Aqui, entregamos miRNA exógeno sintetizado artificialmente ao rim via injeção na veia caudal de um vetor não viral e nanopartículas de polietilenimina em vários modelos de camundongos com doença renal. Isso levou a uma superexpressão significativa de miRNA-alvo no rim, resultando em progressão inibida da doença renal em vários modelos de camundongos.
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Artigo de método
Entrega de miRNA exógeno sintetizado artificialmente ao rim usando nanopartículas de polietilenimina em vários modelos de doença renal em camundongos
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
microRNAs (miRNAs), pequenos RNAs não codificantes (21-25 bases) que não são traduzidos em proteínas, inibem lotes de RNAs mensageiros alvo (mRNAs), desestabilizando e inibindo sua tradução em várias doenças renais. Portanto, a alternância da expressão de miRNA por miRNAs exógenos sintetizados artificialmente é uma opção de tratamento potencialmente útil para inibir o desenvolvimento de muitas doenças renais. No entanto, como a RNAase sérica degrada imediatamente os miRNAs exógenos administrados sistematicamente in vivo, a entrega de miRNA ao rim permanece um desafio. Portanto, vetores que possam proteger miRNA exógeno imita da degradação por RNAase e entregá-los significativamente ao rim são necessários. Muitos estudos têm usado vetores virais para entregar miRNA exógeno imita ou inibidores para o rim. No entanto, vetores virais podem causar uma resposta de interferon e/ou instabilidade genética. Portanto, o desenvolvimento de vetores virais também é um obstáculo para o uso clínico de miRNAs exógenos ou inibidores. Para superar essas preocupações em relação aos vetores virais, desenvolvemos um método de vetor não viral para entregar miRNA miméticos ao rim usando injeção na veia caudal de nanopartículas de polietilenimina (PEI-NPs), o que levou à superexpressão significativa de miRNAs alvo em vários modelos de doença renal em camundongos.
Introdução
Os miRNAs, pequenos RNAs não codificantes (21-25 bases) que não são traduzidos em proteínas, inibem muitos RNAs mensageiros alvo (mRNAs), desestabilizando-os e inibindo sua tradução em várias doenças renais 1,2. Portanto, a terapia gênica empregando miRNAs exógenos sintetizados artificialmente ou inibidores é uma nova opção potencial para inibir o desenvolvimento de muitas doenças renais 3,4,5.
Apesar da promessa de miRNA imita ou inibidores para terapia gênica, a entrega a órgãos-alvo continua sendo um grande obstáculo para experimentos in vivo desenvolverem seu potencial clínico. Como os miRNAs sintetizados artificialmente imitam ou inibem a degradação imediata pela RNase sérica, sua meia-vida é encurtada após administração sistêmica in vivo6. Além disso, a eficiência dos miRNAs miméticos ou inibidores para atravessar a membrana plasmática e o citoplasma transfecto é geralmente muito menor sem vetores apropriados 7,8. Essas linhas de evidência sugerem que o desenvolvimento do sistema de liberação de miRNA imita ou inibidores para o rim é necessário, para permitir seu uso em ambientes clínicos e torná-los uma nova opção de tratamento para pacientes com várias doenças renais.
Vetores virais têm sido utilizados como carreadores para liberar miRNAs exógenos miméticos ou inibidores para o rim 9,10. Embora tenham sido desenvolvidos para biossegurança e eficácia transfectiva, vetores virais ainda podem causar resposta ao interferon e/ou instabilidade genética11,12. Para superar essas preocupações, desenvolvemos um sistema de liberação de miRNA miRNA para o rim usando nanopartículas de polietilenimina (PEI-NPs), um vetor não viral, em vários modelos de doença renal em camundongos13,14,15.
As NP-PEIs são NPs lineares baseadas em polímeros que podem efetivamente entregar oligonucleotídeos, incluindo miRNA miméticos, ao rim, e são consideradas preferíveis para a preparação de vetores não virais devido à sua segurança e biocompatibilidade a longo prazo13,16,17.
Este estudo demonstra os efeitos do miRNA exógeno sistemático mimetizando a liberação com PEI-NPs via injeção na veia caudal em camundongos modelo de fibrose renal produzidos por obstrução unilateral do ureter (UUO). Adicionalmente, demonstramos os efeitos da entrega sistemática de miRNA exógeno mimetizada com PEI-NPs via injeção na veia caudal em camundongos modelo de doença renal diabética (camundongos db/db: C57BLKS/J Iar -+Lepr db/+Leprdb) e camundongos modelo de lesão renal aguda produzidos por lesão de isquemia-reperfusão renal (IRI).
