Artigo de método

Diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas em precursores de células beta pancreáticas em um sistema de cultura 2D

DOI:

10.3791/63298

⸱

16 de dezembro de 2021

 , 
1College of Health and Life Sciences, Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation, 2Diabetes Research Center, Qatar Biomedical Research Institute (QBRI), Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation (QF)

Neste artigo

Resumo

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O presente protocolo descreve um método aprimorado para aumentar a co-expressão dos fatores de transcrição PDX1 e NKX6.1 em progenitores pancreáticos derivados de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) em monocamadas planares. Isto é conseguido reabastecendo a matriz fresca, manipulando a densidade celular e dissociando as células endodérmicas.

Resumo

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As células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) são uma excelente ferramenta para estudar o desenvolvimento pancreático precoce e investigar os contribuintes genéticos para o diabetes. As células secretoras de insulina derivadas de hPSC podem ser geradas para terapia celular e modelagem de doenças, no entanto, com eficiência e propriedades funcionais limitadas. Os progenitores pancreáticos derivados de hPSC que são precursores de células beta e outras células endócrinas, quando co-expressam os dois fatores de transcrição PDX1 e NKX6.1, especificam os progenitores para células beta funcionais e secretoras de insulina, tanto in vitro quanto in vivo. Progenitores pancreáticos derivados de hPSC são atualmente usados para terapia celular em pacientes com diabetes tipo 1 como parte de ensaios clínicos. No entanto, os procedimentos atuais não geram uma alta proporção de NKX6.1 e progenitores pancreáticos, levando à cogeração de células endócrinas não funcionais e poucas células secretoras de insulina responsivas à glicose. Este trabalho desenvolveu, assim, um protocolo aprimorado para a geração de progenitores pancreáticos derivados de hPSC que maximizam a co-expressão de PDX1 e NKX6.1 em uma monocamada 2D. Fatores como densidade celular, disponibilidade de matriz fresca e dissociação de células endodérmicas derivadas de hPSC são modulados que aumentaram os níveis de PDX1 e NKX6.1 nos progenitores pancreáticos gerados e minimizaram o comprometimento com a linhagem hepática alternada. O estudo destaca que a manipulação do ambiente físico da célula durante a diferenciação in vitro pode afetar a especificação da linhagem e a expressão gênica. Portanto, o protocolo otimizado atual facilita a geração escalável de progenitores co-expressores PDX1 e NKX6.1 para terapia celular e modelagem de doenças.

Introdução

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O diabetes é um distúrbio metabólico complexo que afeta milhões de pessoas em todo o mundo. A suplementação de insulina é considerada a única opção de tratamento para diabetes. Casos mais avançados são tratados com terapia de reposição de células beta, obtida por meio de transplante de pâncreas cadavérico inteiro ou ilhotas 1,2. Diversas questões envolvem a terapia de transplante, como a limitação com a disponibilidade e qualidade do tecido, a invasividade dos procedimentos de transplante, além da necessidade contínua de imunossupressores. Isso requer a necessidade de descobrir opções novas e alternativas para a terapia de reposição de células beta 2,3. As células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) emergiram recentemente como uma ferramenta promissora para a compreensão da biologia do pâncreas humano e como uma fonte não exaustiva e potencialmente mais personalizada para a terapia de transplante 4,5,6,7. As hPSCs, incluindo as células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e as células estaminais pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSCs), têm uma elevada capacidade de auto-renovação e dão origem a qualquer tipo de tecido do corpo humano. As hESCs são derivadas da massa celular interna do embrião e as hiPSCs são reprogramadas a partir de qualquer célula somática 4,8.

