Inibidores típicos de microtúbulos, amplamente utilizados em pesquisas básicas e aplicadas, têm efeitos de longo alcance nas células. Recentemente, as fotostatinas surgiram como uma classe de inibidores de microtúbulos fotossentaráveis, capazes de manipulação instantânea, reversível e espacialmente precisa de microtúbulos. Este protocolo passo a passo detalha a aplicação de fotostatinas em um embrião de rato de pré-implantação 3D vivo.
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Artigo de método
Manipulação subcelular espiostemporal do Citoesqueleto microtubulo no embrião do rato de pré-implantação vivo usando Fotostatinas
Neste artigo
Resumo
Resumo
O citoesqueleto microtúbulo forma a estrutura de uma célula e é fundamental para o transporte intracelular, divisão celular e transdução de sinais. A ruptura farmacológica tradicional da onipresente rede de microtúbulos usando, por exemplo, nocodazol pode ter consequências devastadoras para qualquer célula. Inibidores de microtúbulos reversivelmente fotossceráveis têm o potencial de superar as limitações, permitindo que os efeitos medicamentosos sejam implementados de forma espacialmente controlada. Uma dessas famílias de drogas é a fotostatina baseada em azobenzeno (PSTs). Esses compostos são inativos em condições escuras, e após a iluminação com luz UV, eles se ligam ao local de ligação colchicina de β-tubulina e bloqueiam a polimerização de microtúbulos e a rotatividade dinâmica. Aqui, a aplicação de PSTs no embrião de rato de pré-implantação ao vivo 3D (3D) é definida para interromper a rede de microtúbulos em um nível subcelular. Este protocolo fornece instruções para a configuração experimental, bem como parâmetros de ativação e desativação de luz para PSTs usando microscopia confocal de células vivas. Isso garante a reprodutibilidade e permite que outras pessoas apliquem esse procedimento às suas questões de pesquisa. Fotossensíveis inovadores como os PSTs podem evoluir como ferramentas poderosas para avançar na compreensão da rede dinâmica de microtúbulos intracelulares e manipular não invasivamente o citoesqueleto em tempo real. Além disso, os PSTs podem ser úteis em outras estruturas 3D, como organoides, blastóides ou embriões de outras espécies.
Introdução
A arquitetura de microtúbulos varia amplamente entre diferentes tipos de células para suportar diversas funções 1,2. Sua natureza dinâmica de crescimento e encolhimento permite uma rápida adaptação a pistas extra e intracelulares e responder às necessidades em constante mudança de uma célula. Assim, pode ser considerada como a "impressão digital morfológica" desempenhando um papel fundamental na identidade celular.
O direcionamento farmacológico do citoesqueleto microtúbulo usando inibidores de pequenas moléculas levou a uma infinidade de descobertas fundamentais na biologia do dese....
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Protocolo
Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal de Monash sob o número de ética animal 19143. Os animais foram alojados em condições específicas de casária animal sem patógenos na instalação animal (Monash Animal Research Platform) em estrita conformidade com as diretrizes éticas.
1. Coleção de embriões de camundongos pré-implantação
- Camundongos superovulados e acasalados, conforme descrito anteriormente16,18, em conformidade com as diretrizes institucionais de ética animal.
NOTA: As cepas mais utilizadas para a coleta de embriões vivos são ....
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Resultados
De acordo com o protocolo, os embriões de camundongos pré-implantação foram microinjetados com cRNA para EB3, marcado com dTomato fluorescente vermelho (EB3-dTomato). Isso permite a visualização de microtúbulos em crescimento à medida que o EB3 se liga ao microtúbulo polimerizador mais termina24.
Os experimentos foram realizados 3 dias após a fertilização (E3) quando o embrião do camundongo é composto por 16 células. Qualquer outro estágio de desenvolvimento de pré-impl.......
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Discussão
A rede de microtúbulos é parte integrante do funcionamento interno fundamental de uma célula. Consequentemente, isso apresenta desafios na manipulação da dinâmica dos microtúbulos em organismos vivos, pois qualquer perturbação à rede tende a ter consequências generalizadas para todos os aspectos da função celular. O surgimento de compostos de microtúbulos fototravavel apresenta uma maneira de manipular precisamente o citoesqueleto em um nível subcelular, com controle superior para a indução e reversão da inibição do cres.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesse concorrente ou financeiro.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Oliver Thorn-Seshold e Li Gao por nos fornecerem fotostatinas e conselhos sobre preparação de manuscritos, Monash Production para suporte de filmagem e Monash Micro Imaging para suporte a microscopia.
Este trabalho foi apoiado pelo projeto do National Health and Medical Research Council (NHMRC) para a J.Z. e o Instituto Canadense de Pesquisa Avançada (CIFAR) Azrieli Scholarship para J.Z. O Instituto Australiano de Medicina Regenerativa é apoiado por subsídios do Governo do Estado de Victoria e do Governo Australiano.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubo de aspiração | Sigma-Aldrich | A5177 | Para aparelho de aspiração bucal |
| Lâminas de câmara - LabTek | Thermo Fisher Scientific | NUN155411 | |
| codificação de cRNA para EB3-dTomato | N/A | N/A | Preparado de acordo com as instruções do fabricante usando mMessage in vitro Kit de transcrição Placas de |
| cultura - 35mm | Thermo Fisher Scientific | 150560 | |
| Hormônio de crescimento coriônico humano | Sigma-Aldrich | C8554 | |
| Fluido tubário humano (HTF) médio | Cosmo-Bio | CSR-R-B071 | |
| Imaris Software de análise de imagem | Óleo de imersão de plano de bits | ||
| W 2010 | Carl Zeiss | 444969-0000-000 | Para uso com objetiva de imersão de microscópio |
| Tocha LED - Luz vermelha | Celestron | 93588 | |
| M2 médio | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Camundongos - FVB / N do tipo selvagem, machos e fêmeas | N / A | N / A | Fêmeas de 8 a 9 semanas de idade. Machos de 2 a 6 meses de idade. |
| Pipetas microcapilares - Kimble | Sigma-Aldrich | Z543306 | Para aparelho de aspiração bucal |
| Tampão de microinjeção | N/A | N/A | 5 mM Tris, 5 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, pH 7,4 |
| Óleo mineral | Origio | ART-4008-5P | |
| mMessage In vitro Kit de transcrição | Thermo Fisher Scientific | AM1340 | |
| NanoDrop Espectrofotômetro | Thermo Fisher Scientific | ||
| Potassium Simplex Optimized Medium (KSOM) | medium Cosmo-Bio | CSR-R-B074 | |
| Gonadotrofina sérica de égua grávida | Prospec Bio | HOR-272 | |
| PST-1P | N/A | N/A | Borowiak, M. et al., Inibidores fotocomutáveis da dinâmica dos microtúbulos controlam opticamente a mitose e a morte celular. Cell. 162 (2), 403-411, doi:10.1016/j.cell.2015.06.049, (2015). |
| Kit de purificação de RNA | Sangon | B511361-0100 | |
| Água ultrapura | Sigma-Aldrich | W1503 | |
| ZEN Black Software | Carl Zeiss |
Referências
- Hawdon, A., Aberkane, A., Zenker, J. Microtubule-dependent subcellular organisation of pluripotent cells. Development. 148 (20), (2021).
- Sanchez, A. D., Feldman, J. L. Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites. ....
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Reimpressões e permissões
