DiI-lösning och fixativ. Efter DiI perfusion skördades, flåddes och komprimerades fötter mellan mikroskopbilder som visas i figur 3C,D före avbildning med ett konfokal laserskanningsmikroskop under 5x förstoring. Återuppbyggnad mikroskopi bilder visade normala vaskulär anatomi i icke-ligated kontroll footpad (figur 4A) jämfört med allvarligt minskad perfusion till fotplattan av ligated hindlimb 5 dagar efter kirurgi (figur 4B). Tjugo dagar efter operationen förbättrades perfusionen till fotplattan avsevärt (figur 4C, D och figur 5B), men inte i den utsträckning som icke-ligerad kontroll (figur 4A och figur 5A). Vascularity kvantifierades enligt beskrivningen ovan med hjälp av Vessel Density plugin i Fiji. Vaskulär fraktionen för kontroll fotplattan var 28%. Fem dagar efter kirurgi, footpad vaskulär fraktion minskades allvarligt till 2% men gradvis återhämtade sig till 15% och 18% i två separata möss med 20 dagar postoperatively. För att visualisera fotplattans vaskulär anatomi i 3D importerade vi en sydd mikroskopibild till alternativ bildanalys och bearbetningsprogram för att skapa en ytåtergivning som beskrivits tidigare (kompletterande figur 1). En video av ytåtergivningen skapades sedan med hjälp av animeringsfunktionen (Video 1).
Figur 1: Murin hindlimb vaskulaturens anatomi och platser i lårartären och venkoagulering. Den yttre iliaca gatan fortsätter som femorala gatan (FA) distala till inguinallymfknutor ligament. De första grenarna av lårbensartären inkluderar lateral cirkumflex (LCFA) och djupa femorala artärer (inte på bilden). Mer distally, proximala kaudala femorala (PCFA) och ytliga kaudala epigastric artärer (SCEA) grenen från FA proximal till bifurcation av saphenous (SA) och popliteal artärer (PA). Lårbensnerven (FN) kurser tillsammans med lårbenskärlen och bör försiktigt isoleras före koagulering av lårbenskärlen. FA och femorala vener (FV) koaguleringsplatser anges också (X). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Representativa bilder av baklimb kallbrand i FVB-möss med motsvarande Faber-poäng. Graden av ischemiska förändringar som induceras av denna modell varierar från en eller flera ischemiska naglar (Faber poäng 1-5) till gangrenösa siffror (Faber poäng 6-10) och partiell eller fullständig fotatrofi. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Djurdesektion och utrustningsinställning för DiI perfusion och montering av musfot för avbildning. (A) Anatomiskt fotografi av murinanatomin under DiI-perfusion. Buk- och brösthålorna öppnas, bröstbenet reflekteras och revbenen skärs på vardera sidan av bröstbenet. En 25 G fjärilsnål ansluten till kranenheten sätts in i den vänstra ventrikeln. (B) Tre tre trevägskranar är sammankopplade i serie. Tre 10 ml sprutor fylls med fixativ, DiI och PBS och ansluts till kranenheten. En 25 G fjärilsnål är ansluten till utflödesporten på den proximala kranen. (C) Montering av flådd fot mellan två mikroskopbilder med en vikt skumbiopsikudde och bindemedelsklämma i varje ände för att komprimera bilderna tillsammans. D) En alternativ vy av den flådda foten komprimerad mellan mikroskopbilderna. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Representativa 5x-bilder som erhållits genom konfokal laserskanningsmikroskopi av musfotmattan efter DiI-perfusion med kvantifierad kärltäthet uttryckt som en procent av ROI. (A) Normal fotplatta vaskulatur. (B) Fotplatta vaskulatur 5 dagar efter femorala artären och ven koagulering visar kraftigt minskad perfusion med minimal fartyg opacification. (C) Fotplatta vaskulatur 20 dagar efter femorala gatan och ven koagulering visar viss rekonstitution av distala flöde till metatarsala och digitala artärer. (D) Bild av en extra musfotplatta som erhållits 20 dagar efter lårbensartären och venkoagulering som visar minimalt stort kärl jämfört med mikrovaskulär opacification. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 5: Förstorade bilder av fotplattans vaskulatur. (A) 5x och 20x bilder av kontroll fotpad vaskulatur visar intakt perfusion via metatarsala och digitala artärer. (B) 5x och 20x bilder av fotmatta från ligated hindlimb 20 dagar postoperatively visar minskad perfusion via större metatarsala kranskärlens grenar men utvecklingen av ett omfattande, plysch kapillär nätverk. