Medições do reflexo H terminal em camundongos

Resumo

A avaliação clínica da espasticidade baseada no reflexo de Hoffmann (reflexo H) e utilizando a estimulação elétrica de nervos periféricos é um método estabelecido. Aqui, nós fornecemos um protocolo para uma estimulação nervosa terminal e direta para quantificação do reflexo H na pata dianteira de camundongos.

Resumo

O reflexo de Hoffmann (reflexo H), como análogo elétrico ao reflexo de estiramento, permite a validação eletrofisiológica da integridade dos circuitos neurais após lesões como lesão medular ou acidente vascular cerebral. Um aumento da resposta reflexa H, juntamente com sintomas como contrações musculares não voluntárias, reflexo de estiramento patologicamente aumentado e hipertonia no músculo correspondente, é um indicador de espasticidade pós-AVC (PSS).

Em contraste com medidas transcutâneas bastante inespecíficas do nervo, apresentamos aqui um protocolo para quantificar o reflexo-H diretamente nos nervos ulnar e mediano da pata anterior, que é aplicável, com pequenas modificações, ao nervo tibial e ciático da pata traseira. Baseado na estimulação direta e na adaptação a diferentes nervos, o método representa uma ferramenta confiável e versátil para validar mudanças eletrofisiológicas em modelos de doenças relacionadas à espasticidade.

Introdução

O reflexo de Hoffmann (reflexo H), nomeado em homenagem ao fisiologista Paul Hoffmann, pode ser evocado pela estimulação elétrica de nervos periféricos, que carregam axônios de neurônios sensoriais e motores que surgem e levam aos mesmos músculos. É o análogo eletricamente induzido do reflexo de estiramento monossináptico e compartilha a mesma via¹. Diferentemente do alongamento muscular, o reflexo H resulta da estimulação elétrica. Quando os nervos periféricos são estimulados eletricamente em baixa intensidade de corrente, as fibras aferentes de Ia são tipicamente despolarizadas primeiro devido ao seu grande diâmetro axonal². Seus potenciais de ação excitam neurônios motores alfa (αMNs) na medula espinhal, que por sua vez provocam potenciais de ação que viajam pelos axônios αMN em direção ao músculo (Figura 1). Essa cascata gera uma resposta muscular com pequena amplitude, refletida na chamada onda H. Ao aumentar gradualmente a intensidade do estímulo, a amplitude da onda H aumenta devido ao recrutamento de unidades motoras adicionais. A partir de uma certa intensidade de estímulo, potenciais de ação nos axônios mais finos dos αMNs são eliciados diretamente, o que é registrado como a onda M. Essa onda M aparece com latência menor que a onda H (Figura 2). Se a intensidade da estimulação é aumentada, a amplitude da onda M torna-se maior devido ao recrutamento de mais axônios αMN, enquanto a onda H gradualmente se torna menor. A onda H pode ser suprimida em altas intensidades de estímulo devido à retropropagação antidrômica dos potenciais de ação nos axônios αMN. Esses potenciais de ação desencadeados colidem com os da estimulação Ia e, assim, podem se anular. Em intensidades de estímulo supramáximas, os potenciais de ação ortodrômicos (em direção ao músculo) e antidrômicos (em direção à medula espinhal) ocorrem em todos os axônios do NM; o primeiro dá origem à amplitude máxima da onda M (Mmáx), enquanto o segundo resulta na completa abolição do reflexo H³.

Para a avaliação da espasticidade pós-AVE (ECP) ou lesão medular (LME), o reflexo H tem sido utilizado para avaliar a base neural do movimento e espasticidade em^humanos1. Uma melhor quantificação da mudança no reflexo H entre as medidas e entre os sujeitos é obtida usando a razão da onda H e M (relação H/M). Alternativamente, a depressão dependente da taxa (RDD) é medida, usando um conjunto de frequências ascendentes (por exemplo, 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 e 5,0 Hz). A RDD reflete a integridade de circuitos inibitórios que podem ser perturbados por acidente vascular cerebral ou LME. Quando todos os circuitos neurais estão intactos, há uma supressão uniforme, independente da frequência, do reflexo-H. No entanto, se houver redução da inibição neural como resultado de AVC ou LME, a supressão do reflexo-H diminui com o aumento da frequência de estimulação⁴.

