Usando a microscopia de 2-fótons para quantificar os efeitos da obstrução ureteral unilateral crônica nos processos glomerulares

Compreender os processos glomerulares, especialmente a biologia dos podócitos, tem sido um objetivo há mais de 50 anos. Ratos Wistar de Munique com glomérulos de superfície têm desempenhado um papel central nesses estudos, incluindo estudos de micropunção, para compreender inúmeros aspectos dos processos fisiológicos e patológicos ^1,2,3. A utilização da microscopia para o estudo intravital dos componentes glomerulares foi limitada devido aos efeitos da fototoxicidade até o advento da microscopia de 2 fótons que minimizou essa exposição tóxica e aumentou a profundidade de penetração ^1,2. Juntamente com os rápidos avanços em hardware e software de computador, isso permitiu estudos tridimensionais (3D) e quadridimensionais (tempo) por horas em uma única configuração ^1,4,5.

A quantificação do fluxo sanguíneo capilar glomerular, vasoconstrição e dilatação em resposta a drogas, permeabilidade e os efeitos da carga sobre a permeabilidade e inflamação são apenas alguns dos processos glomerulares que têm sido estudados. Além disso, o segmento S1 do túbulo proximal é identificável, e as diferenças no comportamento do epitélio tubular S1 e S2 podem ser quantificadas ^1,4. Estudos em camundongos, especialmente com a disponibilidade universal de instalações transgênicas em camundongos, levaram a rápidos avanços na compreensão da biologia molecular dos processos de doenças glomerulares. Proteínas individuais são responsáveis pela disfunção glomerular em estudos knockout, principalmente no que diz respeito à proteinúria ^6,7,8. No entanto, a utilização de modelos de camundongos para exames de imagem glomerular tem sido limitada, pois os glomérulos estão mais de 100 μm abaixo da superfície nas numerosas cepas^estudadas9.

Isso levou os pesquisadores a desenvolver e utilizar modelos de camundongos, resultando em glomérulos de superfície que podem ser estudados. O modelo mais comum é o uso de UUO completo^10,11,12. Ao final do período prolongado de UUO, existem inúmeros glomérulos superficiais em rins de camundongos que podem ser e têm sido estudados^13,14. Não houve nenhum estudo de linha de base ou controle nesses estudos em camundongos para determinar os efeitos da UUO prolongada na biologia glomerular. Por se tratar de um modelo grave e prolongado de lesão, resultando em fibrose rápida e destruição cortical^10,11,12, levantamos a hipótese de que haveria efeitos sobre os processos e a função glomerular. Para responder a essa pergunta, ratos Munich Wistar Fromter (MWF) com glomérulos superficiais foram usados para estudar parâmetros de controle/basais, e o achado basal foi comparado com estudos glomerulares em ratos MWF após cinco semanas de UUO. Também estudamos ratos Sprague Dawley (SD) que não apresentam glomérulos superficiais após UUO. Os resultados indicam que 5 semanas de UUO em ratos MWF e SD de fato aumentam o número de glomérulos superficiais. No entanto, estes eram glomérulos anormais com alterações acentuadas no fluxo sanguíneo glomerular, inflamação e permeabilidade e tamanho das macromoléculas.

Todos os experimentos seguiram o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais da Escola de Medicina da Universidade de Indiana.

1. Preparação do rato Munich Wistar Frömter ou SD para a cirurgia UUO

1. Anestesiar o rato usando isofluorano (indução de 5%, 1,5-2,5% de manutenção), depois barbear, lavar e desinfetar a área cirúrgica várias vezes em um movimento circular com um esfoliante à base de iodo ou clorexidina e álcool. Aplicar analgésico de ação prolongada/liberação lenta para o manejo da dor, de acordo com as diretrizes institucionais da IACUC.
2. Faça uma incisão ao longo da linha média usando um bisturi; localizar o rim esquerdo e libertá-lo dos órgãos peritoneais circundantes.
3. Localize cuidadosamente o pedículo renal, que compreende a artéria renal, a veia renal e o ureter. Separe o ureter das outras estruturas, tomando precauções para não danificar a estrutura delicada.
4. Usando pinça fina, enrole cuidadosamente uma sutura 3-0 ao redor do ureter e amarre-a, tomando cuidado para não rasgá-la. Repita este procedimento alguns milímetros em ambos os lados do primeiro nó para amarrar um segundo nó e garantir a obstrução completa.
5. Uma vez que o procedimento é concluído, feche cuidadosamente as camadas musculares sucessivas. Antes de fechar a camada final, adicione 2 mL de solução salina quente e estéril a 0,9% no abdômen antes de fechá-lo completamente. Feche a pele externa com grampos cirúrgicos.
6. Aplicar analgésico de ação prolongada/liberação lenta para o controle da dor e observar a recuperação de perto de acordo com as diretrizes institucionais da IACUC. Monitore periodicamente depois disso e prepare-se para a imagem no final da quinta semana.