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Video 1: Animering av 3D-ytåtergivningen av fotplattans vaskulatur. Video som visar en ytåtergivning av fotplattan vaskulatur illustrerar 3D-upplösningen som kan uppnås med det beskrivna protokollet. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Kompletterande figur 1: Steg i ytåtergivningen av DiI perfusionsbilder. (A) Original DiI perfusionsbild importerad till bildanalys och bearbetningsprogram. (B) Ytåtergivning överlagrad på DiI perfusionsbild under inställningen av tröskelvärdesintensiteten. (C) Slutlig 3D-ytåtergivning av DiI perfusion mikroskopibild. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Medan mus hindlimb ischemi är den mest använda prekliniska modellen för att studera neovaskularisering i PAD och CLTI, finns det betydande variation i ischemi svårighetsgrad och återhämtning beroende på den specifika mus stam som används och platsen, antalet och metoden för kranskärlens störning. Kombinationen av femorala arteriell ligatur och IP administration av L-NAME kan tillförlitligt inducera hindlimb kallbrand i FVB möss11. Samma behandling resulterar i hindlimb ischemi utan vävnad förlust i C57BL/6 möss, medan i BALB/c möss, auto-amputation av foten eller benet kan induceras av femorala arteriell ligatur ensam. Som sådan ger den ovan beskrivna tekniken för femorala gatan koagulering med samtidig L-NAME administration i FVB möss, som har ett mellanliggande svar på ischemi förolämpning, en unik och reproducerbar modell av fotpad kallbrand som liknar den som ses i den allvarligaste manifestationen av sjukdomar som leder till CLTI. Graden av vävnad förlust observeras med denna modell kan variera från några skandinaviska naglar till flera gangrenous siffror men sällan utvecklas till auto-amputation av foten eller benet, vilket möjliggör longitudinell bedömning av lem reperfusion och funktion. Till skillnad från BALB/c möss, där uppkomsten av kallbrand är snabb med lem auto-amputation vanligtvis förekommer i mindre än en vecka, finns det fördröjd uppkomsten av vävnad förlust i denna FVB mus kallbrand modell. Femoral artär koagulering begränsar kraftigt blodflödet till hindlimb. Fortfarande, ackumulering av oxidativ stress på grund av att L-NAME administration på postoperativa dagar 0-3 är mer gradvis, med topp atrofiska förändringar observeras mellan 7-14 dagar. Därför erbjuder denna modell ett förbättrat terapeutiskt fönster för att utvärdera effekterna av en viss intervention på brutto vävnad utseende och räddning av vävnad förlust förutom att kvantifiera reperfusion och bedöma lem funktion.
När det gäller kirurgisk teknik gynnas koagulering eller ligatur av både lårbensartären och venen på grund av den relativa lättheten i denna operation jämfört med isoleringen av lårbensartären. Medan denna teknik kan leda till venös trombos och otillräcklighet, det föreningar den skandinaviska förolämpningen och hjälper till att inducera gangrenous förändringar mer tillförlitligt. Dessutom är kronisk venös otillräcklighet (CVI) mycket utbredd i den allmänna befolkningen, med 10%-30% av vuxna drabbade. Genomgående har cirka 20% av patienterna med PAD, särskilt de med svår kranskärlens otillräcklighet, också komorbid CVI21,22. Oavsett om man bestämmer sig för att liga eller koagulera lårbensbenet, är det oerhört viktigt att upprätthålla de specifika platser av femorala artärer störningar konstant över experimentella grupper. Mer proximala ligagers, såsom iliaca gatan, leder till ocklusion av ytterligare nedströms säkerheter och begränsa möjligheten för arteriogenesis8,16. Angiogenes i den distala delen av lemmen, särskilt gastrocnemius muskeln, bör dock fortfarande utlösas. I FVB möss inducerar dubbel ligatur eller koagulering av lårbensartären bara proximal till den laterala cirkumflex femorala gatan och proximal till saphenopopliteal bifurcation mer konsekvent kallbrand än en enda ligatur eller koagulering webbplats.
