Este artigo descreve a modelagem isquemia-reperfusão (I/R) em um embrião de 3 dias usando um gancho personalizado de agulha espinhal para entender melhor o desenvolvimento e o tratamento da I/R. Este modelo é simples, rápido e barato.
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Artigo de método
Geração de Modelo de Isquemia-Reperfusão de Gancho usando um embrião de pintinho em desenvolvimento de três dias
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Distúrbios de isquemia e reperfusão (I/R), como infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral e doença vascular periférica, são algumas das principais causas de doença e morte. Muitos modelos in vitro e in vivo estão atualmente disponíveis para estudar o mecanismo de I/R em doenças ou tecidos danificados. No entanto, até o momento, nenhum modelo de I/R de ovo foi relatado, o que permitiria uma melhor compreensão dos mecanismos de I/R e uma triagem mais rápida de medicamentos. Este artigo descreve a modelagem de I/R usando um gancho personalizado de agulha espinhal em um embrião de 3 dias para entender os mecanismos de desenvolvimento e tratamento de I/R. Nosso modelo pode ser usado para investigar anomalias nos níveis de DNA, RNA e proteína. Este método é simples, rápido e barato. O modelo atual pode ser usado de forma independente ou em conjunto com os modelos in vitro e in vivo I/R existentes.
Introdução
A lesão tecidual isquemia-reperfusão tem sido associada a uma série de patologias, incluindo ataques cardíacos, acidente vascular cerebral isquêmico, trauma e doença vascular periférica1,2,3,4,5. Isso se deve principalmente à falta de uma compreensão abrangente da progressão da doença e à falta de um modelo de pesquisa eficaz. A lesão isquêmica ocorre quando o suprimento de sangue para uma área específica do tecido é cortado. Como resultado, o tecido isquêmico eventualmente necrosa, embora a taxa varie dependendo do tecido. Assim, restaurar o suprimento de sangue pode ajudar a mitigar os danos. No entanto, tem sido observado, em alguns casos, que a reperfusão causa mais danos teciduais do que a isquemia sozinha faz 6,7,8. Portanto, a compreensão dos mecanismos moleculares e celulares da isquemia-reperfusão é necessária para desenvolver uma intervenção terapêutica eficaz. Atualmente, não se sabe nenhum tratamento eficaz para lesões de I/R. Essa disparidade levou à criação de novos modelos experimentais, que vão desde modelos in vitro até in vivo, para resolver o problema existente9,10,11,12,13.
Os embriões de filhotes (Gallus gallus domesticus) são amplamente utilizados em pesquisas devido à sua facilidade de acesso, aceitabilidade ética, tamanho relativamente grande (em comparação com outros embriões), baixo custo e rápido crescimento14. Utilizamos um embrião de pintinho a 72 h de desenvolvimento para criar um em ovo I/R octurando e liberando a artéria vitelline direita com a ajuda de uma agulha espinhal. Nós o chamamos de modelo de isperfusão de isquemia de Gancho-I/R (Figura 1). O modelo utilizado neste estudo é capaz de simular com precisão todos os processos a jusante, incluindo vias oxidativas e inflamatórias, frequentemente associadas a danos de I/R15,16,17.
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Protocolo
O Comitê de Ética Animal Institucional da Era's Lucknow Medical College and Hospital emitiu uma renúncia por escrito afirmando que nenhuma aprovação formal foi necessária para realizar esses experimentos de acordo com o Comitê para fins de controle e supervisão de experimentos em animais (CPCSEA). No entanto, foram seguidos procedimentos operacionais padrão para minimizar qualquer potencial de sofrimento embrionário.
1. Preparação do buffer (Tabela 1)
- Preparar a solução de Ringer
- Para preparar a solução de Ringer, dissolva 0,72 g de NaCl (123 mM), 0,017 g de CaCl2 (1,53 mM), 0,037 g de KCl (4,96 mM) em 70 mL de H2O destilado estéril, com um volume final de 100 mL. Ajuste o pH para 7,4. Deixe-o dissolver completamente e autoclave. Em seguida, filtrar através de um filtro de 0,22 μm, aliquotar em quantidades de uso único (cerca de 10 mL) e armazenar à temperatura ambiente.
