Medições do reflexo H terminal em camundongos

O reflexo H permite a validação eletrofisiológica da integridade dos circuitos neurológicos. Apresentamos um protocolo terminal para quantificar o reflexo H diretamente nos nervos da pata anterior em camundongos. Diferentemente dos registros transcutâneos convencionais e inespecíficos do nervo, os resultados são menos variáveis entre camundongos e dias de medição.

Semelhante aos registros do reflexo H em pacientes, pois a quantificação precisa permite a caracterização eletrofisiológica em modelos de doenças, por exemplo, lesão medular e acidente vascular cerebral. O protocolo requer sólidas habilidades experimentais no trabalho com equipamentos cirúrgicos em camundongos.

Se você não tem certeza de como separar os nervos do tecido conjuntivo e dos vasos sanguíneos, pratique primeiro. A demonstração do procedimento será feita por Frederique Wieters, estudante de doutorado do meu laboratório. Para começar, coloque o rato C57 preto/6J adulto anestesiado com 8 a 16 semanas de idade na almofada de aquecimento coberta e espere até que o rato esteja calmo, a respiração estável e os reflexos estejam ausentes.

Vire o mouse de costas. Em seguida, fixe as patas dianteiras com fita adesiva. Posicione a fita de forma que os eletrodos de medição sejam facilmente inseridos nas patas dianteiras.

Para medir a temperatura de um rato, insira uma sonda retal e fixe-a com fita adesiva. Aplique pomada ocular para evitar que os olhos sequem. Retire o pelo cuidadosamente com uma tesoura fina e arredondada enquanto levanta a pele com uma pinça.

Em seguida, faça uma incisão de um centímetro na pele ao longo do eixo ventroposterior da pata anterior com uma tesoura fina e arredondada. Remova cuidadosamente o tecido conjuntivo e exponha o músculo e o nervo por baixo. Em seguida, remova o músculo peitoral profundo exposto usando pinça para avaliar o nervo mediano.

Remova pequenas quantidades de sangue e fluido tecidual com papel de tecido mole. Em seguida, corte cuidadosamente a mama ou o músculo axilar de cima para baixo para expor o feixe nervoso. Liberte o feixe nervoso do tecido conjuntivo e muscular ao longo de um comprimento de aproximadamente 1,5 centímetros.

Separe cuidadosamente o nervo ulnar e mediano da pata anterior usando uma pipeta de vidro dobrada. O nervo superior é o nervo ulnar e o inferior é o nervo mediano. Disponha os eletrodos do gancho do estimulador em paralelo a uma distância de 0,5 a um milímetro e use um micromanipulador para posicionar o gancho duplo próximo ao nervo.

Use o gancho de vidro para levantar o nervo ulnar sobre os eletrodos do gancho de estimulação. Em seguida, puxe o eletrodo com o nervo e separe-o dos outros nervos. Coloque os eletrodos ao longo do longo eixo da pata para reduzir o crosstalk entre os músculos.

Secar superficialmente os ganchos de eletrodos presos ao nervo e aplicar vaselina usando uma seringa para fornecer isolamento elétrico do tecido adjacente. Para medir o reflexo H, posicione os eletrodos eletromiográficos por via intramuscular na pata anterior. Em seguida, posicione o eletrodo de referência no subcutâneo do membro pélvico, segurado por um clipe de jacaré em miniatura.

Quando o estimulador estiver ligado, observe uma estimulação bem-sucedida como pequenas contrações da pata dianteira. A corrente de estimulação mínima para provocar a onda M e pequenas contrações visíveis na pata dianteira estão entre 10 a 50 microamperes. Realizar a estimulação nervosa 15 vezes com pulsos de 0,2 milissegundos cada.

Com pausas de dois minutos entre as séries de estímulos, a frequência é aumentada de 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 para 5 hertz. Uma ilustração do registro montado em vias para medir o reflexo de Hoffman e a resposta muscular é mostrada aqui. A relação entre a amplitude das ondas H e M foi avaliada.

O estímulo e o respectivo artefato de estimulação foram fixados em zero milissegundos, seguidos da onda M direta e do subsequente pico menor representando a onda H. A onda M ocorre aproximadamente dois milissegundos após a estimulação, e a onda H após seis a oito milissegundos devido ao maior tempo de trânsito através da medula espinhal. Ao lado da separação dos nervos, a aplicação de vaselina no eletrodo e também entre os dois ganchos são fundamentais.

Este é um experimento terminal. Em nosso laboratório, essa técnica forneceu uma nova referência padrão-ouro para os registros transcutâneos do reflexo H.