Det bör noteras att hos PAD- och CLTI-patienter orsakas ben ischemi av aterosklerotisk obstruktion (en kronisk process). Däremot induceras i musmodeller lem ischemi kirurgiskt (en akut process). Även om denna FVB mus hindlimb kallbrand modell har en relativt långsammare uppkomsten av kallbrand med fördröjd topp svårighetsgraden av vävnad förlust, är det inte direkt jämförbart med kroniska, progressiva kranskärlens stenos karakteristiska pad och CLTI. Andra grupper har utvecklat subakuta femorala arteriell ocklusion tekniker med hjälp av ameroid constrictors bestående av en yttre metallhylsa och ett inre lager av fuktabsorberande material som gradvis själv expanderar. Denna teknik har visat sig resultera i minskat uttryck av inflammatoriska markörer, lägre blodflöde återhämtning vid 4-5 veckor och minskad muskelnekros23,24. Andra än skillnader i ischemi acuity, prekliniska modeller som använder unga, friska djur misslyckas också med att replikera riskfaktorer såsom diabetes, hypertoni, fetma, hyperlipidemi, rökning och infektion som bidrar till stora biverkningar och bördan av vaskulär sjukdom.
I de flesta studier av murin hindlimb ischemi, återställande av blodflödet till ischemiska hindlimb bedöms vanligtvis via LDPI24,25. Denna metod är icke-invasiv och repeterbar men kan påverkas av kärn kroppstemperatur, anestesi användning, hår närvaro, och positionering av hindlimbs26. Standardisering av dessa procedurer och användning av icke-ligated hindlimb som en intern kontroll kan bidra till att mildra eventuella variationer. I motsats till LDPI ger mikro-CT och MRA högupplöst, 3D anatomisk information men kräver traditionellt injektion av kontrastmedel16. Röntgenmikroangiografi är också invasiv och tekniskt utmanande16,27. Liksom DiI möjliggör perfusion med radioaktiva silikongjutningsmedel postmortem 3D-rekonstruktion av den perifera vaskulaturen28. Intracardiac eller svansvenin injektion av fluorescerande lektin har också beskrivits för märkning av vävnad vaskulatur29. Efter skörd av vävnader av intresse används immunohistokemisk färgning med endotelspecifika markörer (t.ex. CD31, von Willebrand faktor) ofta för att kvantifiera kapillär densitet30.
Jämfört med de tekniker som nämns ovan ger DiI perfusion flera fördelar. För det första är de reagenser och material som krävs relativt billiga, förutsatt att tillgång till ett konfokalt laserskanningsmikroskop finns tillgängligt. Denna metod möjliggör 3D-rekonstruktion av vaskulaturen, som kan kvantifieras med hjälp av bildanalysprogramvara. Medan detta protokoll fokuserar på fotpad vaskulatur, hel-mount imaging av andra murine hindlimb vävnader, särskilt gastrocnemius och adductor muskler, är också genomförbart och relevant för angiogenes och arteriogenesis19 studier. Denna teknik kan modifieras för större djurmodeller, inklusive råttor och kaniner, genom att öka volymen av perfusionslösningar. Bildframställning begränsningar avseende vävnad storlek beskrivs dock nedan.