- Prepare solução salina normal (0,9% cloreto de sódio, NaCl).
- Em 70 mL de H2O destilado estéril, dissolva 0,9 g de NaCl (154 mM). Coma o volume até 100 mL. Autoclave por 15 min a 121 °C. Ajuste o pH para 7,4 com 0,1 N HCl ou 0,1 N NaOH, se necessário. Faça alíquotas de 10 mL em um tubo de centrífuga estéril de 15 mL e armazene à temperatura ambiente.
- Prepare 70% de etanol (v/v).
- Misture 70 mL de etanol puro (Mol. wt. 46,07 g/L) a 30 mL de H2O estéril. Prepare conforme necessário ou armazene em temperatura ambiente. Não há necessidade de esterilização.
- Prepare 1x Salina tampão fosfato (1x PBS).
- Prepare 100 mL de 1x PBS adicionando 0,144 g de Na2HPO4·7H2O (5,37 mM), 0,8 g de NaCl (136,8 mM), 0,2 g de KCl (26,8 mM), 0,2 g de KH2PO4 (14). 6 mM) a 70 mL de água destilada. Dissolva e coma o volume até 100 mL e autoclave por 15 min a 121 °C. Leve o pH para 7.4, adicionando um par de gotas de 0,1 N HCl ou 0,1 N NaOH, se necessário. Faça alíquotas de 10 mL em um tubo de centrífuga estéril de 15 mL e armazene à temperatura ambiente.
2. Dia 1
- Disponha todas as ferramentas necessárias para a esterilização de ovos (70% de etanol, lenços de limpeza, um rack de ovos e um marcador OHP).
- Limpe os ovos de 0 dia com 70% de etanol usando lenços de papel de tecido. Use apenas um ovo de 0 dias, pois ovos mais velhos podem não dar origem a um embrião.
- Escreva a data atual em ovos com um marcador OHP.
- Coloque os ovos em uma incubadora de ovos a uma temperatura de 36-37 °C e um nível de umidade de 60%-65%. Incubar os ovos para as próximas 24 horas.
3. Dia 2
- Providencie os equipamentos necessários para a retirada de 5-6 mL de albumina (tesoura de borda afiada, seringa de 5 mL, agulha de 18 G, descartador de seringa e fita adesiva).
- Limpe a tesoura cirúrgica com 70% de etanol ou esterilize usando uma autoclave depois de limpá-las com 70% de etanol.
- Agora leve o ovo da incubadora de ovos de 37 °C para camadas.
- Coloque o ovo em uma prateleira de ovos limpa.
- Conecte um pequeno pedaço de fita adesiva (tamanho: cerca de 1 polegada de comprimento x largura) à borda do ovo.
- Faça um pequeno furo na borda da casca de ovo usando uma tesoura de borda afiada. Insira uma seringa de 5 mL em um ângulo aproximado de 75°.
NOTA: A seringa de 5 mL vem com uma agulha de 24 G x 1 (estéril), mas é bom substituir a agulha de 24 G x 1 por uma agulha de 18 G x 1,5 (estéril). A agulha de 18 G x 1,5 tem 1,25 x 38 mm de largura. Portanto, facilitará a remoção do albumina. - Depois de inserir a agulha no saco de gema, retire lentamente 5-6 mL de albumina.
NOTA: Isso fornece ao embrião uma cama na qual ele pode crescer. Retirar o albumina evita o excesso de albumina enquanto estabelece uma janela. Finalmente, o risco do embrião ser danificado durante a janela é mitigado eliminando 5-6 mL de albumina. - Depois de remover a albumina, resseque a abertura com fita adesiva e deixe os ovos incubados a 37 °C por 48 h.
4. Dia 4
- Prepare a solução do Ringer, salina 0,9% normal e 1x PBS conforme descrito na seção 1 do protocolo. Então, autoclave as três soluções. Após o autoclavamento, coloque a respectiva solução em temperatura ambiente.
- Retire o ovo da incubadora de ovos de 37 °C e corte a casca em uma forma circular. Antes de cortar a casca de ovo, cubra a área a ser cortada com fita adesiva.