2. Síntese de albumina sérica de rato Texas Red (TR-RSA)

1. Pesar 100 mg de albumina sérica para ratos e dissolvê-la em 6,67 ml de tampão de bicarbonato de sódio 0,1 M a pH 8,4 num tubo cónico de 50 ml.
2. A um frasco para injetáveis de 5 mg de éster Texas Red-X-succinimidyl, adicione 100 μL de Dimetil Formamida (DMF, de alta qualidade) e vórtice até que todo o corante esteja dissolvido.
3. Coloque a solução de albumina sérica de rato em um vórtice em uma configuração baixa / média, de modo que o volume da solução esteja girando bem abaixo do topo do tubo aberto.
4. Adicione o corante dissolvido enquanto o tubo está sendo vórtice.
5. Pegue o tubo cônico de 50 mL, envolva-o em papel alumínio, coloque o tubo em qualquer balancim ou rolo e agite lentamente por 1 h à temperatura ambiente (RT).
6. Em um balde de 5 L de NaCl a 0,9% com uma barra de agitação sob agitação suave, molhe as membranas de um dialisador de corte de peso molecular adequado de 50 kDa (uma membrana com clipes, tubos de membrana fechados ou de diálise são todos adequados).
7. Carregue a solução TR-RSA no sistema de membrana e fixe-a aos acessórios de flotação normalmente incluídos no sistema. Colocar o recipiente de 5 L com a solução salina a 0,9% / TR-RSA durante a noite a 4 °C (em câmara fria) com agitação suave sobre uma placa de agitação. Altere a solução de diálise pelo menos três vezes ao longo das próximas 36 h.
8. O inchaço da membrana aumentará o volume da solução TR-RSA, agora clara. Divida os 100 mg originais pelo volume para obter uma concentração aproximada: a relação corante:proteína será de 1:1. Alicote em volumes adequados e liofilize para armazenamento a longo prazo.

3. Preparação para imagens intravitais de 2 fótons em microscópio invertido

1. Remova a tampa de um prato inferior de 50 mm (com diâmetro de deslizamento de cobertura de 40 mm) e coloque 8 pedaços de fita adesiva de autoclave no fundo interno ao lado da borda. Faça uma janela vazia em forma de pirâmide, usando 4 peças por lado para permitir que o rim exteriorizado se encaixe confortavelmente neste espaço, mantendo contato periférico com a fita de autoclave, ajudando assim a minimizar o movimento. Ajuste o espaçamento de acordo com o tamanho do rato para garantir o melhor contato com o rim.
2. Coloque 1 almofada térmica em cada lado do prato inferior de 50 mm de cobertura. Certifique-se de que a almofada de aquecimento cubra o palco.
3. Use uma objetiva de imersão em água de 40x com zoom de 0,75x e zoom de 1,5x para gerar imagens de 30x e 60x, respectivamente, permitindo imagens de ampliação mais baixa e superior. Se necessário, adicione água à objetiva usando uma seringa de 1 mL com um longo pedaço de tubo PE-200 que possa atingir o topo da objetiva em um ângulo descendente para evitar a queda de água na tubulação.
4. Use 2% de transmissividade a laser, com detectores azuis, verdes e vermelhos ajustados para níveis predeterminados para garantir a consistência nas imagens entre os estudos. Defina o comprimento de onda de excitação para 800 nm no laser referenciado (ver Tabela de Materiais), o que excitará eficientemente todos os fluoróforos utilizados neste estudo.
   1. Use detectores externos (não desenterrados) para coletar emissões azuis usando um tubo fotomultiplicador (PMT) (420-490 nm, ganho de 950).
   2. Use um detector de Hyd para capturar emissões verdes (500-550 nm, ganho de 100).
   3. Use um detector de Hyd para capturar emissões vermelhas (590-660 nm, ganho de 200).
   4. Ajuste o deslocamento no PMT (emissões azuis) para que apenas alguns pixels nas áreas em branco do tecido tenham um valor de zero.
      NOTA: Os detectores HyD para as emissões verdes e vermelhas têm ajuste automático de deslocamento; apenas o ganho pode ser definido.
   5. Defina a profundidade de bits como 12 bits para dar às imagens uma escala de intensidade de 4.096 entre preto e branco.
      NOTA: É necessário definir os limites inferiores dos detectores (deslocamento em PMT) para não excluir esses valores para garantir a coleta das emissões de baixa intensidade dentro do espaço de Bowman. Se a configuração de sensibilidade for muito baixa, os marcadores visuais de aviso indicarão isso; a esses valores é dado um valor de intensidade de zero.
5. Diluir aproximadamente 6 mg de albumina sérica Texas-Red-X-Rat até um volume total de 1 ml, carregar a solução numa seringa de 1 ml e colocar no cateter i.v de demora na etapa 4.1 após perfusão de Hoechst 33342 na etapa 9.1.