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Protocolo
Todos os protocolos experimentais em animais foram aprovados pelo comitê de ética animal da Jichi Medical University e realizados de acordo com as diretrizes de Uso e Cuidado de Animais Experimentais do Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals. Aqui, demonstramos a entrega de miRNA mimetiza o rim, resultando em sua superexpressão usando camundongos UUO. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Jichi Medical University [Aprovação nºs 19-12 para fibrose renal, 17-024 para infecção renal aguda (IRA) e 19-11 para nefropatia diabética].
1. Preparação do complexo PEI-NPs-miRNA-mimic
NOTA: Aqui, a preparação de PEI-NPs-miRNA-mimic13,14,15 e PEI-NPs-control-miRNA (como um controle negativo) são descritas para um camundongo.
- Prepare os seguintes itens:
- Preparar 10 μL de PEI-NPs lineares.
- Preparar 50 μL de miRNAs sintetizados artificialmente dissolvidos em água livre de nucleases a uma concentração de 100 μM (5 nmol de miRNA dissolvidos em 50 μL de água livre de nucleases).
- Preparar 50 μL de miRNAs de controle (não-alvo) sintetizados artificialmente dissolvidos em água livre de nucleases a uma concentração de 100 μM (5 nmol miRNA dissolvidos em 50 μL de água livre de nucleases).
- Preparar soluções de glicose a 5% e 10%. Garanta a disponibilidade de tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e um misturador de vórtices.
- Dissolver 10 μL de PEI-NPs em 90 μL de solução glicosada a 5% em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Em seguida, vórtice o tubo suavemente e gire para baixo.
- Misturar 50 μL de miRNAs sintetizados artificialmente (5 nmol) dissolvidos em água livre de nucleases (concentração de 100 μM) com 50 μM de solução de glicose a 10% em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Em seguida, vórtice o tubo suavemente e gire para baixo. Este processo produz miRNA dissolvido em solução de glicose a 5%.
- Misturar 100 μL de PEI-NPs em solução glicosada a 5% e 100 μL de miRNA mimic (5 nmol) em solução glicosada a 5%. Em seguida, vórtice o tubo suavemente e gire para baixo.
- Incubar a mistura por 15 min à temperatura ambiente (TR) para preparar um complexo estável de PEI-NPs-miRNA-mimic. Esta solução contém PEI-NPs e miRNA mimic (5 nmol) na proporção de nitrogênios (N) no polímero para fosfato (P) em ácidos nucléicos (relação N/P) = 6 (Figura 1).
NOTA: O complexo PEI-NPs-controle-miRNA pode ser preparado usando o mesmo processo descrito nas etapas 1.1-1.5 para todos os modelos de camundongos com doença renal descritos neste manuscrito (UUO, nefropatia diabética e IRA). Um volume de injeção de PEI-NP-miRNAs-mimic é o mesmo que 5 nmol de miRNAs-mimic conjugados com PEI-NPs na relação N/P = 6. A duração e a frequência de cada mimetismo de PEI-NP-miRNAs dependem do modelo de doença em que é aplicado.
2. Confirmação da entrega significativa de miRNA mimic ao rim em camundongos UUO por PEI-NP via injeção na veia caudal usando microscopia fluorescente
NOTA: Aqui, o método de entrega de miRNA purificado artificialmente mimetizar para o rim é elaborado, indicando o estabelecimento de métodos terapêuticos para várias doenças renais. Em resumo, camundongos UUO receberam miRNA marcado com ácido carboxílico cianine3 (Cy3) adicionado a 100 μL de PEI-NPs através da veia caudal. O parto nos rins foi confirmado com microscopia de fluorescência. É descrito o mimico de miRNA marcado com ácido carboxílico (Cy3) (Cy3) de PEI-NPs-cianina 3 para um camundongo. Este método pode entregar significativamente miRNA mimic para o rim em vários modelos de camundongo, tais como camundongos UUO, camundongos diabéticos com doença renal, e camundongos AKI produzidos por IRI. Aqui, usamos um modelo de mouse UUO para a demonstração em vídeo. O método de indução da UUO foi descrito anteriormente em outro artigo13. Siga estes protocolos dentro de seis dias após a cirurgia UUO.