O correto registro eletrofisiológico utilizando eletrodos de superfície pode ser desafiador e pode ser afetado por tarefas motoras, mecanismos inibitórios e excitabilidade de αMN⁵. No registro transcutâneo em roedores, um eletrodo de estímulo é colocado próximo ao nervo tibial e um eletrodo de registro é colocado próximo aos músculos relacionados na pata anterior. De acordo com nossa experiência, entretanto, o correto posicionamento dos eletrodos transcutâneos (Figura 1A) é ainda mais complexo e variável em roedores do que o posicionamento de eletrodos de superfície em humanos. Isso pode levar a diferenças no comprimento, frequência e intensidade de estimulação necessários para eliciar o reflexo H. Esses desafios metodológicos poderiam explicar por que há apenas um número muito limitado de estudos de mensuração do reflexo H (por exemplo, em modelos experimentais de^AVE3,4 e outros modelos de espasticidade6. Uma estimulação precisa (a longo prazo) e o registro do reflexo-H em nervos individuais poderiam, em princípio, ser obtidos usando eletrodos implantáveis ao redor do nervo alvo ^7,8. Devido ao desafio cirúrgico com potenciais efeitos colaterais para o animal e potencial instabilidade da sonda, essa abordagem não se tornou um padrão na área. O método aqui apresentado também requer alguns conhecimentos cirúrgicos. No entanto, permite uma nova e precisa estimulação e registro de nervos isolados in vivo usando baixas intensidades de estimulação, o que evita a estimulação simultânea de nervos vizinhos.

Protocolo

Todos os experimentos foram conduzidos em conformidade com as leis europeias e nacionais de cuidados com animais e diretrizes institucionais, e foram aprovados pelo Landesamt für Natur-, Umwelt-, und Verbraucherschutz North Rhine-Westphalia (Az: 81-02.04.2019.A309). O protocolo é otimizado para camundongos adultos (aprox. 8-16 semanas de idade C57Bl/6J) e para o registro do membro torácico. Pode ser facilmente adaptado, estimulando-se os respectivos nervos do membro pélvico e registrando-se os músculos da pata traseira (Figura 1B). Uma descrição dos eletrodos de gravação e estimulação é adicionada na Tabela de Materiais. Observe que o protocolo é usado apenas para uma medição terminal.

1. Preparo

1. Pesar o animal e iniciar a anestesia injetando i.p . uma mistura de cetamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg).
2. Mantenha o mouse na caixa de aquecimento até que a tolerância cirúrgica seja atingida. Aguarde alguns minutos até que o mouse esteja calmo, a respiração esteja estável e os reflexos estejam ausentes. Verifique a profundidade da anestesia medindo a falta de resposta ao pinça do dedo do pé.
3. Vire o mouse de costas e coloque-o em uma almofada de aquecimento (o ideal seria o aquecimento controlado por feedback usando uma sonda de temperatura retal). Fixe as patas dianteiras com fita adesiva. Aqui, certifique-se de que a fita esteja posicionada de forma que os eletrodos de medição sejam facilmente inseridos nas patas dianteiras.
4. Inserir uma sonda retal para medir a temperatura do animal e fixá-la com fita adesiva. Aplique pomada ocular para evitar que os olhos sequem.

2. Cirurgia

OBS: A condição estável do animal anestesiado, ou seja, respiração, temperatura e perda de reflexos, deve ser monitorada regularmente durante todo o procedimento. O procedimento de medida direta da onda H do nervo é mostrado para o nervo radial/ulnar/mediano da pata anterior (Figura 3A). A medida também pode ser adaptada para a pata traseira (nervo ciático/tibial) com modificações.