NOTA: Cobrir a área da janela com fita adesiva impede a quebra da casca de ovo em lugares indesejados. No entanto, se você invadir um lugar indesejado, sele a área com a fita adesiva. Cobrir os lugares a serem cortados com fita adesiva evita que pedaços de concha caiam sobre o saco de gema. - Crie um pequeno buraco na casca de ovo com uma tesoura de borda afiada no local onde a janela é desejada e comece a cortar uma abertura circular. Esse processo é conhecido como janela.
NOTA: Certifique-se de que o corte circular é grande o suficiente para permitir fácil acesso ao embrião de qualquer direção. Se necessário, altere a posição do ovo para acomodar a posição do embrião. - Em seguida, usando um microscópio cirúrgico de zoom estéreo, localize a artéria vitelline direita (RVA).
NOTA: Os embriões de frango normalmente sofrem torção torácica (juntamente com flexure cervical, etc.) à medida que se desenvolvem, de tal forma que o lado esquerdo da cabeça esteja contra a gema na fase de 72h. Mais caudally, onde as artérias vitelline saem do corpo, o embrião não é muito torcido, e esta parte do corpo fica ventral lado para baixo em direção à gema. Então, vendo diretamente, o direito do embrião é à direita do pesquisador. - Uma vez que o RVA esteja localizado, crie dois pequenos orifícios nos lados esquerdo e direito do RVA usando uma agulha de 26 G (Figura 2).
- Coloque a sonda de imagem de fluxo sanguíneo Doppler acima da RVA. Certifique-se de que a sonda de imagem de fluxo sanguíneo Doppler seja colocada a 5 ± 1 mm do local da isquemia e em direção à extremidade distal da RVA. Faça uma leitura de fluxo por 2 minutos e 30 s (ou mais se desejar). Esta será a leitura de fase normoxic.
- Enquanto isso, usando um plier de nariz e fórceps dentados, molde manualmente a borda da agulha espinhal na forma de um gancho (Figura 3). Faça isso dobrando a borda da agulha espinhal por aproximadamente 1 mm. Um tamanho maior tornará mais difícil inserir e remover a agulha espinhal durante o procedimento de I/R.
- Insira a agulha espinhal diretamente abaixo da artéria vitelline direita usando um micromanipulador.
NOTA: Insira a agulha espinhal com extrema cautela para evitar danificar o RVA ou quaisquer artérias adjacentes. A técnica ideal é ajustar o gancho personalizado da agulha espinhal exatamente acima do lado direito do orifício RVA, seguido de inserir gradualmente a borda personalizada da agulha espinhal no saco de gema com a ajuda de um micromanipulador sob a orientação de um microscópio cirúrgico de zoom estéreo através do orifício direito. Uma vez que o gancho da agulha espinhal esteja no saco da gema, ajuste gradualmente o gancho sob o RVA de modo que sua borda seja exatamente colocada sob o orifício esquerdo. Agora é a hora de levantar a agulha espinhal. - Agora, com a ajuda do micromanipulador, eleva gradualmente a artéria até que o fluxo sanguíneo Doppler indique uma diminuição mínima de 80% no fluxo arterial.
- Uma vez que uma queda de 80% ou mais no fluxo Doppler seja alcançada, deixe a agulha espinhal levantada (puxando a artéria para cima) por 5 minutos. Este será o período de isquemia na RVA.
NOTA: É fundamental monitorar o fluxo Doppler durante a duração da isquemia. Se for encontrada uma quantidade significativa de flutuação, encerre os testes. - Após o período de isquemia de 5 minutos, libera gradualmente a artéria para restaurar os níveis normais de fluxo sanguíneo. Certifique-se de que uma leitura do medidor de fluxo sanguíneo Doppler exiba valores comparáveis aos obtidos durante a normoxia. Este será o período de reperfusão na RVA (Figura 4).
- Após o procedimento de I/R, aplique algumas gotas (2-3) de 1x PBS no embrião e observe-o por 2-3 min.
NOTA: O uso de 1x PBS ajuda a evitar que o embrião seque. - Por fim, reseealar a janela com fita adesiva e coloque o ovo de volta na incubadora de ovos por 5h e 55 min.