- Prepare os seguintes itens:
- Preparar 2 μL de PEI-NPs e 100 μL de oligonucleotídeos de fita dupla marcados com Cy3 [Cy3-labeled miRNA mimic (1 nmol; 10 μM)].
- Preparar soluções de glicose a 5% e 10%. Garanta a disponibilidade de tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e um misturador de vórtices.
- Use um tubo de centrífuga de plástico de 50 mL com um pequeno orifício na tampa para isolar as veias da cauda de camundongos UUO.
- Para microscopia de fluorescência, prepare um composto de temperatura de corte ideal (OCT), um criostato, nitrogênio líquido, solução salina tamponada com fosfato (PBS), seringas de 1,0 mL com uma agulha de 27 G e vidro revestido com silano.
NOTA: A lectina tetragonolobus Lotus marcada com fluoresceína (um marcador tubular proximal) e o 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) podem ser preparados para coloração opcional de túbulos proximais e núcleos celulares.
- Dissolver 2 μL de PEI-NPs em 98 μL de solução glicosada a 10% em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Em seguida, vórtice o tubo suavemente e gire para baixo.
- Adicionar 100 μL de miRNA marcado com Cy3 mimic a 100 μL de PEI-NPs em solução de glicose a 10% (preparada na etapa 2.2). Em seguida, vórtice o tubo suavemente e gire para baixo.
- Incubar a mistura por 15 min em RT para preparar um complexo estável de PEI-NPs-Cy3-labeled-miRNA-mimic.
- Coloque o rato UUO de cabeça num tubo de centrífuga de 50 ml sem anestesia e, em seguida, coloque a cauda através do orifício preparado na tampa.
- Encher uma seringa de 1,0 mL com uma agulha de 27 G com 200 μL do complexo PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimimic.
- Injetar PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimic (200 μL) através da veia caudal do rato, utilizando a seringa de 1,0 ml com agulha 27 G.
NOTA: Limpe a veia da cauda com algodão saturado em etanol (70%-80%) para dilatar a veia da cauda e desinfetar a área de injeção. - Uma hora após 200 μL da injeção do complexo PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimetiza o camundongo, anestesiar o camundongo com isoflurano (4%-5%) usando um dispositivo anestésico apropriado para pequenos animais. Confirme a profundidade da anestesia com a ausência do reflexo de pinça dos dedos. Manter a anestesia com isoflurano (3%) durante toda a cirurgia.
- Em seguida, faça uma incisão na pele, músculos e costelas com tesoura cirúrgica e pinça para expor o coração. Depois de fazer uma incisão no átrio direito, injete PBS no ventrículo esquerdo para extrair sangue por todo o corpo até que a cor do rim mude para amarelo pálido (indicando que todo o corpo do rato é perfundido com PBS).
NOTA: A perfusão cardíaca é realizada para remover eficientemente o sangue por todo o corpo. - Pare o isoflurano e remova os rins dos ratos e lave-os com PBS. Depois disso, remova as cápsulas renais dos rins e lave os rins duas vezes com PBS.
- Incorporar as amostras de tecido renal em composto OCT e congelar em nitrogênio líquido.
- Use um criostato para preparar seções (5 μm de espessura). Monte as seções em lâminas de vidro revestidas de silano e fixe-as com paraformaldeído a 4%.
NOTA: Os tecidos renais podem opcionalmente ser corados com lectina tetragonolobus Lotus marcada com fluoresceína (2 mg/mL) na RT por 2 h para os túbulos proximais, seguida por DAPI (30 nM em PBS) na RT por 15 min para os núcleos celulares. - Lave suavemente as lâminas duas vezes com PBS.
- Visualize a coloração de fluorescência por microscopia de fluorescência em aumentos de 100x e 400x e software de imagem apropriado.
3. Confirmação de alterações de miRNA alvo após a entrega de miRNA mimico ao rim por PEI-NP via injeção na veia caudal
- Realizar reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR) para confirmar as alterações de miRNA alvo.
NOTA: Consulte o artigo publicado anteriormente para obter os detalhes do qRT-PCR18,19,20. O sistema qRT-PCR usado para gerar os resultados representativos fornecidos abaixo foi alterado pelo fabricante. qRT-PCR deve ser realizado de acordo com o protocolo mais recente do fabricante.
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Resultados
Os miRNAs alvo para fibrose renal, nefropatia diabética e LRA descritos abaixo foram selecionados com base no microarray, qRT-PCR e/ou pesquisa em banco de dados para aplicações em terapia gênica. Para mais detalhes, consultar as publicações anteriores13,14,15.