1. Para uma melhor visão geral da área cirúrgica, remova os cabelos com uma navalha elétrica ou uma tesoura em um lugar separado antes. Para cirurgiões mais experientes, isso é apenas opcional.
   NOTA: A desinfecção não é necessária aqui, pois este é um experimento final. O animal será sacrificado posteriormente.
2. Levante a pele com uma pinça e faça uma incisão de aproximadamente 1 cm na pele ao longo do eixo ventro-posterior da pata anterior (área acima da axila e tórax) com uma tesoura fina e arredondada.
3. Remova cuidadosamente o tecido conjuntivo e exponha o músculo e o nervo por baixo. Retirar o músculo peitoral profundo exposto com pinças para acessar o nervo mediano (Figura 3E,F). Remova pequenas quantidades de sangue e fluido tecidual com tecidos moles.
4. Na etapa seguinte, corte cuidadosamente a mama ou o músculo axilar de cima para baixo para expor o feixe nervoso por baixo. Liberte o feixe nervoso do tecido conjuntivo e muscular em um comprimento de aproximadamente 1,5 cm.
   NOTA: Aqui, deve-se tomar cuidado especial para não danificar os vasos sanguíneos que correm em paralelo ao nervo mediano. Ao cortar o tecido, sempre corte ao longo do nervo para evitar machucá-lo. Se isso acontecer, remova o líquido e o sangue que vazam com um cotonete. O microscópio estéreo não é necessário para todo o experimento, no entanto, pode ser útil para a preparação dos nervos.
5. Separe cuidadosamente o nervo ulnar e mediano da pata anterior usando uma pipeta de vidro dobrada (Figura 3E). A parte superior dos dois nervos é o nervo ulnar, e a inferior é o nervo mediano.
   NOTA: Ao separar os nervos uns dos outros, certifique-se de que o vaso sanguíneo abaixo não está ferido.

3. Colocação do eletrodo

1. Dispor os eletrodos do gancho de estimulação em paralelo a uma distância de 0,5-1,0 mm e usar um micromanipulador para posicionar o gancho duplo próximo ao nervo.
2. Use o gancho de vidro como uma ferramenta para levantar o nervo ulnar sobre os eletrodos do gancho de estimulação. Puxe o eletrodo com o nervo e separe-o dos outros nervos por aproximadamente 1-2 mm usando o micromanipulador (Figura 3D,F).
3. Coloque os eletrodos ao longo do longo eixo da pata para reduzir o crosstalk entre os músculos.
   NOTA: A colocação dos eletrodos é muito importante, mas difícil de padronizar devido à anatomia individual. É necessário um cirurgião experiente para colocar os eletrodos corretamente. Os fios também podem ser reposicionados caso a amplitude do sinal seja insatisfatória.
4. Secar superficialmente os ganchos de eletrodos presos ao nervo e aplicar vaselina usando uma seringa para fornecer isolamento elétrico do tecido adjacente.
   NOTA: Deve-se tomar cuidado para aplicar vaselina suficiente no eletrodo e também entre os dois ganchos para garantir o isolamento elétrico e evitar que os nervos sequem.

4. Colocação dos eletrodos de gravação e referência

1. Para medir o reflexo H, posicione os eletrodos EMG por via intramuscular na pata dianteira. Além disso, posicione o eletrodo de referência no subcutâneo do membro posterior (por exemplo, usando um pino minúsculo), segurado por um clipe de jacaré em miniatura (Figura 3B).
2. Quando o estimulador estiver ligado, observe uma estimulação bem-sucedida como pequenas contrações da pata dianteira. A corrente de estimulação mínima para eliciar a onda M e pequenas contrações visíveis na pata anterior deve estar na faixa de 10-50 μA.
   NOTA: Se nenhuma contração for visível a 50 μA, ajuste os eletrodos de estimulação e reaplique vaselina líquida. Além disso, em camundongos, não é incomum que a onda M apareça em intensidades de estimulação menores do que a onda H⁵.