4. Preparação cirúrgica para imagens intravitais de 2 fótons

1. Coloque o rato pré-anestesiado com uma linha de acesso venoso de demora (femoral ou jugular) de lado com o flanco esquerdo raspado virado para cima plano e reto sobre a mesa. Certifique-se de que as patas dianteiras se tocam, assim como as patas traseiras.
2. Apalpar suavemente o flanco esquerdo logo abaixo das costelas para sentir o rim para determinar a posição natural no abdômen. Se necessário, desenhe uma linha usando um marcador permanente ao longo da área raspada, cortando o centro do rim em uma orientação nariz-cauda.
3. Usando um par de pinças dentadas, segure a pele e levante-a para cima para facilitar a compressão da linha de marcador permanente com um par de hemostatos para esmagar a vasculatura subjacente e evitar sangramento ao fazer a incisão com um par de tesouras cirúrgicas. Repita isso para a fina camada muscular externa para minimizar o sangramento.
4. Para fazer a incisão final da fina camada muscular abdominal interna, repalpar o rim para estimar o tamanho e a posição. Levante cuidadosamente a camada muscular interna com um par de pinças e esmague uma linha que corta a pele acima do rim com os hemostatos que é aproximadamente 1/3 do tamanho estimado^do rim.
5. Mantendo o aperto na camada muscular com a pinça, faça a incisão final.
   NOTA: É melhor fazer uma incisão menor e expandir conforme necessário do que torná-la muito grande, o que exigirá fechamento parcial com uma sutura.
6. Segure suavemente o rim pela gordura circundante. Usando ambas as mãos com fórceps em cada mão, trabalhe para segurar a gordura no polo inferior do rim usando uma técnica de mão sobre mão para segurar e segurar a gordura do rim, trabalhando para baixo.
7. Tendo um aperto firme na gordura no polo inferior do rim com uma mão, puxe suavemente a gordura e, se necessário, aperte muito suavemente o rim através da incisão. Se o rim não passar facilmente, amplie a incisão.

5. Posicionamento do rato para exames de imagem

1. Coloque cuidadosamente o rim exposto contra a borda do prato, com uma ligeira rotação para que o lado abdominal do rim esteja em contato com a tampa e o lado dorsal esteja voltado para longe da borda.
2. Para minimizar ainda mais o movimento, pegue duas almofadas de gaze estéreis 2 x 2, umedeça-as com solução salina e embale-as contra o lado dorsal do rim, reforçando o contato do lado abdominal do rim com a borda.
3. Olhe através da ocular do microscópio sob iluminação de epifluorescência usando um cubo Rhodamine/FITC de dupla passagem. Se o movimento for detectado, faça pequenos ajustes na posição e ajuste cuidadosamente a gaze, certificando-se de que ela não empurre sob o rim. Para reduzir ainda mais o movimento, role o rato um pouco, de modo que o tórax fique mais longe do prato.

6. Aquisição de imagens para análise quantitativa

1. Digitalize a superfície do rim usando iluminação de epifluorescência (passo 5.3) e marque a(s) posição(ões) dos glomérulos usando o software associado ao controlador de palco motorizado (uma característica dos sistemas modernos).
2. Para cada canal de cor sob iluminação de 2 fótons, pegue um volume 3D raso da parte superior de cada glomérulo marcado, que servirá como imagens de fundo. Use uma paleta de pseudocores na opção de exibição do software de imagem para visualizar melhor as intensidades fracas da fluorescência de fundo das alças capilares glomerulares.
3. Usando um vaso sanguíneo superficial como ponto focal, infundir lentamente a albumina fluorescente, permitindo tempo para observar o aumento e a queda da fluorescência devido à distribuição sistêmica. Infundir TR-RSA suficiente para atingir uma intensidade na vasculatura peritubular e alças capilares que esteja logo abaixo da saturação.
   NOTA: Normalmente há um atraso de 5 s entre a infusão de material e seu aparecimento na corrente sanguínea quando a perfusão renal é normal.
4. Aguarde aproximadamente 10 minutos antes de adquirir volumes 3D (intervalos de 1 μm) para todos os glomérulos marcados e fotografados a partir da etapa 6.2.
   NOTA: Os ratos Munich Wistar da Simonsen têm menos glomérulos de superfície. No entanto, como a cepa de Frömter de ratos MW tem um maior número de glomérulos superficiais, até 10 glomérulos podem ser frequentemente fotografados.
5. Eutanasiar o rato através de uma sobredosagem de isoflurano no final do estudo. Realizar uma pneumotoracotomia dupla para garantir a eutanásia.