Liberação e efeitos do miRNA-146a-5p-mimetismo usando PEI-NPs em camundongos com fibrose renal13
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Discussão
Usando o protocolo apresentado neste manuscrito, PEI-NPs podem entregar miRNA imita ao rim para induzir a superexpressão de miRNAs alvo, resultando em efeitos de tratamento em modelos de camundongos in vivo de várias doenças renais, incluindo fibrose renal, doença renal diabética e IRA.
O método para preparar o complexo de PEI-NPs e miRNA mimic é muito simples. A superfície carregada positivamente dos NP-PEI aprisiona os miRNAs quando eles são apenas misturados13,14,15,16,17 (
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
Este trabalho foi parcialmente apoiado por JSPS KAKENHI (Processo nº 21K08233). Agradecemos a Edanz (https://jp.edanz.com/ac) pela edição dos rascunhos deste manuscrito.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 4',6-diamidino-2-fenilindol para coloração no núcleo | Thermo Fisher Scientific | D-1306 | |
| Buffer RPE | Qiagen | 79216 | Tampão de lavagem 2 |
| Tampão RWT | Qiagen | 1067933 | Tampão de lavagem 1 |
| MiRNA de controle (miRNA sintetizado artificialmente) | Thermo Fisher Scientific | Não atribuído | 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3' (sentido) 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (anti-sentido) |
| Oligonucleotídeos de fita dupla marcados com Cy3 | Takara Bio Inc. | ||
| lectina Lotus tetragonolobus marcada com fluoresceína | Vector Laboratories Inc | FL-1321 | |
| In vivo-jetPEI | Polyplus | 101000021 | |
| MicroAmp Placa de reação óptica de 96 poços para qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | placa de reação de 96 poços |
| Filme adesivo óptico MicroAmp | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Filme adesivo para placa de reação de 96 poços |
| miRNA-146a-5p mimicic (miRNA sintetizado artificialmente) | Thermo Fisher Scientific | Não atribuído | 5'-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU UT-3′ (sentido) 5'-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3′ (anti-sentido) |
| miRNA-146a-5p primer | Qiagen | MS00001638 | Não disponível porque a Qiagen mudou os kits de qRT-PCR (do sistema de PCR miRNA miScript para o sistema de PCR miRNA miRCURY LNA a partir de maio de 2021) |
| miRNA-181b-5p mimic (miRNA sintetizado artificialmente) | Desenho do gene | Não atribuído | 5'-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG GUU-3' |
| miRNA-181b-5p primer | Qiagen | MS00006083 | Não disponível porque a Qiagen mudou os kits qRT-PCR (do sistema de PCR miRNA miScript para o sistema de PCR miRNA miRCURY LNA a partir de maio de 2021) |
| miRNA-5100-mimic (miRNA sintetizado artificialmente) | Design do gene | Não atribuído | 5'-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3′ |
| miRNA-5100-primer | Qiagen | MS00042952 | Não disponível porque a Qiagen mudou os kits qRT-PCR (do sistema de PCR miRNA miScript para o sistema de PCR miRNA miRCURY LNA a partir de maio de 2021) |
| Kit miRNeasy Mini | Qiagen | 217004 | Coluna giratória ancorada por membrana em um tubo de coleta de 2,0 mL |
| kit miScript II RT | Qiagen | 218161 | Não disponível porque a Qiagen mudou os kits qRT-PCR (do sistema de PCR miRNA miScript para o sistema de PCR miRNA miRCURY LNA a partir de maio de 2021) |
| Kit de PCR miScript SYBR Green | Qiagen | 218073 | Não disponível porque a Qiagen mudou os kits qRT-PCR (do sistema de PCR miRNA miScript para o sistema de PCR miRNA miRCURY LNA a partir de maio de 2021) |
| Triturador QIA | Qiagen | 79654 | Colunas de rotação de biopolímero em um tubo |
| de coleta de 2,0 mLReagente de lise QIAzol | Qiagen | 79306 | Reagente de lise à base de fenol/guanidina |
| Sistema de PCR em tempo real QuantStudio 12K Flex Flex | Instrumento de PCR em tempo real | 4472380 | Thermo Fisher Scientific |
| Software versão 1.2.1 do QuantStudio 12K Flex. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Software de instrumento de PCR em tempo real |
| Água sem RNase | Qiagen | 129112 | |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | Não disponível porque a Qiagen mudou os kits qRT-PCR (do sistema de PCR miRNA miScript para o sistema de PCR miRNA miRCURY LNA a partir de maio de 2021) |
| Tissue-Tek OCT (Composto de temperatura de corte ideal) | Sakura Finetek Japan Co.,Ltd. | Não atribuído |
Referências
- Mohr, A. M., Mott, J. L. Overview of microRNA biology. Seminars in Liver Disease. 35 (1), 3-11 (2015).