5. Medição

1. Repetir a estimulação do nervo 15 vezes com pulsos longos de 0,2 ms cada. Com pausas de 2 min entre as séries de estímulos, a frequência é aumentada de 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 para 5 Hz.
   NOTA: Estas frequências são necessárias se calcular o RDD posteriormente. Todos os dados EMG são gravados, digitalizados e analisados usando software, por exemplo, o software Spike2 (CED, versão 7.19). A maior amplitude da onda H é esperada em 0,1 Hz. Quanto maior a frequência, menor a amplitude da onda H torna-se devido ao RDD.
2. Após o experimento, sacrificar o animal conforme protocolo da IACUC do instituto. Neste experimento, a perfusão transcárdica em camundongos foi realizada com PBS e PFA a 4% sob anestesia profunda.

Resultados

A partir do n = 15 tentativas de estimulação por frequência de estimulação e pata, selecione pelo menos n = 10 registros bem-sucedidos para a análise. Tentativas com erros de medição (por exemplo, ausência de onda M) são excluídas da análise. Analise cada ensaio separadamente e gere uma média para comparações de grupo/tempo mais tarde. A latência entre a estimulação e o aparecimento da onda M e da onda H é registrada para cada tentativa. Em nossa experiência, a onda M ocorre aproximadamente 2 ms após a estimulação, e a o...

Discussão

Em contraste com as medidas transcutâneas do reflexo H previamente descritas em^camundongos6, fornecemos uma medida mais direta e específica do nervo. Essa nova abordagem pode ser aplicada aos nervos dos membros anteriores e posteriores (por exemplo, mediano, ulnar e radial, tibial e ciático, respectivamente), tornando esse método adaptável como ferramenta diagnóstica a muitos modelos de doenças (por exemplo, acidente vascular cerebral, esclerose múltipla, esclerose lateral amiotrófica, traumatismo...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Absorvente Underpad	VWR	115-0684
AD converter	Cambridge Electronic Design, UK	CED 1401micro
Amplifier	Workshop Zoological Institute, UoC-Digital
stimulator	Workshop Zoological Institute, UoC	MS 501
EMG electrodes	Workshop Zoological Institute, UoC		Dois fios de cobre isolados e torcidos (50 µ m de diâmetro externo) foram soldados a um plugue macho e conectados a um amplificador diferencial.
Pomada para os olhos	Bayer	Bepanthen
Oficina de pipeta de vidro	Instituto Zoológico, UoC-Prepare		uma pipeta de vidro dobrada em um simples gancho de vidro na chama de um bico de Bunsen.
Caixa de aquecimento	MediHeat	MediHeat V1200
Almofada de aquecimento	WPI	61840 Almofada
Eletrodos de gancho	Oficina Instituto Zoológico, UoC-Para		produzir os eletrodos, dobre os pinos em miniatura de aço inoxidável em ganchos em uma extremidade e insira em cânulas rombas para criar contato mecânico direto. Solde a extremidade da cânula a fios de cobre (comprimento aprox. 50 cm), que estão conectados a um dispositivo de estimulação ou gravação.
Cetamina	Pfizer	Ketavet
Sonda retal	WPI	RET-3
Unidade de isolamento do estimulador	Workshop Zoological Institute, UoC	MI 401
Esterilizador	CellPoint Scientific	Germinator 500	A desinfecção pré e pós-operatória de rotina do equipamento cirúrgico deve ser feita por esterilização por calor. Descontamine instrumentos por 15 s no banho de esferas de vidro aquecido (260° C).
Controlador de temperatura	WPI	ATC200
Vaselina
	Bayer	Rompun

de aquecimento Bayer-Xilazina