7. Cálculo da permeabilidade glomerular

1. Usando o software de visualização de imagens associado ao sistema de microscópio, exporte as imagens para imagens brutas de 12 bits para processamento e análise.
2. Carregue os volumes 3D de fundo e o volume 3D bruto que contém a albumina fluorescente circulante. Localize o plano focal no volume 3D com o laço capilar superficial mais brilhante nos glomérulos com espaço suficiente para a borda da cápsula de Bowman circundante.
3. Usando pontos de referência visuais, localize o mesmo plano focal encontrado no volume de fundo. Selecione uma região na alça capilar e uma dentro do espaço de Bowman observando os valores médios de intensidade de cada uma. Use esses valores de intensidade como valores de plano de fundo.
4. Delineie uma região (pelo menos 20 x 20 pixels de área) dentro do espaço de Bowman na imagem contendo albumina e observe a leitura de intensidade (selecione uma área que não seja adjacente a um laço capilar ou à cápsula de Bowman para garantir a medição mais limpa das intensidades espaciais de Bowman). Mova a região desenhada sobre duas outras regiões para obter um valor médio para a intensidade média dentro do Espaço de Bowman.
5. Selecione a intensidade fluorescente de plasma mais brilhante dentro da seção da alça capilar e circule essa região. Usando a função limiar , realce os valores brilhantes (geralmente localizados nas bordas das paredes do laço capilar), evite sombras RBC circulantes e registre o valor.
   NOTA: Como os fatores dentro do sangue causarão uma subestimação dos níveis de fluorescência plasmática, é importante selecionar as áreas mais brilhantes.
6. Insira os valores em uma planilha para calcular o GSC usando Eq (1):
   GSC = (1)

8. Cálculo do fluxo de glóbulos vermelhos em alças capilares glomerulares superficiais e vasculatura renal usando uma função de linhagem

1. Encontre um vaso apropriado (uma alça capilar ou um vaso peritubular). Como a função de lata de linhas no software de aquisição de imagem referenciada (consulte a Tabela de Materiais) requer que o recipiente seja perpendicular, gire a imagem usando a função girar .
2. Uma vez que o recipiente esteja girado e deitado plano, selecione a função XT no menu de aquisição . Configure para digitalizar 4.000 linhas. Colocar a linha transversal ao navio a examinar; Certifique-se de que o plano focal esteja no diâmetro máximo do segmento a ser fotografado.
3. Clique com o botão esquerdo do mouse na imagem composta colorida e selecione Tirar instantâneo para gerar uma imagem de referência da área onde a varredura de linhas foi tirada. Clique imediatamente no botão Iniciar para capturar a varredura de linhas da embarcação.
4. Para determinar a taxa de fluxo RBC, importe os linescans para o software de processamento de imagem (consulte a Tabela de Materiais). Abra a caixa de diálogo Mostrar Estatísticas de Região no menu suspenso Medida . Selecione a ferramenta de desenho de linha única e desenhe uma linha que corresponda à inclinação das sombras do RBC. Observe os valores de largura e altura.
   NOTA: Os valores de pixel obtidos para largura corresponderão à distância; os pixels para a altura correspondem ao tempo.
5. Use a seguinte fórmula (Eq (2)) para calcular a velocidade.
   Vazão de hemácias em μm/s = (2)
   NOTA: Isso corresponde aos parâmetros de aquisição com ampliação de 60x e uma taxa de varredura de 400 Hz com o microscópio referenciado (consulte a Tabela de Materiais).
   1. Faça pelo menos cinco cálculos e faça a média deles para relatar a velocidade de cada linha.
      NOTA: Estes parâmetros dependerão da dimensão dos pixels e da velocidade de aquisição do sistema de microscópio.

9. Cálculo da oclusão leucocitária em alças capilares glomerulares

1. Administrar a mancha nuclear Hoechst 33342 (a ~8 μg/kg de peso do rato) através de uma linha de acesso venoso de demora para identificar os leucócitos alojados nas alças capilares.
   NOTA: A profundidade utilizável será limitada devido à dispersão de fótons e absorção pela hemoglobina, especialmente para emissões azuis de comprimento de onda mais curto.
2. Centralize um glomérulo no campo de imagem e pegue um conjunto de dados 3D começando na superfície glomerular e termine os dados em pelo menos 30 a 35 μm. Use um tamanho de passo de 1 μm na direção Z.
3. Identifique os leucócitos comparando o canal azul da Hoechst com o canal de albumina Texas Red; procure a exclusão de corante vermelho na alça capilar e uma mancha nuclear correspondente para identificar positivamente os leucócitos. Defina os glóbulos brancos como "aderidos" se eles parecerem estáticos em 3 seções ópticas. Relate os valores como ocorrência/10 seções ópticas do topo do glomérulo, tomadas em intervalos de 1 μm.