Os protocolos de diferenciação dirigida são otimizados para gerar células beta pancreáticas a partir de hPSCs que direcionam sequencialmente as hPSCs através dos estágios de desenvolvimento pancreático invitro. Esses protocolos geram organoides de ilhotas derivados de hPSC. Embora tenham melhorado muito no aumento da proporção de células beta pancreáticas, a eficiência dos protocolos é altamente variável. Não aumenta para mais de ~40% das células NKX6.1+/INSULIN+ ou C-PEPTIDE+ 5,9,10,11,12,13. No entanto, as células beta geradas não são inteiramente idênticas às células beta humanas adultas em termos de seus perfis transcricionais e metabólicos e sua resposta à glicose 4,5,14. As células beta derivadas de hPSC não têm expressão gênica de marcadores de células beta chave, como PCSK2, PAX6, UCN3, MAFA, G6PC2 e KCNK3 em comparação com ilhotas humanas adultas5. Além disso, as células beta derivadas de hPSC diminuíram a sinalização de cálcio em resposta à glicose. Eles estão contaminados com as células poli-hormonais cogeradas que não secretam quantidades adequadas de insulina em resposta ao aumento dos níveis de glicose5. Por outro lado, os progenitores pancreáticos derivados de hPSC, que são precursores de ilhotas, poderiam ser gerados de forma mais eficiente in vitro em comparação com as células beta e, quando transplantados in vivo, poderiam amadurecer em células beta funcionais e secretoras de insulina15,16. Os ensaios clínicos estão atualmente focados em demonstrar sua segurança e eficácia após o transplante em indivíduos com DM1.

Notavelmente, a expressão dos fatores de transcrição PDX1 (Pancreatic and Duodenal Homeobox 1) e NKX6.1 (NKX6 Homeobox 1) dentro da mesma célula progenitora pancreática é crucial para o comprometimento com uma linhagem de células beta5. Progenitores pancreáticos que não expressam NKX6.1 dão origem a células endócrinas poli-hormonais ou células beta não funcionais17,18. Portanto, uma alta co-expressão de PDX1 e NKX6.1 no estágio progenitor pancreático é essencial para gerar um grande número de células beta funcionais. Estudos têm demonstrado que um corpo embrionário ou cultura 3D aumenta PDX1 e NKX6.1 em progenitores pancreáticos onde as células diferenciadoras são agregadas, variando entre 40%-80% da população PDX1+/NKX6.1+12,19. No entanto, em comparação com as culturas de suspensão, as culturas de diferenciação 2D são mais econômicas, viáveis e convenientes para aplicação em múltiplas linhagens celulares5. Recentemente, mostramos que as culturas de diferenciação de monocamadas produzem mais de até 90% de progenitores pancreáticos derivados de hPSC coexpressivos PDX1+/NKX6.1+20,21,22. O método relatado conferiu alta capacidade de replicação aos progenitores pancreáticos gerados e evitou especificações de destino alternativo, como a linhagem hepática21. Portanto, neste documento, este protocolo demonstra um método altamente eficiente para a diferenciação de hPSCs para precursores de células beta pancreáticas co-expressando PDX1 e NKX6.1. Este método utiliza a técnica de dissociação da endoderme derivada da hPSC e manipulação da densidade celular, seguida de uma sinalização estendida de FGF e Retinóide, bem como inibição de Hedgehog para promover a co-expressão de PDX1 e NKX6.1 (Figura 1). Este método pode facilitar uma geração escalável de precursores de células beta pancreáticas derivados de hPSC para terapia de transplante e modelagem de doenças.

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Protocolo

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O estudo foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa institucional apropriado e realizado de acordo com os padrões éticos estabelecidos na Declaração de Helsinque de 1964 e suas alterações posteriores ou padrões éticos comparáveis. O protocolo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional (IRB) do HMC (nº 16260/16) e pelo Qatar Biomedical Research Institute (QBRI) (nº 2016-003). Este trabalho é otimizado para hESCs como H1, H9 e HUES8. Amostras de sangue foram obtidas de indivíduos saudáveis do hospital Hamad Medical Corporation (HMC) com consentimento informado completo. As iPSCs são geradas a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de controle, indivíduo saudável23.

