Entrega de miRNA exógeno sintetizado artificialmente ao rim usando nanopartículas de polietilenimina em vários modelos de doença renal em camundongos

Resumo

Aqui, entregamos miRNA exógeno sintetizado artificialmente ao rim via injeção na veia caudal de um vetor não viral e nanopartículas de polietilenimina em vários modelos de camundongos com doença renal. Isso levou a uma superexpressão significativa de miRNA-alvo no rim, resultando em progressão inibida da doença renal em vários modelos de camundongos.

Resumo

microRNAs (miRNAs), pequenos RNAs não codificantes (21-25 bases) que não são traduzidos em proteínas, inibem lotes de RNAs mensageiros alvo (mRNAs), desestabilizando e inibindo sua tradução em várias doenças renais. Portanto, a alternância da expressão de miRNA por miRNAs exógenos sintetizados artificialmente é uma opção de tratamento potencialmente útil para inibir o desenvolvimento de muitas doenças renais. No entanto, como a RNAase sérica degrada imediatamente os miRNAs exógenos administrados sistematicamente in vivo, a entrega de miRNA ao rim permanece um desafio. Portanto, vetores que possam proteger miRNA exógeno imita da degradação por RNAase e entregá-los significativamente ao rim são necessários. Muitos estudos têm usado vetores virais para entregar miRNA exógeno imita ou inibidores para o rim. No entanto, vetores virais podem causar uma resposta de interferon e/ou instabilidade genética. Portanto, o desenvolvimento de vetores virais também é um obstáculo para o uso clínico de miRNAs exógenos ou inibidores. Para superar essas preocupações em relação aos vetores virais, desenvolvemos um método de vetor não viral para entregar miRNA miméticos ao rim usando injeção na veia caudal de nanopartículas de polietilenimina (PEI-NPs), o que levou à superexpressão significativa de miRNAs alvo em vários modelos de doença renal em camundongos.

Introdução

Os miRNAs, pequenos RNAs não codificantes (21-25 bases) que não são traduzidos em proteínas, inibem muitos RNAs mensageiros alvo (mRNAs), desestabilizando-os e inibindo sua tradução em várias doenças renais ^1,2. Portanto, a terapia gênica empregando miRNAs exógenos sintetizados artificialmente ou inibidores é uma nova opção potencial para inibir o desenvolvimento de muitas doenças renais ^3,4,5.

Apesar da promessa de miRNA imita ou inibidores para terapia gênica, a entrega a órgãos-alvo cont....

Protocolo

Todos os protocolos experimentais em animais foram aprovados pelo comitê de ética animal da Jichi Medical University e realizados de acordo com as diretrizes de Uso e Cuidado de Animais Experimentais do Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals. Aqui, demonstramos a entrega de miRNA mimetiza o rim, resultando em sua superexpressão usando camundongos UUO. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Jichi Medical University [Aprovação nºs 19-12 para fibrose renal, 17-024 para infecção renal aguda (IRA) e 19-11 para nefropatia diabética].

1. Preparação do complexo PEI-NPs-miRNA-mimic

....

Resultados

Os miRNAs alvo para fibrose renal, nefropatia diabética e LRA descritos abaixo foram selecionados com base no microarray, qRT-PCR e/ou pesquisa em banco de dados para aplicações em terapia gênica. Para mais detalhes, consultar as publicações anteriores^13,14,15.

Liberação e efeitos do miRNA-146a-5p-mimetismo usando PEI-NPs em camundongos com fibrose renal¹³

Discussão

Usando o protocolo apresentado neste manuscrito, PEI-NPs podem entregar miRNA imita ao rim para induzir a superexpressão de miRNAs alvo, resultando em efeitos de tratamento em modelos de camundongos in vivo de várias doenças renais, incluindo fibrose renal, doença renal diabética e IRA.