10. Pontuando a presença de formações de Rouleaux em glomérulos superficiais

1. Siga as mesmas instruções para a etapa 9.3 e adquira um conjunto de dados 3D. Procure por formações de Rouleaux que aparecem como hemácias empilhadas em pacotes que resistem à dissociação à medida que se movem ao longo dos laços capilares. Use um fluoróforo vermelho para melhor visualização da estrutura em maiores profundidades devido à menor dispersão de fótons para as emissões vermelhas de comprimento de onda mais longo. Relate os valores como ocorrência/25 seções ópticas do topo do glomérulo, tomadas em intervalos de 1 μm.

11. Isolamento dos glomérulos

1. Isolar três grupos de glomérulos de rins frescos usando uma técnica de peneiramento padrão que resulta em cerca de 90% de pureza de glomérulos de ratos¹⁵.
   1. Coloque o córtex renal em solução salina tamponada com fosfato frio (PBS) e pice-o usando várias tesouras finas ou lâminas de barbear.
   2. Adicione o tecido picado a um filtro de células estéreis de 100 μm e empurre-o suavemente usando um êmbolo de seringa de 5 mL e 50-100 mL de PBS frio.
      NOTA: A maioria dos túbulos são retidos enquanto os glomérulos passam.
   3. Coloque a fração de glomérulos enriquecida em um filtro de 70 μm e lave-os extensivamente com PBS frio. Lave o filtro com 100-200 mL de PBS frio para remover a maioria dos túbulos restantes.
   4. Recolher os glomérulos do filtro utilizando 1-2 ml de PBS frio, centrifugar (10.000 × g, 2 min, 4 °C) e congelá-los em azoto líquido até ao isolamento de ARN.
      NOTA: A pureza glomerular determinada por microscopia de contraste de fase é de >90%, e o rendimento é de aproximadamente 10 mg de 2 rins.

12. Isolamento do RNA glomerular

1. Homogeneizar o pellet de glomérulos congelados utilizando o reagente de isolamento de RNA adicionando 400 μL do reagente e quebrando o pellet usando uma ponta de pipeta de 200 μL, seguida de breve vórtice e 5 min de incubação no RT¹⁶.
2. Adicione 40 μL de 1-bromo-3-cloropropano (BCP), vórtice por 15 s e segure em RT por 15 min.
3. Centrífuga a 12.000 × g, 15 min, 4 °C. Remova a camada aquosa, dilua a camada inferior com um volume igual de etanol a 70% e carregue-a diretamente em uma coluna de rotação (consulte a Tabela de Materiais).
4. Após as lavagens, cada uma consistindo em adicionar a respectiva solução à coluna seguida de centrifugação a 12.000 x g, 15 s, 26 °C [3 total, primeiros 2 com 500 μL de RPE (tampão de lavagem suave patenteado com etanol para remover vestígios de sais,^3ª lavagem com 500 μL de 80% de EtOH], eluir o RNA pela adição de 15 μL de H₂ O e centrífuga, quanto às lavagens. Verificar a concentração e a pureza do RNA e transportar as amostras de RNA para a instalação central para análise de nanocordas^17,18.
   NOTA: O rendimento total de RNA é de aproximadamente 1-2 μg. Aqui, as 24 amostras continham 200 ng de RNA a 30 ng/μL.

13. Análise de nanocordas

NOTA: A tecnologia de nanocordas é baseada na detecção digital e no código de barras molecular direto de moléculas-alvo que utilizam pares de sondas codificados por cores. A sonda Capture carrega uma porção de biotina na extremidade 3', e a sonda Reporter carrega o sinal em sua extremidade 5'.

1. Envie os pares de sondas de genes Nanostring e CodeSets para a Genomic Core Facility do Estado de Michigan e use conforme indicado pela NanoString.
   NOTA: Existem seis posições para os códigos de cores, e cada posição pode ser uma das quatro cores, permitindo uma grande diversidade de tags que podem ser resolvidas e identificadas individualmente durante a coleta de dados.
2. Obtenha os dados coletados pela equipe da instalação do Genomic Core usando o analisador proprietário Nanostring nCounter Digital, que coleta campos de visão usando uma objetiva de microscópio e câmera CCD e tabula e exibe as contagens de código de barras.
3. Importe os dados brutos para o software nSolver da Nanostring para análise. Normalize os dados normalizados usando suas configurações padrão e compare os dados entre os grupos, conforme descrito em seu manual.
   NOTA: O objetivo foi monitorar as alterações genéticas previamente comprovadas como alteradas no tecido cortical a partir de uma UUO modelo¹⁹, doença renal 17,20,21,22,23,24,25,26. Um total de 126 genes, incluindo os controles positivos e negativos recomendados, foram analisados em cada grupo de glomérulos (CONT, SHAM & UUO).