Kritiska delar av DiI perfusion är följande. Luftbubblor i apparaten kan ockludera små kärl och hindra distributionen av DiI i hela vaskulaturen, vilket påverkar bildframställningsresultaten. Som sådan måste man vara noga med att avlägsna eventuella luftbubblor i kranapparaten och slangarna före perfusion. Filtrering av alla lösningar utom DiI genom ett 0,22 μm flaskfilter rekommenderas också för att avlägsna eventuella mikropartiklar. Under intracardiac perfusion, övervaka noggrant lungorna. Om de blir förstorade och blir rosa i färg är detta ett tecken på att fjärilsnålen har trängt igenom till höger kammare och måste dras tillbaka något.
En viktig begränsning av DiI perfusion är förfarandets terminalkaraktär, som inte tillåter upprepade mätningar. Eftersom dåliga perfusion resultat kan återspegla underliggande kranskärlens otillräcklighet eller tekniska fel, skörda och imaging den icke-ligated hindlimb som en intern kontroll rekommenderas. När det gäller avbildning är optimal vävnadstjocklek för laserpenetration ~ 1 mm efter komprimering. Följaktligen kräver större vävnader att sektionering i mindre bitar monteras på diabilder och rymmas på mikroskopstadiet och proportionellt längre bildförvärvstider.
Sammanfattningsvis beskriver detta protokoll en unik preklinisk modell för att studera PAD och CLTI. Specifikt inducerar femorala artären och venkoagulering med samtidig administrering av L-NAME, en NOS-hämmare, på ett tillförlitligt sätt vävnadsförlust i fotplattorna hos FVB-möss. Post-mortem, intracardiac DiI perfusion används sedan för att märka vaskulaturen fluorescerande. Efterföljande hela montering imaging av skördade fötter med confocal laser scanning mikroskopi möjliggör högupplöst, 3D återuppbyggnad av footpad vaskulatur och visualisering av kranskärlens och kapillär nätverk som kompletterar traditionella sätt att bedöma reperfusion i hindlimb ischemi modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag till Z-J L och OC V från National Institutes of Health [R01HL149452 och VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)]. Vi tackar också Mikroskopi- och bildbehandlingsanläggningen i Miami Project to Cure Paralysis vid University of Miami School of Medicine för att ha gett tillgång till deras bildanalys- och bearbetningsprogram.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binder clips (small) | Office supply store | ||
| Buprenorphine (sustained-release) | |||
| Butterfly needle (25 G with Luer-Lok) | VWR | 10148-584 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5 | |
| DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D282 | |
| Electrocautery device | Gemini Cautery System | 5917 | |
| Ethanol (100%) | VWR | 89370-084 | |
| Fiji (ImageJ) software | NIH | Used version 2.1.0. Free download, no license required. | |
| Foam biopsy pads | Fisher Scientific | 22-038-221 | |
| Formalin (neutral buffered, 10%) | VWR | 89370-094 | |
| FVB mice | Jackson Laboratory | 001800 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HCl (1 M) | Sigma-Aldrich | 13-1700 | |
| Imaris software | Oxford Instruments | Used version 9.6.0. | |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-04 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Ketamine | |||
| L-NAME (Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride) | Sigma-Aldrich | N5751 | |
| Laser Doppler perfusion imager | MoorLDI | moorLDI2-HIR | Used moorLDI V5 software. |
| Microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | VWR | 48311-703 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8263 | |
| Needles (27 G) | BD | 305109 | |
| Povidone-iodine swabstick (10%) | Medline | MDS093901ZZ | |
| Surgical instruments | Roboz Surgical | Fine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended. | |
| Suture (5-0 absorbable) | DemeTECH | G275017B0P | |
| Syringes (10 mL) | BD | 305482 | |
| Three-way stopcocks | Cole-Parmer | 19406-49 | |
| Vascular Analysis Plugin | Free download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015). | ||
| Xylazine |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139 (2020).
- Duff, S., Mafilios, M. S., Bhounsule, P., Hasegawa, J. T. The burden of critical limb ischemia: A review of recent literature. Vascular Health and Risk Management. 15, 187-208 (2019).