O método para preparar o complexo de PEI-NPs e miRNA mimic é muito simples. A superfície carregada positivamente dos NP-PEI aprisiona os miRNAs quando eles são apenas misturados13,14,15,16,17 (

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
4',6-diamidino-2-fenilindol para coloração no núcleo	Thermo Fisher Scientific	D-1306
Buffer RPE	Qiagen	79216	Tampão de lavagem 2
Tampão RWT	Qiagen	1067933	Tampão de lavagem 1
MiRNA de controle (miRNA sintetizado artificialmente)	Thermo Fisher Scientific	Não atribuído	5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3' (sentido) 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (anti-sentido)
Oligonucleotídeos de fita dupla marcados com Cy3	Takara Bio Inc.
lectina Lotus tetragonolobus marcada com fluoresceína	Vector Laboratories Inc	FL-1321
In vivo-jetPEI	Polyplus	101000021
MicroAmp Placa de reação óptica de 96 poços para qRT-PCR	Thermo Fisher Scientific	4316813	placa de reação de 96 poços
Filme adesivo óptico MicroAmp	Thermo Fisher Scientific	4311971	Filme adesivo para placa de reação de 96 poços
miRNA-146a-5p mimicic (miRNA sintetizado artificialmente)	Thermo Fisher Scientific	Não atribuído	5'-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU UT-3′ (sentido) 5'-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3′ (anti-sentido)
miRNA-146a-5p primer	Qiagen	MS00001638	Não disponível porque a Qiagen mudou os kits de qRT-PCR (do sistema de PCR miRNA miScript para o sistema de PCR miRNA miRCURY LNA a partir de maio de 2021)
miRNA-181b-5p mimic (miRNA sintetizado artificialmente)	Desenho do gene	Não atribuído	5'-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG GUU-3'
miRNA-181b-5p primer	Qiagen	MS00006083	Não disponível porque a Qiagen mudou os kits qRT-PCR (do sistema de PCR miRNA miScript para o sistema de PCR miRNA miRCURY LNA a partir de maio de 2021)
miRNA-5100-mimic (miRNA sintetizado artificialmente)	Design do gene	Não atribuído	5'-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3′
miRNA-5100-primer	Qiagen	MS00042952	Não disponível porque a Qiagen mudou os kits qRT-PCR (do sistema de PCR miRNA miScript para o sistema de PCR miRNA miRCURY LNA a partir de maio de 2021)
Kit miRNeasy Mini	Qiagen	217004	Coluna giratória ancorada por membrana em um tubo de coleta de 2,0 mL
kit miScript II RT	Qiagen	218161	Não disponível porque a Qiagen mudou os kits qRT-PCR (do sistema de PCR miRNA miScript para o sistema de PCR miRNA miRCURY LNA a partir de maio de 2021)
Kit de PCR miScript SYBR Green	Qiagen	218073	Não disponível porque a Qiagen mudou os kits qRT-PCR (do sistema de PCR miRNA miScript para o sistema de PCR miRNA miRCURY LNA a partir de maio de 2021)
Triturador QIA	Qiagen	79654	Colunas de rotação de biopolímero em um tubo
de coleta de 2,0 mLReagente de lise QIAzol	Qiagen	79306	Reagente de lise à base de fenol/guanidina
Sistema de PCR em tempo real QuantStudio 12K Flex Flex	Instrumento de PCR em tempo real	4472380	Thermo Fisher Scientific
Software versão 1.2.1 do QuantStudio 12K Flex.	Thermo Fisher Scientific	4472380	Software de instrumento de PCR em tempo real
Água sem RNase	Qiagen	129112
RNU6-2 primer	Qiagen	MS00033740	Não disponível porque a Qiagen mudou os kits qRT-PCR (do sistema de PCR miRNA miScript para o sistema de PCR miRNA miRCURY LNA a partir de maio de 2021)
Tissue-Tek OCT (Composto de temperatura de corte ideal)	Sakura Finetek Japan Co.,Ltd.	Não atribuído

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