Três grupos de glomérulos foram isolados utilizando uma técnica de peneiramento padrão que resulta em cerca de 90% de pureza dos glomérulos de ratos15. O primeiro grupo de glomérulos foi do rim esquerdo de ratos SD que foram submetidos a um grampo ureter renal esquerdo por 5 semanas, UUO (5 machos, 3 fêmeas). O segundo grupo glomérulos foi isolado do rim controle contralateral do mesmo rato, CONT (5 machos, 3 fêmeas). O terceiro grupo de glomérulos foi isolado de ratos SD submetidos à cirurgia de SHAM, e o rim esquerdo foi utilizado para isolamento de glomérulos após 5 semanas, SHAM (4 machos, 4 fêmeas).

Alterações morfológicas
A externalização do rim obstruído para exames de imagem revelou um rim grosseiramente aumentado, aproximadamente quatro vezes o tamanho normal, com epitélios finos visíveis através do interior do rim cheio de líquido. Através de um objetivo de 20x, usando iluminação de epifluorescência e um cubo de passagem dupla FITC/Rodamina, a mudança mais aparente foi o afinamento do epitélio tubular e o colapso uniforme dos lúmens tubulares ao longo de todo o comprimento tubular. A histologia tem sido bem descrita e é grave por uma semana de UUO10,11,12. O número de glomérulos visíveis na superfície em ratos MWF e SD aumentou após cinco semanas de obstrução unilateral do ureter. A Figura 1A mostra o método usado para criar o modelo UUO. O rim direito é intocado e fornece uma taxa de filtração glomerular adequada para o rato. O número de glomérulos por campo utilizando um objetivo de 20x (363 μm x 363 μm) foi contado e mostrado em um gráfico na Figura 1B. O número de glomérulos superficiais em ratos MWF aumentou de 1,08 ± 0,11/campo em ratos não tratados para 2,97 ± 0,65/campo no grupo UUO de cinco semanas. Os ratos SD passaram de não ter glomérulos superficiais para 2,02 ± 0,37/campo após 5 semanas de UUO.

Foram obtidas imagens intravitais de 2 fótons destes ratos após injeção com TR-RSA (vermelho), um dextran Cascade Blue de 10 kDa (10 kDa-CB) e Hoechst 33342 para marcar os núcleos (ciano). Estes são mostrados para ratos MWF normais (Figura 1C), ratos MWF após cinco semanas de UUO (Figura 1D) e ratos SD após cinco semanas de UUO (Figura 1E). Essas imagens destacam alterações dramáticas que ocorrem no epitélio tubular. Os lisossomos dos túbulos proximais, que normalmente são pequenos acúmulos puntiformes de cor laranja em ratos MWF e SD não tratados, tornam-se grandes estruturas vacuolares singulares que preenchem a maioria da célula tubular encolhida. Conforme descrito pela albumina TR-RSA, a vasculatura apareceu endireitada e, em muitos vasos, desprovida de hemácias fluidas, mostrando apenas plasma em fluxo. A fixação dos rins revelou que o córtex havia se diluído em uma pele fibrosa não mais espessa do que um milímetro. Essas observações estão de acordo com a literatura inicial que utiliza esse modelo 3,10,11,12.

Alterações na dinâmica vascular renal e permeabilidade glomerular
O fluxo sanguíneo renal foi significativamente reduzido nos grupos MWF e SD de UUO de cinco semanas em comparação com ratos não tratados (Figura 2). Ratos MWF operados por simulação apresentaram vazão peritubular de 885 ± 25 μm/s. O fluxo de hemácias peritubulares em ratos UUO MWF e SD de cinco semanas diminuiu para 250 ± 100 μm/s e 200 ± 125 μm/s, respectivamente. Esses valores foram calculados coletando varreduras de linha em vasos peritubulares para calcular a velocidade dos eritrócitos. A Figura 2D mostra um gráfico desses dados.

A velocidade dos eritrócitos dentro das alças capilares glomerulares foi significativamente diminuída nos ratos MWF e SD UUO de cinco semanas em comparação com MWF não tratados (Figura 3). Em muitos casos, verificou-se que os glomérulos tinham alças capilares completamente desprovidas de hemácias de fluxo. As taxas de fluxo de hemácias de alça capilar foram de 1.405 ± 425 μm/s, 250 ± 220 μm/s ± e 190 ± 200 μm/s ou MWF não tratados, MWF UUO de cinco semanas e ratos SD UUO de cinco semanas, respectivamente (Figura 3D). Dentro das alças capilares dos grupos UUO de cinco semanas, o fluxo lento dos eritrócitos revelou a presença de leucócitos aderentes, retardando o fluxo ou bloqueando-o, com apenas o fluxo plasmático visualizado a jusante da obstrução parcial ou total. Para quantificar essa observação, o número de leucócitos aderentes encontrados em um volume 3D foi contado e, em seguida, normalizado para ocorrência a cada 10 μm de profundidade de volume 3D. A estrutura do glóbulo branco aderido pôde ser discernida usando a fluorescência do corante nuclear ciano de Hoechst 33342. Infelizmente, a maior dispersão de fótons de luzes emissoras de azul limitou a identificação confiável de leucócitos por seus núcleos às 10 seções ópticas superiores do topo, tomadas a 1μm de passos de volume glomerular. Ratos MWF não tratados tiveram menos de 0,125 ± 0,05 leucócitos / 10 seções ópticas do topo, tomadas a 1 μm de volume de passos, enquanto esse número aumentou para 1,5 ± 0,5 e 3,25 ± 0,7 em ratos UUO MWF de 5 semanas e UUO SD de 5 semanas, respectivamente (Figura 3E).