1. Preparação dos meios de cultura

  1. Preparar meios de cultura de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC)
    1. Preparar meios de cultura hPSC a partir do meio comercialmente disponível para manter e expandir células-tronco embrionárias humanas suplementando 100 unidades/mL de penicilina e 100 ug/mL de estreptomicina (ver Tabela de Materiais). Aliquotar e conservar o meio completo a -20 °C a longo prazo ou a 4 °C para utilização imediata.
  2. Preparar meios de diferenciação de Estágio 1 (para Endoderme Definitivo (DE)).
    1. Preparar meios basais a partir de meios MCDB 131 suplementando com 0,5% de albumina sérica bovina isenta de ácidos gordos (FFA-BSA), 1,5 g/L de bicarbonato de sódio (NaHCO3), 10 mM de glicose, 2 mM de glutamax, 100 unidades/ml de penicilina e 100 μg/ml de estreptomicina (ver Tabela de Materiais). Filtrar o meio preparado utilizando um filtro de 0,2 μm e conservar a 4 °C.
    2. Preparar o meio de Estágio 1 contendo CHIR99021 do meio basal (preparado na etapa 1.2.1) aquecendo o meio basal a 37 °C e, em seguida, suplementando com 2 μM de CHIR99021, 100 ng/mL de Activin A, 10 μM de inibidor de rocha (Y-27632) e 0,25 mM de vitamina C (ver Tabela de Materiais). Misture bem o meio suplementado e cubra-o com papel alumínio para protegê-lo da luz.
      NOTA: Esta mídia será usada somente no primeiro dia de diferenciação.
    3. Prepare o meio de Estágio 1 sem CHIR99021 do meio Basal, aquecendo-o a 37 °C e suplementando-o com 100 ng/mL de Activin A e 0,25 mM de vitamina C e misture bem.
      NOTA: 5 ng/mL de FGF básico ou FGF2 podem ser opcionalmente adicionados a este meio. Esta mídia será usada para os dias restantes da Fase 1.
  3. Preparar meios de diferenciação de Estágio 2 (para Tubo Intestinal Primitivo; PGT).
    1. Preparar o meio de diferenciação do Estágio 2 contendo inibidor de rocha do meio basal, aquecendo-o a 37 °C e suplementando com 50 ng/mL de FGF10, 50 ng/mL de NOGGIN, 0,25 μM de CHIR99021, 10 μM de Y-27632 (inibidor de rocha) e 0,25 mM de vitamina C.
      NOTA: Este meio é usado no dia da dissociação das células endodérmicas.
    2. Preparar o meio de diferenciação da fase 2 sem inibidor de rocha seguindo o mesmo procedimento para o meio preparado no passo 1.3.1, excluindo o inibidor de rocha.
      Observação : essa mídia é usada no segundo dia do estágio 2.
  4. Prepare o meio de diferenciação do Estágio 3 (para o Intestino Anterior Posterior).
    1. Preparar meios DMEM contendo 4,5 g/L de glicose, em seguida, suplementar com 1% de penicilina-estreptomicina e 2 mM de glutamax e usar como meio basal para os estágios 3 e 4.
    2. Aqueça o meio DMEM (preparado na etapa 1.4.1) e suplemente com 2 μM de ácido retinóico, 0,25 μM de SANT-1, 50 ng/mL de FGF10, 50 ng/mL de NOGGIN, 0,25 mM de vitamina C e suplemento de B27 a 1% sem vitamina A (ver Tabela de Materiais).
      NOTA: Esta mídia é usada para 4 dias do Estágio 3 para P2-D (Protocolo 2, otimizado, dissociado) e 2 dias do Estágio 3 para P1-ND (Protocolo 1, não otimizado, não dissociado).
  5. Prepare o meio de diferenciação do Estágio 4 (para Progenitores Pancreáticos).
    1. Adicione DMEM contendo 4,5 g/L de glicose com 100 ng/mL de EGF, 10 mM de nicotinamida, 50 ng/mL de NOGGIN, 0,25 mM de vitamina C e 1% de suplemento de B27 sem vitamina A (ver Tabela de Materiais). Use essa mídia para todos os dias do Estágio 4.
      NOTA: Mantenha todos os reagentes a temperaturas apropriadas e todos os reagentes sensíveis e citocinas precisam ser alíquotados. Descongelar os reagentes alicitados e adicionar ao meio basal no momento da mudança do meio de diferenciação. As composições dos diferentes meios de diferenciação são apresentadas na Tabela 1.