- Depois de 5h e 55 min, retire o ovo da incubadora de ovos, coloque-o no rack de ovos, reabra a janela e siga o protocolo de tratamento a jusante.
5. Tratamentos
- Para o tratamento das artérias com drogas, ativadores ou inibidores, extir essa pena a RVA após 1h do processo de I/R.
- Para os estudos a jusante, primeiro remova o embrião da casca de ovo colocando-o em uma placa de Petri estéril de 90 mm.
- Uma vez que o embrião é liberado na placa de Petri, extireta o RVA usando a íris ocular sob a orientação de um microscópio cirúrgico de zoom estéreo.
- Certifique-se de que a dimensão de excisão de RVA é de até 15 ± 1 mm (distal do tronco), 5 ± 1 mm cada no lado esquerdo e direito da artéria e 2 ± 1 mm em direção ao tronco.
NOTA: Uma régua pode ser utilizada para medir a área a ser extirpada (opcional). - Depois de excisar o RVA, lave-o com 1x PBS em uma placa de Petri estéril contendo 1x PBS.
- Para os tratamentos desejados, coloque a artéria em um tubo de centrífuga de 1,5 mL (esterilizado) preenchido com 500 μL da solução de Ringer. Coloque o RVA no tubo de centrífuga e coloque-o em uma incubadora de 37 °C por 5h e 55 min.
NOTA: Dependendo dos tratamentos, use a solução do Ringer sem qualquer tratamento, ou tratamento com o volume e concentração desejados de droga, ativador ou inibidor. - Após 5h e 55 min de incubação, retire a RVA da incubadora laboratorial de 37 °C e prossiga com os tratamentos desejados.
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Resultados
A técnica do Doppler Blood Flow Imaging foi utilizada para avaliar a eficácia do nosso modelo. Em suma, comparamos os dados do grupo controle com os dados do grupo RVA para determinar o sucesso de nossa criação. A Figura 4A retrata um fluxo típico associado ao animal de controle, enquanto a Figura 4B retrata os resultados obtidos de um RVA. O 1-8 numérico representa os diversos eventos associados às fases de I/R. Resumindo, o 1-3 numérico corresponde à fase da n...
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Discussão
O objetivo da pesquisa isquemia-reperfusão é criar estratégias terapêuticas que previnem a morte celular e promovam a recuperação 29,30. Para superar as restrições atuais na pesquisa de I/R, projetamos um modelo de embrião de pintinhos Hook I/R para produzir um modelo de I/R confiável e reprodutível. Para nosso conhecimento, o nosso é o primeiro modelo de I/R já criado em um embrião de 3 dias para experimentos de I/R de rotina, além de estudar sinais de estresse ...
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Divulgações
Os autores não declaram interesses concorrentes.
Agradecimentos
Queremos expressar nossa gratidão a Hari Shankar por suas contribuições críticas durante a videografia e edição, Sr. Baqer Hussain por dublagem, Sr. Asghar Rizvi para edição de vídeo, Sr. Mohammad Haider para filmagens, Sr. Mohammad Dinamarquês Siddiqui para assistência durante os experimentos.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| (-80° C) freezer | Haier, | ||
| Tubo de centrífuga | TARSONS, Índia | 500010X | |
| 100mm Placa de Petri (estéril) | Tarsons, Índia | 460050 | |
| Agulha 18G (18G&vezes; 1.5 (1.25&vezes; 38mm) | Ramsons, Índia | 13990 | |
| Seringa de 1mL | DISPO | ||
| Agulha (26G&vezes; 1/2 (10.45x13mm) | DISPO VAN, Índia | 30722D | |