Outra alteração vascular que também pode explicar a redução do fluxo de hemácias nos grupos UUO de 5 semanas foi o aparecimento regular de formações de Rouleaux (hemácias agrupadas que são aderidas em uma configuração de "moeda empilhada", ver inserção da Figura 3F). As formações de Rouleaux fluem mais lentamente e podem ser interrompidas por um leucócitos aderentes. Ratos WMF não tratados praticamente não têm formações de Rouleaux em seus capilares glomerulares, tendo apenas 0,05 ± 0,05 ocorrências por 25 seções ópticas do topo, tomadas a passos de 1 μm. Os ratos UUO MWF e SD de cinco semanas tiveram um aumento acentuado nas formações de Rouleaux de 2,27 ± 0,46 e 1,46 ± 0,73 por 25 seções ópticas a partir do topo, tomadas a passos de 1 μm, respectivamente (Figura 3F).

Além da redução nas taxas de fluxo de hemácias glomerulares observada com UUO, observou-se um aumento na permeabilidade à albumina. Houve maior heterogeneidade na permeabilidade à albumina entre os glomérulos. Ocasionalmente, o acúmulo de albumina dentro do Espaço de Bowman era intenso o suficiente para ser claramente visto (Figura 4B, asterisco). O coeficiente de peneiramento glomerular da albumina aumentou de 0,015 ± 0,002 em MWFs não tratados, para 0,045 ± 0,05 em MWF UUO de 5 semanas e 0,052 ± 0,075 em ratos UUO SD de cinco semanas.

Função do túbulo proximal alterada
Curiosamente, a albumina filtrada não pôde ser detectada em células do túbulo proximal após UUO. O segmento S1 normalmente endocitosa grandes quantidades de albumina27,28,29,30, como mostrado aqui em condições fisiológicas em ratos MWF não tratados (Figura 5A). Essa mesma captação não pôde ser observada no MWF ou DP PT após 5 semanas de UUO (Figura 5B,C). Os túbulos proximais ao redor dos glomérulos fotografados entre 45 e 60 min após a infusão de TR-RSA foram pontuados para presença (1) ou ausência (0) de albumina. É importante notar que, em condições fisiológicas, o segmento S1 se liga avidamente e internaliza a albumina com pouca ou nenhuma albumina atingindo os túbulos distais ou ductos coletores. Portanto, é lógico que os últimos segmentos dos túbulos proximais podem não conter albumina, resultando em uma positividade fracionada para a captação de albumina inferior a 1,0. A Figura 5D mostra um gráfico com os resultados da pontuação da captação de albumina dos túbulos proximais. O MWF não tratado apresentou um valor de captação fracionada dos túbulos proximais de 0,556 ± 0,126. Tanto os ratos UUO MWF e SD de cinco semanas apresentaram valores significativamente menores de 0,049 ± 0,126 e 0,00 ±0,00, respectivamente.

Os estudos também foram concluídos em ratos UUO MWF de 12 semanas (Tabela 1). Doze semanas de UUO é o tempo padrão usado para estudos em camundongos para induzir glomérulos superficiais. Três ratos machos UUO foram fotografados, e a densidade glomerular aumentou ainda mais para 6,16 ± 1,83 glomérulos por campo 20x nesses ratos. A vazão dos eritrócitos foi de 293 ± 67 μm/s, a adesão leucocitária foi de 1,47 ± 1,12, ambos semelhantes aos dados de UUO de 5 semanas. O GSC da albumina também aumentou em comparação com os ratos UUO de 5 semanas para 0,109 ± 0,04.

Alterações glomerulares do RNAm induzidas pela UUO crônica
A Tabela 2 mostra todos os genes (sondas) com seus valores de expressão agrupada e desvio padrão. Nota, os genes foram selecionados para análise com base em documentação prévia de alteração na doença renal, incluindo UUO conforme descrito na nota da seção 13 do protocolo. A Figura 6 é um mapa de calor dos dados que destaca as mudanças dramáticas na expressão gênica para a maioria dos genes nos glomérulos UUO em comparação com os glomérulos de controle ou simulados.