2. Preparação de pratos revestidos de matriz de membrana basal

  1. Descongelar a matriz de cave comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) e a alíquota no gelo; congelar as alíquotas a -20 °C.
  2. Antes de revestir as placas de cultura de tecidos, descongele as alíquotas congeladas no gelo. Adicionar o volume adequado da solução da matriz de membrana ao meio KO-DMEM/F-12 refrigerado (KnockOut DMEM/F-12) (ver Tabela de Materiais) para atingir a concentração diluída desejada e misturar bem. Conservar a solução de matriz diluída a 4 °C para utilização imediata.
  3. Cobrir a superfície das placas tratadas com cultura de tecidos (ver Tabela de Materiais) com solução de matriz de membrana diluída e colocar as placas a 37 °C durante, pelo menos, 60 minutos antes de chapear as células. Utilizar uma diluição de 1:50 da solução de matriz de membrana em KO-DMEM/F-12 para células de revestimento para experimento de diferenciação pancreática e 1:80 para expansão de hPSCs indiferenciadas.

3. Cultura de hPSCs indiferenciadas

  1. Passar as hPSCs quando as colônias atingirem uma confluência de 70% a 80%.
  2. Para a passagem, lave as hPSCs uma vez com PBS quente, aspirar usando um aspirador de vácuo portátil dentro do exaustor de cultura de tecidos e adicione 0,5 mM de solução de EDTA em PBS para cobrir a superfície da colônia. Incubar a 37 °C, 5% de CO2 durante 1 min ou até que as bordas das colónias se desprendam da superfície da placa.
  3. Remover a solução de EDTA e recolher as colónias de descolamento com meio de cultura hPSC utilizando uma micropipeta P1000. Centrifugar as células recolhidas a 128 x g durante 4 min à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e suplemente as células com meios de cultura de hPSC contendo 10 μM de Y-27632 (inibidor de rocha)23,24.
    NOTA: Passar as hPSCs em pelo menos uma proporção de 1:3 em placas revestidas de matriz de membrana de 1:80. No entanto, para experimentos de diferenciação, pratique as hPSCs em pratos revestidos de 1:50.

4. Indução da diferenciação definitiva do endoderme (DE) em hPSCs (Estágio 1)

  1. Quando as colônias de hPSC atingirem uma confluência de 70%-80%, lave-as duas vezes com PBS quente e aspirar usando um aspirador de vácuo portátil dentro do exaustor de cultura de tecidos para iniciar a diferenciação do Estágio 1.
  2. Adicionar meio de diferenciação de Estágio 1 contendo CHIR99021 (da etapa 1.2.2) às colônias, 2 mL por placa de 6 poços, e incubar a 37 °C por 24 h.
  3. No dia seguinte, substitua a mídia gasta pelo meio de diferenciação do Estágio 1 sem CHIR99021 (etapa 1.2.3).
  4. A cada 24 h, aspirar o meio gasto usando um aspirador de vácuo portátil dentro do exaustor de cultura de tecidos e substituí-lo por um meio de diferenciação Estágio 1 fresco sem CHIR99021.
    NOTA: A fase 1 pode ser prolongada até 4 dias. O comprimento do Estágio 1 depende da linha hPSC que está sendo usada e deve ser otimizado de acordo.

