Isolamento e Perfil das Células Endoteliais Mesentóricas Primárias Humanas no Nível Transcriptome

Naseeb Kaur Malhi; Yingjun Luo; Xiaofang Tang; Kiran Sriram; Riccardo Calandrelli; Sheng Zhong; Zhen Bouman Chen

doi:10.3791/63307

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Artigo de método

Isolamento e Perfil das Células Endoteliais Mesentóricas Primárias Humanas no Nível Transcriptome

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DOI:

10.3791/63307

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14 de março de 2022

Naseeb Kaur Malhi^*¹ , Yingjun Luo^*¹ , Xiaofang Tang^*¹ , Kiran Sriram¹^,³ , Riccardo Calandrelli² , Sheng Zhong² , Zhen Bouman Chen¹^,³

¹Department of Diabetes Complications and Metabolism, City of Hope, ²Department of Bioengineering, University of California San Diego, ³Irell and Manella Graduate School of Biological Sciences, City of Hope

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

O protocolo descreve o isolamento, a cultura e o perfil das células endoteliais da artéria mesentérica humana. Além disso, é fornecido um método para preparar a artéria humana para transcrição espacial. Os ensaios proteômicos, transcriptomics e funcionais podem ser realizados em células isoladas. Este protocolo pode ser reaproveitado para qualquer artéria de médio ou grande porte.

Resumo

As células endoteliais (CE) são cruciais para a função vascular e do corpo inteiro através de sua resposta dinâmica às pistas ambientais. Elucidar o transcritor e o epigenome das CE é primordial para entender seus papéis no desenvolvimento, saúde e doença, mas é limitado na disponibilidade de células primárias isoladas. As tecnologias recentes permitiram o perfil de alto rendimento do transcritor e do epigenome ce, levando à identificação de subpopulações de células EC até então desconhecidas e trajetórias de desenvolvimento. Embora as culturas CE sejam uma ferramenta útil na exploração da função e disfunção da CE, as condições de cultura e múltiplas passagens podem introduzir variáveis externas que alteram as propriedades da CE nativa, incluindo morfologia, estado epigenético e programa de expressão genética. Para superar essa limitação, o presente artigo demonstra um método de isolar as CEs primárias humanas das artérias mesentéricas doadoras com o objetivo de capturar seu estado natal. Os CES na camada intimal são dissociados mecanicamente e bioquimicamente com o uso de enzimas particulares. As células resultantes podem ser usadas diretamente para RNA em massa ou sequenciamento de RNA de células únicas ou banhadas para cultura. Além disso, um fluxo de trabalho é descrito para a preparação do tecido arterial humano para transcrição espacial, especificamente para uma plataforma comercialmente disponível, embora este método também seja adequado para outras técnicas de perfil de transcriptome espacial. Essa metodologia pode ser aplicada a diferentes vasos coletados de uma variedade de doadores em estados de saúde ou doenças para obter insights sobre a regulação transcricional e epigenética da CE, um aspecto crucial da biologia celular endotelial.

Introdução

Forrando o lúmen dos vasos sanguíneos, as células endoteliais (CE) são reguladores cruciais do tom vascular e da perfusão tecidual. Os CES são notáveis em sua capacidade de reagir ao ambiente extracelular e adaptar-se às mudanças na dinâmica e composição do fluxo sanguíneo. Essas respostas dinâmicas são mediadas através de uma rede de eventos de sinalização intracelular, incluindo modulações transcricionais e pós-transcricionais com resolução spatio-temporal. A desregulação dessas respostas está implicada em muitas patologias, incluindo, mas não se limitando a doenças cardiovasculares, diabetes e câncer ^1,2.