O protocolo permite a geração de uma população de adipócitos puros a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). O ácido retinóico é usado para diferenciar iPSCs em células-tronco mesenquimais (CTMs) que são usadas para produzir adipócitos. Em seguida, uma abordagem de classificação baseada na coloração vermelha do Nilo é usada para obter adipócitos puros.
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Artigo de método
Diferenciação Robusta de iPSCs Humanas em uma População Pura de Adipócitos para Estudo de Distúrbios Associados a Adpócitos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Avanços recentes na tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) têm permitido a geração de diferentes tipos celulares, incluindo adipócitos. Entretanto, os métodos de diferenciação atuais têm baixa eficiência e não produzem uma população homogênea de adipócitos. Aqui, contornamos esse problema usando um método baseado em trans-retinóicos para produzir células-tronco mesenquimais (CTMs) em alto rendimento. Ao regular as vias que governam a proliferação, sobrevivência e adesão celular, nossa estratégia de diferenciação permite a geração eficiente de corpos embrionários (EBs) que se diferenciam em uma população pura de CTMs multipotentes. O elevado número de CTMs geradas por este método fornece uma fonte ideal para a geração de adipócitos. No entanto, a heterogeneidade da amostra resultante da diferenciação dos adipócitos permanece um desafio. Portanto, usamos um método à base de vermelho do Nilo para purificar adipócitos maduros portadores de lipídios usando FACS. Essa estratégia de classificação nos permitiu estabelecer uma maneira confiável de modelar distúrbios metabólicos associados aos adipócitos usando um pool de adipócitos com heterogeneidade amostral reduzida e funcionalidade celular aprimorada.
Introdução
As células-tronco mesenquimais (CTMs) atuam como um recurso transitório efetivo para a produção de células de origem mesodérmica, como adipócitos, osteócitos e condrócitos, que poderiam ser posteriormente utilizadas para modelar suas respectivas doenças genéticas. No entanto, abordagens anteriores baseavam-se na obtenção dessas CTMs a partir de tecidos adultos 1, o que impunha o desafio de obtê-las em grande número dos doadores e a limitação de mantê-las funcionalmente viáveis em condições subótimas de cultivo in vitro 1,2. Esses obstáculos têm gerado uma grande demanda de se t....
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Protocolo
O estudo foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa institucional apropriado e realizado de acordo com os padrões éticos estabelecidos na Declaração de Helsinque de 1964 e suas alterações posteriores ou padrões éticos comparáveis. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) do HMC (nº 16260/16) e QBRI (nº 2016-003). Este trabalho também é otimizado para hESCs como H1 e H9. Amostras de sangue foram obtidas de indivíduos sadios com pleno consentimento informado. As iPSCs são geradas a partir de células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de indivíduos saudáveis.
1. Cultura e manutenção de iPSCs
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Resultados
Esquema e morfologia das células durante a diferenciação mesenquimal: A diferenciação de iPSCs em CTMs envolve vários estágios de desenvolvimento abrangendo a formação de EB, diferenciação de CTM e expansão de CTM (Figura 1). Durante esses estágios de desenvolvimento, as células adquirem várias morfologias devido aos diferentes produtos químicos estimulatórios a que são submetidas. Ao iniciar a diferenciação, as células são plaqueadas em suspensão e espera-se que sejam redondas, com bordas c.......
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Discussão
Este protocolo tem importância primordial devido à sua capacidade de fornecer CTMs em alto rendimento e eficiência. Essa produção em massa de CTMs em escala foi possível pela incubação transitória de EBs derivadas de iPSCs com 10 μM de AR14,15. O tratamento transitório com 10 μM de AR aumentou o rendimento das CTM em 11,2 a 1542 vezes14,15, sendo esse protocolo aplicável tanto em iPSCs quanto em hPSCs. Ne.......
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Divulgações
Os autores declaram não ter interesses concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por uma bolsa do Qatar National Research Fund (QNRF) (Grant No. NPRP10-1221-160041). Maryam Aghadi foi apoiada pela bolsa GSRA do Qatar National Research Fund (QNRF).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Adiponectina | Abcam | ab22554 | Marcador de maturação de adipócitos |
| anti-CD105 | BD Pharmingen | 560839 | Marcador de diferenciação MSC |
| anti-CD14 | BD Pharmingen | 561712 | Marcador de diferenciação MSC |
| anti-CD19 | BD Pharmingen | 555415 | Marcador de diferenciação MSC |
| anti-CD34 | BD Pharmingen | 555824 | Marcador de diferenciação MSC |
| anti-CD44 | abcam | ab93758 | Marcador de diferenciação MSC |
| anti-CD45 | BD Pharmingen | 560975 | Marcador de diferenciação MSC |
| anti-CD73 | BD Pharmingen | 550256 | Marcador de diferenciação MSC |
| anti-CD90 | BD Pharmingen | 555596 | Marcador de diferenciação MSC |
| bFGF | R& D | 233-FP | MSC suplemento de meio de cultura |
| C / EBPA | Abcam | ab40761 | Marcador de maturação de adipócitos |
| Dexametasona | Torics | 1126 | Suplemento de meios de diferenciação de adipócitos |
| FABP4 | Abcam | ab93945 | Marcador de maturação de adipócitos |
| Soro bovino fetal | Suplemento de meio de cultura | ThermoFisher | 10082147 |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050-061 | MSC suplemento de mídia de cultura |
| IBMX | Sigma Aldrich | I5879 | Suplemento de mídia de diferenciação de adipócitos |
| Indometacina | Sigma Aldrich | I7378 | Suplemento de mídia de diferenciação de adipócitos |
| Insulina | Sigma Aldrich | 91077C | Suplemento de mídia de diferenciação de adipócitos |
| Knockout DMEM | ThermoFisher | 12660012 | Meios basais para a preparação de matrigel |
| Baixo teor de glicose DMEM | ThermoFisher | 11885084 | MSC meios de cultura |
| Matrigel | Corning | 354230 | Matriz de revestimento |
| MEM-alfa | ThermoFisher | 12561056 | Meios de diferenciação de adipócitos |
| Nilered | Sigma Aldrich | 19123 | Marcador de classificação para adipócito |
| Penicilina | ThermoFisher | 15140122 | MSC/Suplemento de mídia de adipócitos |
| Salina tamponada com fosfato | Tampão | de lavagem de 14190144 | ThermoFisher |
| Pierce™ 20X TBS Buffer | Thermo Fisher | 28358 | tampão de lavagem |
| PPARG | Tecnologia de Sinalização Celular | 2443 | Marcador de maturação de adipócitos |
| ReLeSR | Stem Cell Tecnologias | 5872 | Reagente de dissociação |
| Ácido retinóico | Sigma Aldrich | R2625 | MSC suplemento de mídia de diferenciação |
| Inibidor de rocha | Tocris | 1254/10 | hPSC suplemento de mídia de cultura |
| Roziglitazona | Sigma Aldrich | R2408 | Suplemento de mídia de diferenciação de adipócitos |
| StemFlex | ThermoFisher | A334901 | hPSC meio de cultura |
| Triton | Thermo Fisher | 28314 | Reagente de permebealização |
| Tripsina | ThermoFisher | 25200072 | Reagente de dissociação |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7942 | Tampão de lavagem |
Referências
- Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Communication and Signaling: CCS. 9, 12(2011).
- Wagner, W., et al.
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Reimpressões e permissões