5. Análise de imunofluorescência do DE derivado de hPSC (Estágio 1)

  1. Para imunofluorescência, aspirar o meio gasto usando um aspirador de vácuo portátil dentro do exaustor de cultura de tecidos dos poços e lavar duas vezes com PBS quente. Gire a placa para se livrar de quaisquer detritos celulares.
  2. Cobrir a superfície dos poços com 4% de paraformaldeído (PFA) para fixar as células DE; por exemplo, adicione 250 uL de PFA por poço de uma placa de 24 poços. Coloque a placa em um agitador 2D a 20 x g por 20 min.
  3. Após a fixação, lavar as células DE com solução salina tristamponada com 0,5% de Tween (TBST) (ver Tabela de Materiais) e colocar a placa no agitador a 20 x g durante 10 min. Repita este passo mais uma vez.
  4. Permeabilizar as células fixas adicionando um volume generoso de solução salina tamponada com fosfato com 0,5% de Triton X-100 (PBST); por exemplo, adicione 1 mL de PBST por poço de uma placa de 24 poços e coloque a placa de volta no agitador a 20 x g por 20 min.
  5. Preparar recentemente 5%-6% de BSA em PBST como tampão de bloqueio e adicioná-lo às células permeabilizadas. Incubar a placa durante, pelo menos, 1 h na solução de bloqueio no agitador.
  6. Diluir os anticorpos primários contra SOX17 e FOXA2 em conjunto (ver Tabela de Materiais) em BSA a 2%-3% em solução de PBST. Adicionar os anticorpos combinados às células bloqueadas e colocar a placa no agitador a 4 °C durante a noite a uma velocidade baixa com agitação suave.
    NOTA: SOX17 e FOXA2 são marcadores DE bem estabelecidos25,26.
  7. No dia seguinte, aspirar os anticorpos primários usando um filtro de vácuo portátil e lavar os poços com TBST três vezes, cada uma lavando por 10 minutos no agitador.
  8. Preparar 1:500 diluição de Alexa fluor 488- e 568- anticorpos secundários conjugados (ver Tabela de Materiais) contra as espécies em que os anticorpos primários foram criados.
  9. Adicione a combinação secundária de anticorpos ao poço corado e cubra a placa com papel alumínio para proteger da luz. Coloque a placa no agitador durante 1 h à temperatura ambiente.
  10. Aspirar a solução de anticorpos secundários utilizando um filtro de vácuo portátil e lavar os poços corados com TBST no agitador durante 10 min, cobrindo a placa com folha. Repita a etapa de lavagem um total de três vezes.
  11. Preparar uma diluição de 1 μg/ml de Hoechst 33342 em PBS para corar os núcleos. Adicione a solução Hoechst aos poços e coloque a placa no agitador durante 2-3 min.
  12. Aspirar a solução Hoechst utilizando um filtro de vácuo portátil e enxaguar os poços com PBS duas vezes.
  13. Finalmente, adicione PBS às células coradas e visualize-as usando um microscópio de fluorescência invertida (consulte Tabela de Materiais) no escuro. Mantenha a placa coberta com papel alumínio quando não estiver de imagem para minimizar o branqueamento do fluoróforo.
    NOTA: Alternativamente, a citometria de fluxo pode ser usada para avaliar a eficiência da EAD, conforme descrito na etapa 9.2.

6. Geração do tubo intestinal primitivo (PGT) a partir de hPSCs (Estágio 2)

NOTA: Se a análise de imunofluorescência na etapa 5.13 for determinada como sendo uma co-expressão SOX17-FOXA2 de 80% e acima, o experimento prossegue para o estágio 2. Se a eficiência for <80%, estenda a duração do Estágio 1 a 4 dias.