| 37° Incubadora de ovos C com umidade percentual ajustável | Gentek, Índia | GL-100 | |
| 37° Incubadora de laboratório | C SCIENCE TECH, Índia | CB 101-14 | |
| 3-metiladenina (3-MA) | Sigma Aldrich, EUA | M9281 | |
| Pipeta de pastagem de 3mL | TARSONS, Índia | 940050 | |
| Copo de 50mL | TARSONS, Índia-Seringa | ||
| 5mL | DISPO VAN, Índia | IP53 | |
| 70% etanol | Merck Millipore, Estados Unidos | 64-17-5 | |
| Fita adesiva / fita de violoncelo | Sunrise, | Índia-Ambra1 | |
| primers | Applied Biosystems, Foster City, EUA | Hs00387943_m1 | |
| Tecnologia de sinalização de células | IgG anti-mouse | 7076S | |
| Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories, EUA | 711-035-152 | |
| Atg7 | R & D Systems, EUA | MAB6608 | |
| Primers Atg7 | Applied Biosystems, Foster city, EUA | Hs00893766_m1 | |
| Saco de autoclave | Tarsons, Índia | Máquina de | |
| fabricada localmente, Lucknow, | Índia-Beclin-1 | ||
| Proteintech, EUA | 66665-1-Ig | ||
| Beta Actin | ImmunoTag, EUA | ITT07018 | |
| Albumina de soro bovino | Himedia, Mumbai, Índia | TC194 | |
| Cloreto de cálcio | Himedia, Mumbai, Índia | GRM534 | |
| Catalase | ImmunoTag, EUA | ITT5155 | |
| Toalhetes de limpeza | Kimberly-Clark, Índia | 370080 | |
| Caspase3 clivada | ImmunoTag, EUA | ITT07022 | |
| dissódico hidrogenofosfato heptahidratado | Himedia, Mumbai, Índia | GRM39611 | |
| Doppler medidor de fluxo sanguíneo | Moors instrument, Reino Unido | moorVMS-LDF1 | |
| Rack | de ovos - | Rack | |
| de | ovos | - | |
| GAPDH | ImmunoTag, EUA | M1000110 | |
| Primers GAPDH | Applied Biosystems, Foster city, EUA | ||
| Glycine | Himedia, Mumbai, Índia | MB013 | |
| Bandeja renal | HOSPITO-LC3A | ||
| /B | Cell Signaling Technology, EUA | 4108S | |
| Metanol | Rankem laboratories, Mumbai, Índia | M0252 | |
| Micromanipulador | Narishige, Japão | M-152 | |
| N-acetil-L-cisteína (NAC) | Sigma Aldrich, EUA | A7250 | |
| Naringenin | Sigma Aldrich, EUA | 67604-48-2 | |
| NF-kβ | Thermo Fisher Scientific, EUA | 51-0500 | |
| NLRP3 | ImmunoTag, EUA | ITT07438 | |
| Alicate de nariz | Feito localmente, Lucknow, | Índia-Pinça | |
| ocular | Stoelting, Alemanha | 52106-40 | |
| Íris ocular | Instrumentos cirúrgicos Tufft, Jaipur, Índia | Tesoura Micro Vannas Hard Age Angulada 8CM / 3 1/8" | |
| OHP caneta marcadora | Camlin, | ||
| ImmunoTag, EUA | ITT08329 | ||
| Tesoura de borda afiada pontiaguda | Stoelting, Alemanha | 52132-11 | |
| Cloreto de potássio | Himedia, Mumbai, Índia | MB043 | |
| Fosfato de potássio monobásico anidro | Himedia, Mumbai, Índia | MB050 | |
| Inibidor de protease | Abcam, Estados Unidos | Ab65621 | |
| SOD-1 | ImmunoTag, EUA | ITT4364 | |
| Cloreto de Sódio | Fisher Scientific, Mumbai, Índia | 27605 | |
| Dodecil sulfato de sódio | Himedia, Mumbai, Índia | GRM886 | |
| Agulha espinhal 25GA; 3,50 POL (90,51 X 90 mm) | Ramson, Índia | GS-2029 | |
| Olympus, Japão | SZ2-STU3 | ||
| Descartador de seringa | BIOHAZARD | 882210 | |
| Pinça dentada | Stoelting, Alemanha | 52102-30 | |
| Tris Base | G Biosciences, Estados Unidos | RC1217 | |
| Tris Hydrochloric Acid | Himedia, Mumbai, Índia | MB030 | |
| Tween 20 | G Biosciences, Estados Unidos | RC1227 | |
| Ovos de 0 dias de frango White Leghorn | - | ||
| Z-Val-Ala-Asp (OMe) -FMK | MP Biomedicals, LLC, EUA | FK009 |
Referências
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Reimpressões e permissões