- Bushati, N., Cohen, S. M. microRNA functions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 175-205 (2007).
- Simpson, K., Wonnacott, A., Fraser, D. J., Bowen, T. microRNAs in diabetic nephropathy: From biomarkers to therapy. Current Diabetes Reports. 16 (3), 35(2016).
- Yheskel, M., Patel, V. Therapeutic microRNAs in polycystic kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (4), 282-289 (2017).
- Lv, W., et al. Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD. Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).
- Dykxhoorn, D. M., Lieberman, J. The silent revolution: RNA interference as basic biology, research tool, and therapeutic. Annual Review of Medicine. 56, 401-423 (2005).
- Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs. Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).
- Stewart, S. A., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9 (4), 493-501 (2003).
- Deng, M., et al. Klotho gene delivery ameliorates renal hypertrophy and fibrosis in streptozotocin-induced diabetic rats by suppressing the Rho-associated coiled-coil kinase signaling pathway. Molecular Medicine Reports. 12 (1), 45-54 (2015).
- Zhou, Y., et al. Suppressor of cytokine signaling (SOCS) 2 attenuates renal lesions in rats with diabetic nephropathy. Acta Histochemica. 116 (5), 981-988 (2014).
- Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Current Gene Therapy. 3 (6), 545-565 (2003).
- Lukashev, A. N., Zamyatnin, A. A. Viral vectors for gene therapy: Current state and clinical perspectives. Biochemistry. Biokhimiia. 81 (7), 700-708 (2016).
- Morishita, Y., et al. Delivery of microRNA-146a with polyethylenimine nanoparticles inhibits renal fibrosis in vivo. International Journal of Nanomedicine. 10, 3475-3488 (2015).
- Ishii, H., et al. MicroRNA expression profiling in diabetic kidney disease. Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. 237, 31-52 (2021).
- Aomatsu, A., et al. MicroRNA expression profiling in acute kidney injury. Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. (21), 00283-00288 (2021).
- Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., Gopferich, A. Polyethylenimine-based non-viral gene delivery systems. European Journal of Pharmceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).
- Swami, A., et al. A unique and highly efficient nonviral DNA/siRNA delivery system based on PEI-bisepoxide nanoparticles. Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 835-841 (2007).
- Kaneko, S., et al. Detection of microRNA expression in the kidneys of immunoglobulin a nephropathic mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (161), e61535(2020).
- Yanai, K., et al. Quantitative real-time PCR evaluation of microRNA expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61383(2020).
- Aomatsu, A., et al. A quantitative detection method for microRNAs in the kidney of an ischemic kidney injury mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), e61378(2020).
- Kushibiki, T., Nagata-Nakajima, N., Sugai, M., Shimizu, A., Tabata, Y. Enhanced anti-fibrotic activity of plasmid DNA expressing small interference RNA for TGF-beta type II receptor for a mouse model of obstructive nephropathy by cationized gelatin prepared from different amine compounds. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 110 (3), 610-617 (2006).
- Xia, Z., et al. Suppression of renal tubulointerstitial fibrosis by small interfering RNA targeting heat shock protein 47. American Journal of Nephrology. 28 (1), 34-46 (2008).
- Tanaka, T., et al. In vivo gene transfer of hepatocyte growth factor to skeletal muscle prevents changes in rat kidneys after 5/6 nephrectomy. American Journal of Transplantation: Official Journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 2 (9), 828-836 (2002).
- Hamar, P., et al. Small interfering RNA targeting Fas protects mice against renal ischemia-reperfusion injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (41), 14883-14888 (2004).
- Ma, D., et al. Xenon preconditioning protects against renal ischemic-reperfusion injury via HIF-1alpha activation. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (4), 713-720 (2009).
- Wei, S., et al. Short hairpin RNA knockdown of connective tissue growth factor by ultrasound-targeted microbubble destruction improves renal fibrosis. Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (12), 2926-2937 (2016).
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Reimpressões e permissões