  1. No dia 1 do Estágio 2, dissociar as células endodérmicas derivadas de hPSC usando TrypLE ou Accutase (ver Tabela de Materiais) para o protocolo P2-D otimizado. Lave as células aderentes com PBS quente e adicione 1 ml de solução de TrypLE ou Accutase a quente por poço de uma placa de 6 poços durante 3-5 min a 37 °C, 5% de CO2, ou até que as células comecem a desligar-se umas das outras.
  2. Dissociar as folhas separadas ou a monocamada de células nos poços e, em seguida, recolhê-las juntas em um tubo de polipropileno de 15 mL usando meios basais de estágio 1/2 sem citocinas contendo pelo menos 0,5% de soro fetal bovino (FBS) ou soro KnockOut (KOSR) (ver Tabela de Materiais).
  3. Girar as células a 800 x g durante 5 minutos a 4 °C e eliminar o sobrenadante. Adicione 1 mL de PBS estéril e ressuspenda o pellet em células únicas.
  4. Conte as células usando um contador automatizado (consulte Tabela de materiais) carregando o volume recomendado de células no slide da câmara. Girar as células ressuspensas a 800 x g durante 5 min a 4 °C e eliminar o sobrenadante.
  5. Ressuspender o pellet no volume apropriado do meio de diferenciação do estágio 2 contendo inibidor de rocha a uma densidade de 2,5-3,5 x 105 células/cm2.
    NOTA: Esta contagem pode descer para uma proporção de divisão de 1:2 para a maioria das linhagens celulares, dependendo da taxa de proliferação. O volume total será de 2 mL de meio com células ressuspensas em 1 poço de placa de 6 poços.
  6. Chapear as células ressuspensas em placas revestidas de matriz de membrana 1:50 (preparadas na etapa 2) e incubá-las a 37 °C, 5% de CO2 na incubadora.
  7. 24 h mais tarde, substituir o meio por meio de diferenciação de estádio 2 sem inibidor de rocha (preparado no passo 1.3.2).

7. Geração de intestino anterior posterior a partir de hPSCs (Estágio 3)

  1. Aspirar o meio Estágio 2 gasto usando um aspirador de vácuo portátil dentro do exaustor de cultura de tecidos e lavar as células com PBS quente.
  2. Adicionar meios de diferenciação da fase 3 da fase 1.4 às células e incubar a 37 °C, 5% de CO2.
  3. Após 24 h, substitua a mídia gasta por uma mídia de diferenciação Stage 3 recém-preparada. Repita isso por um total de 4 dias para o protocolo P2-D (otimizado) e apenas 2 dias para o P1-DE não dissociado.

8. Geração de Progenitores Pancreáticos a partir de hPSCs (Estágio 4)

  1. Após 4 dias de tratamento de Estágio 3, lave as células com PBS quente, gire suavemente a placa e aspire usando um aspirador de vácuo portátil. Em seguida, adicione a mídia de diferenciação do Estágio 4 da etapa 1.5 às células.
  2. Após 24 horas, substitua a mídia gasta por uma mídia recém-preparada do Estágio 4. Repita isso por um total de 4 dias.

