Artigo de método

Propriedades de medição do esqueleto periódico da membrana do segmento inicial de axônio usando microscopia de iluminação estruturada em 3D (3D-SIM)

DOI:

10.3791/63327

⸱

11 de fevereiro de 2022

 ,  , 
1Minerva Foundation Institute for Medical Research, 2Department of Computer Science, Aalto University School of Science, 3HiLIFE - Neuroscience Center, University of Helsinki, 4HiLIFE - Institute of Biotechnology, University of Helsinki

Neste artigo

Resumo

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O presente protocolo descreve um método para visualizar e medir anéis de actina e outros componentes do esqueleto periódico da membrana do segmento inicial do axônio usando neurônios hipocampais de ratos cultivados e microscopia de iluminação estruturada em 3D (3D-SIM).

Resumo

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O segmento inicial de axônio (AIS) é o local no qual os potenciais de ação iniciam e constituem um filtro de transporte e barreira de difusão que contribuem para a manutenção da polaridade neuronal através da triagem da carga somato-dendrítica. Um esqueleto periódico de membrana (MPS) composto por anéis periódicos de actina fornece um andaime para ancorar várias proteínas AIS, incluindo proteínas estruturais e diferentes canais de íons. Embora as recentes abordagens proteômicas tenham identificado um número considerável de novos componentes AIS, faltam detalhes da estrutura do MPS e dos papéis de seus componentes individuais. A distância entre anéis de actin individuais no MPS (~190 nm) requer a contratação de técnicas de microscopia de super resolução para resolver os detalhes estruturais do MPS. Este protocolo descreve um método para o uso de neurônios hipocampais de ratos cultivados para examinar a localização precisa de uma proteína AIS no MPS em relação aos anéis de actina sub-membranous usando microscopia de iluminação estruturada em 3D (3D-SIM). Além disso, também é descrita uma abordagem analítica para avaliar quantitivamente a periodicidade dos componentes individuais e sua posição em relação aos anéis de actina.

Introdução

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O segmento inicial de axônio (AIS) é uma região curta e exclusivamente especializada do axônio proximal de neurônios vertebrados1. A AIS compreende um filtro de transporte e uma barreira de difusão essencial na manutenção da polaridade neuronal, classificando a carga somato-dendrítica2,3,4,5,6,7. Além disso, a estrutura única da AIS permite acomodar clusters de canais de íons fechados de tensão que facilitam sua função como local de iniciação potenc....

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Protocolo

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Os neurônios hipocampais primários usados nesses experimentos foram colhidos16 a partir do dia 17 embriões de ratos Wistar de ambos os sexos sob as diretrizes éticas da Universidade de Helsinque e da lei finlandesa.

1. Preparação da amostra

  1. Em tampas de vidro de alta fidelidade, permitem que os neurônios hipocampais de ratos cresçam em condições de cultura esparsas (~5.000-10.000 células/cm2) por 14 dias (14 dias in vitro).
    NOTA: O uso de culturas esparsas reduz as chances de sobreposição de neurites, o que ajuda a quantificar o MPS.
  2. Fixar neurônios usando 4% de para....

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Resultados

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Usando neurônios hipocampais de ratos cultivados e 3D-SIM, um protocolo é descrito para visualizar e medir anéis de actina e outros componentes do MPS na AIS. Reconstruções de pilhas de imagens mostraram clara periodicidade dos anéis actin (Figura 2A). Em nossas mãos, a média de distância entre picos de anéis actin no MPS, visualizado usando alexa 488-tagged phalloidin, foi de 190,36 ± 1,7 nm (média ± SEM). Isso está em linha com a distância média relatada anteriormente de ~190 nm entre anéi.......

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Discussão

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O protocolo descrito aqui fornece um método para visualizar e medir proteínas MPS usando a técnica de super-resolução. Como os anéis de actin e outros componentes MPS exibem uma periodicidade de ~190 nm9,10, abordagens de imagem convencionais limitadas à difração não podem revelar os detalhes do MPS. Várias configurações de microscopia podem resolver estruturas limitadas à difração em super resolução, e o SIM representa uma opção robusta e descomplicada. É import.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Pirta Hotulainen é reconhecida por seus comentários críticos, inestimáveis para a preparação deste manuscrito. Dr. Rimante Minkeviciene é reconhecida por sua ajuda na preparação das culturas neuronais usadas para os experimentos originais. Todas as imagens foram realizadas na Unidade de Imagem do Biomedicum. Este trabalho foi apoiado pela Academia da Finlândia (D.M., SA 266351) e pelo Programa de Doutorado Brain & Mind (A.A.)

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placas de 24 poçosCorning3524
4% Paraformaldeído
Alexa-488 FaloidinaThermoFisherA12379
Alexa-647 anti-mouseThermoFisherA31571
Anticorpo anti-anquirina G UCDavis/NIH NeuroMab Facility, Clone 106/3675-146
Anti-MAP2 anticorpoMerck MilliporeAB5543
B-27Invitrogen17504044
Albumina de soro bovino (BSA)BioWestP6154
Deltavision OMX SRGE Healthcare Life SciencesN/A
Fiji pacote de softwareImageJ
GNU OctaveGNU
de alto desempenho lamínulasMarienfeld117530
Calculadora de óleo de imersãoCytiva Life Scienceshttps://tinyurl.com/ImmersionOilCalculator
L-GlutaminaVWRICNA1680149
MATLAB R2020aMathworks
Mídia neurobasalInvitrogen21103049
OMX SRDelta Vision OMX
PrimocinInvivoGenant-pm-1
ProLong GoldInvitrogenP10144
softWoRx DeconvolutionCytiva Life Sciences
Superfrost SlidesEprediaISO 8037/1
TetraSpeck microesferas 0.1 µ mThermoFisherT7279
Triton-XSigmaX100
Mídia de montagem

Referências

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  1. Leterrier, C. The Axon initial segment, 50 years later: A nexus for neuronal organization and function. Current Topics in Membranes. 77, 185-233 (2016).
  2. Leterrier, C., Dargent, B.

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Etiquetas

Membrane Periodic SkeletonAxon Initial SegmentStructured Illumination MicroscopyActin RingsSuper Resolution MicroscopyProtein ColocalizationHippocampal NeuronsFluorescence MicroscopyAnkyrin GPearson Correlation

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