- Mills, J. L., et al. The society for vascular surgery lower extremity threatened limb classification system: Risk stratification based on Wound, Ischemia, and foot Infection (WIfI). Journal of Vascular Surgery. 59 (1), 220-234 (2014).
- Conte, M. S., et al. Global vascular guidelines on the management of chronic limb-threatening ischemia. Journal of Vascular Surgery. 69 (6), (2019).
- Yeager, R. A. Relationship of hemodialysis access to finger gangrene in patients with end-stage renal disease. Journal of Vascular Surgery. 36 (2), 245-249 (2002).
- Al Wahbi, A. Autoamputation of diabetic toe with dry gangrene: A myth or a fact. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 11, 255-264 (2018).
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P.
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
- Chalothorn, D., Clayton, J. A., Zhang, H., Pomp, D., Faber, J. E. Collateral density, remodeling, and VEGF-A expression differ widely between mouse strains. Physiological Genomics. 30 (2), 179-191 (2007).
- Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117 (9), 1207-1215 (2008).
- Parikh, P. P., et al. A Reliable Mouse Model of Hind limb Gangrene. Annals of Vascular Surgery. 48, 222-232 (2018).
- Kopincová, J., Púzserová, A., Bernátová, I. L-NAME in the cardiovascular system - nitric oxide synthase activator. Pharmacological Reports. 64 (3), 511-520 (2012).
- Soiza, R. L., Donaldson, A. I. C., Myint, P. K. Pathophysiology of chronic peripheral ischemia: new perspectives. Therapeutic Advances in Chronic Disease. 11, 1-15 (2020).
- McDermott, M. M., et al. Skeletal muscle pathology in peripheral artery disease a brief review. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (11), 2577-2585 (2020).
- Usui, M., et al. Pathogenic role of oxidative stress in vascular angiotensin-converting enzyme activation in long-term blockade of nitric oxide synthesis in rats. Hypertension. 34 (4), 546-551 (1999).
- Aref, Z., de Vries, M. R., Quax, P. H. A. Variations in surgical procedures for inducing hind limb ischemia in mice and the impact of these variations on neovascularization assessment. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 1-14 (2019).
- Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and DiO: Versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends in Neurosciences. 12 (9), 333-341 (1989).
- Boden, J., et al. Whole-mount imaging of the mouse hindlimb vasculature using the lipophilic carbocyanine dye DiI. BioTechniques. 53 (1), 3-6 (2012).
- Elfarnawany, M. H. Signal processing methods for quantitative power doppler microvascular angiography. Electronic Thesis and Dissertation Repository. , 3106 (2015).
- Matic, M., Matic, A., Djuran, V., Gajinov, Z., Prcic, S., Golusin, Z. Frequency of peripheral arterial disease in patients with chronic venous insufficiency. Iranian Red Crescent Medical Journal. 18 (1), 1-6 (2016).
- Ammermann, F., et al. Concomitant chronic venous insufficiency in patients with peripheral artery disease: Insights from MR angiography. European Radiology. 30 (7), 3908-3914 (2020).
- Yang, Y., et al. Cellular and molecular mechanism regulating blood flow recovery in acute versus gradual femoral artery occlusion are distinct in the mouse. Journal of Vascular Surgery. 48 (6), 1546-1558 (2008).
- Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments. (112), e54166 (2016).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-432 (2018).
- Greco, A., et al. Repeatability, reproducibility and standardisation of a laser doppler imaging technique for the evaluation of normal mouse hindlimb perfusion. Sensors. 13 (1), 500-515 (2013).
- Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: Functional role in the design and understanding of ischemia models. PLoS ONE. 8 (12), 84047 (2013).
- Hlushchuk, R., Haberthür, D., Djonov, V. Ex vivo microangioCT: Advances in microvascular imaging. Vascular Pharmacology. 112, 2-7 (2019).
- Robertson, R. T., et al. Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures. Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).
- Lee, J. J., et al. Systematic interrogation of angiogenesis in the ischemic mouse hind limb: Vulnerabilities and quality assurance. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40, 2454-2467 (2020).