9. Avaliação da eficiência de diferenciação de progenitores pancreáticos geradores de hPSCs

  1. Realizar a análise de imunofluorescência dos progenitores pancreáticos derivados de hPSC (Estágio 4) para expressão de PDX1 e NKX6.1.
    NOTA: PDX1 e NKX6.1 são marcadores progenitores pancreáticos bem estabelecidos17,18.
    1. Realizar fixação, permeabilização, bloqueio e incubação e lavagens de anticorpos de acordo com a etapa 5.
    2. Coloração dos progenitores pancreáticos derivados de hPSC com uma combinação de anticorpos PDX1 e NKX6.1 (ver Tabela de Materiais) diluídos em 2%-3% de BSA em PBST.
    3. Use diluições de 1:500 de anticorpos secundários conjugados Alexa fluor 488 e 568 apropriados (ver Tabela de Materiais).
  2. Realizar análise de citometria de fluxo de progenitores pancreáticos derivados de hPSC para expressão de PDX1 e NKX6.1.
    NOTA: A análise por citometria de fluxo de marcadores pancreáticos nos progenitores pancreáticos derivados de hPSC gerados fornece uma maneira de quantificar as células co-expressas de PDX1 e NKX6.1.
    1. No final do Estágio 4, lave as células duas vezes com PBS quente e adicione TrypLE ou Accutase suficientes para cobrir a superfície dos poços, por exemplo, 1 mL de TrypLE ou Accutase por poço de placa de 6 poços. Coloque a placa na incubadora por 5-7 min ou até que as células se desprendam da superfície.
    2. Dissociar as folhas aderentes de células dentro do poço usando uma micropipeta P1000 antes de coletá-las em um tubo de polipropileno de 15 mL.
    3. Gire as células em progenitores pancreáticos derivados de hPSC a 800 x g durante 5 min a 4 °C e, em seguida, elimine o sobrenadante. Lave as células com PBS, dissociando-as em células únicas. Conte as células usando um contador automatizado (consulte Tabela de Materiais) e observe a concentração no número de células por mL.
    4. Gire a 800 x g durante 5 min a 4 °C e elimine o sobrenadante. Adicionar 200 μL de PBS refrigerado ao pellet e dissociar.
    5. Adicionar 2 mL de etanol refrigerado a 80% gota a gota, com o tubo sobre um vórtice a baixa velocidade média (400 x g à temperatura ambiente). Fechar bem as tampas e colocar os tubos ligeiramente inclinados sobre o agitador a 4 °C durante a noite.
    6. Girar as células a 800 x g durante 5 min a 4 °C e lavar com PBS para dissociar quaisquer aglomerados de células fixas.
    7. Bloquear as células fixas com solução de BSA a 5%-6% em PBST durante, pelo menos, 1 h à temperatura ambiente ou 4 °C durante a noite no agitador.
    8. Coloração para os marcadores progenitores pancreáticos seguindo os passos abaixo.
      1. Distribuir 2.00.000 células por condição, incluindo controles isotípicos apropriados dependentes da subclasse IgG da espécie hospedeira do anticorpo primário, controles de anticorpos não corados e secundários em uma placa inferior de 96 poços V ou tubos de centrífuga de 1,5 mL.
      2. Gire a placa a 800 x g durante 5 minutos a 4 °C e vire a placa com um movimento rápido para eliminar o sobrenadante sem perder os pellets. Preparar diluições de anticorpos primários em solução de BSA a 3% (ver Tabela de Materiais).
        NOTA: A concentração de anticorpos primários pode ser entre 1:50 e 1:200.
      3. Incubar as células coradas durante, pelo menos, 2 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C num agitador com agitação suave a baixa velocidade.
      4. Lave as células coradas com TBST três vezes, pipetando as células para cima e para baixo nos poços. Gire e descarte o sobrenadante como na etapa 9.2.8.2.
      5. Adicionar diluição de 1:500 de anticorpos secundários (anticorpos conjugados Alexa fluor 488 e 647) preparados em PBS (ver Tabela de Materiais). Incubar durante 30 min à temperatura ambiente.
      6. Lave as células coradas com TBST pelo menos duas vezes, pipetando as células para cima e para baixo. Gire a placa e elimine o sobrenadante como indicado no passo 9.2.8.2.
      7. Recolher as células coradas em, pelo menos, 100 μL de PBS e transferi-las para tubos FACS protegidos contra a luz (ver Tabela de Materiais). Execute as amostras em uma máquina de citometria de fluxo.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os resultados mostram que o protocolo otimizado P2-D (Figuras 1A) aumentou a eficiência de diferenciação do progenitor pancreático ao regular positivamente a co-expressão de PDX1 e NKX6.1 (Figura 2A, B e Figura 3A). Em particular, os resultados mostraram que a dissociação das células endodérmicas e seu replating na matriz de membrana fresca, juntamente com uma duração mais longa do Estágio 3, aumentaram a expressão ...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho descreve um protocolo aprimorado para a geração de progenitores pancreáticos a partir de hPSCs com alta co-expressão de PDX1 e NKX6.1. A dissociação e o replating da endoderma derivada de hPSC à meia densidade em matriz fresca resultaram em PDX1 e NKX6.1 mais elevados em progenitores pancreáticos derivados de hPSC.

Embora o coquetel do fator de crescimento para cada estágio seja altamente semelhante ao P1-ND 27, foi demonstrado que um tratamento mais prolongado do Estágio 3, incl...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi financiado por uma doação do Qatar National Research Fund (QNRF) (Grant No. NPRP10-1221-160041).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
15 mL, cônicos, tubos de centrífugaThermo Scientific339651
20X TBS Tween 20Thermo Scientific28360
Placas de cultura de 24 poços, fundo plano com tampaCostar3524
50 mL, cônico, tubos de centrífugaThermo Scientific339652
placas de cultura de 6 poços, multipratoThermo Scientific
AccutaseStem Cell Technologies0-7920
Activin AR& D338-ACReconstituído em 4 mM HCl
Anti NKX6.1 anticorpo, camundongo monoclonalDSHBF55A12-CDiluído a 1:100 para citometria de fluxo e 1:2000 para imunocoloração
Anti-PDX1 anticorpo, cobaia policlonal Abcamab47308Diluído a 1:100 para citometria de fluxo e 1:1000 para imunocoloração
B27 menos Vit AThermoFisher12587010
Albumina de soro bovino, fração de choque térmico, livre de ácidos graxosSigmaA7030
CHIR 99021Tocris4423Reconstituído em DMSO
DMEM, alta glicoseThermoFisher41965047
Anticorpo secundário anti-rato IgG (H + L) altamente adsorvido de rato, Alexa Fluor 568InvitrogenA10037
Anticorpo secundário altamente adsorvido anti-coelho IgG (H + L) de burro, Alexa Fluor 488A-21206
DPBS 1XThermoFisher14190144
EGFThermoFisherPHG0313reconstituído em 0,1% BSA em PBS
FGF10R& D345-FGReconstituído em PBS
GlicoseSigma AldrichG8644
Hoechst 33258Sigma23491-45-4
Microscópio invertidoOlympusIX73
KnockOut DMEM/F-12 (1X)Gibco12660-012
Substituição do soro KnockOut SRGibco10828-028
Ácido L-ascórbico (vitamina C)SigmaA92902Reconstituído em água destilada
Matrigel Fator de Crescimento Reduzido (TFG) Matriz da Membrana do Embasamento Corning354230Alíquota o estoque descongelado e congele a -20C.
MCDB131ThermoFisher10372019
Mouse anti-SOX17ORIGENECF500096Diluído a 1:100 para citometria de fluxo e 1:2000 para imunocoloração
mTeSR PlusStem Cell Technologies85850Misture o meio basal com suplemento. Alíquota e loja em -20 ° C por mais tempo ou a 4 &graus; C para uso instantâneo
Unidades de filtro Nalgene, 0.2 µ m PESThermoFisher566-0020
NicotinamidaSigma72340Reconstituída em água destilada
NOGGINR& D6057-NGReconstituído em 0,1% BSA em
solução de paraformaldeído PBS 4% em PBSChemCruzsc-281692
Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)ThermoFisher15140122
Aspirador
Rabbit anti-FOXA2Tecnologia de sinalização celular3143Diluído a 1:100 para citometria de fluxo e 1:500 para imunocoloração
Ácido retinóicoSigma AldrichR2625Reconstituído em inibidor
de rocha DMSO (Y-27632)ReproCell04-0012-02Reconstituído em
tubos FACS de poliestireno de fundo redondo DMSO com tampas, ESTÉRILStellar ScientificFSC-9010
SANT-1Sigma AldrichS4572Reconstituído em DMSO
Sódio bicarbonatoSigmaS5761-500G
StemFlexThermoFisherA3349401Misture os meios basais com suplemento. Alíquota e loja em -20 ° C por mais tempo ou a 4 &graus; C para uso instantâneo
TALI Cellular Analysis SlideInvitrogenT10794
Tali citômetro baseado em imagem contador de células automatizadoInvitrogenT10796
Triton X-100Sigma9002-93-1
TrypLE 100 mLThermoFisher12563011
Tween 20SigmaP2287
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0Invitrogen15575-038
140685portátil a vácuo

Referências

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