Figura 1: Aumento do número de glomérulos superficiais e indução de glomérulos superficiais em ratos SD após UUO de 5 semanas em ratos MWF. (A) Diagrama cirúrgico do ureter no rim esquerdo cuidadosamente liberado da artéria e veia renal antes de ser ocluído com duas amarras usando sutura cirúrgica. (B) Um gráfico indicando o aumento do número de glomérulos de superfície presentes em ratos MWF antes e cinco semanas após a UUO, juntamente com o número de glomérulos de superfície em ratos SD, que normalmente não têm glomérulos de superfície. O número de glomérulos superficiais em ratos MWF aumentou de 1,08 ± 0,11/campo em ratos não tratados para 2,97 ± 0,65/campo no grupo UUO de 5 semanas. Os ratos SD passaram de não ter glomérulos de superfície para 2,02 ± 0,37/campo. Imagens tridimensionais reconstruídas mostram a superfície renal para MWF (C), MWF após UUO (D) de 5 semanas e DP após UUO (E) de cinco semanas. Observe o aparecimento de grandes estruturas vacuolares alaranjadas que se fundiram de pequenos lisossomos individuais em grandes corpos anormais. A UUO de 5 semanas em ratos SD não resultou em áreas semelhantes a epitélios tubulares normais observados em C e parcialmente em D. A vasculatura apareceu endireitada em algumas regiões e, em muitas, teve oclusões parciais que permitiram o fluxo plasmático, mas não eritrocitários. (n = 3 ratos machos por grupo) Barras de escala = 40 μm. As barras de erro indicam desvio padrão. Abreviaturas: UUO = obstrução ureteral unilateral; DP = Sprague-Dawley; MWF = Munique Wistar Frömter; G = glomérulo; RBCs = glóbulos vermelhos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Redução do fluxo eritrocitário dentro da vasculatura peritubular superficial após UUO de 5 semanas. Linescans foram coletados em vasos sanguíneos peritubulares para determinar a velocidade de fluxo de hemácias em μm/s. Resumidamente, as linhas de referência vermelhas mostradas em A, B e C representam uma pequena região na qual a mesma área de pixel de largura foi digitalizada repetidamente, e as imagens empilhadas em uma coluna para visualizar a distorção causada pelas hemácias que fluem, que viajam mais rápido do que o microscópio pode adquiri-las. A coluna adjacente à figura de referência é o linecan, com a inclinação da distorção RBC sendo usada para calcular a velocidade (eixo x = distância e eixo y = tempo). Aqui, as inclinações progressivamente mais íngremes correspondem a velocidades mais lentas de RBC, pois permanecem mais longas na região de linhas. Observe a diferença na aparência dos eritrócitos em ratos MWF não tratados (A) em comparação com as imagens UUO de cinco semanas para os ratos MWF (B) e SD (C). As velocidades de fluxo de hemácias para os três grupos de ratos são mostradas em D. O fluxo de hemácias peritubulares em MWFs não tratados foi em média de 885 ± μm/s. Esses valores caíram significativamente cinco semanas após a UUO em ratos MWF e SD para 250 ± 100 μm/s e 200 ± 125 μm/s, respectivamente. Barra de escala = 20 μm, n = 3 ratos machos por grupo. As barras de erro indicam desvio padrão. Abreviaturas: UUO = obstrução ureteral unilateral; DP = Sprague-Dawley; MWF = Munique Wistar Frömter; RBC = hemácias; leucócitos = glóbulo branco. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Redução significativa do fluxo de hemácias da alça capilar glomerular e ativação induzida da adesão leucocitária por UUO de 5 semanas. A mesma abordagem de linhagem utilizada para determinar o fluxo eritrocitário peritubular foi utilizada para investigar alterações no fluxo sanguíneo capilar glomerular. Os painéis A, B e C mostram um layout semelhante à Figura 2 e se concentram em um glomérulo em MWF operados por simulação, MWF UUO de cinco semanas e SDs UUO de cinco semanas, respectivamente. (D) Um gráfico revelando a taxa de fluxo de hemácias fisiologicamente alta nas alças capilares de ratos MWF operados por simulação com média de 1.405 ± 425 μm/s ± 425, diminuiu para 250 ± 220 μm/s e 190 ± 200 μm/s para os ratos UUO MWF de 5 semanas e UUO SD de 5 semanas, respectivamente. Ao examinar as alças capilares glomerulares, os leucócitos aderentes foram prontamente visíveis durante a focalização através do glomérulo. Cortes ópticos tridimensionais de glomérulos individuais foram tomados e as primeiras 10 seções ópticas, separadas por 1 μm, foram usadas para medir o número de leucócitos aderentes. Ratos MWF não tratados praticamente não tinham leucócitos visíveis em seus volumes, com média inferior a 0,125 ± 0,05 leucócitos / 10 seções ópticas do topo, tomadas a passos de 1μm. Em ratos UUO MWF e SD de 5 semanas, esses números aumentaram para 1,5 ± 0,5 e 3,25 ± 0,7 WBCs/10 seções ópticas do topo, tomadas a passos de 1 μm, respectivamente. Esses resultados são mostrados no gráfico no painel E, com inserções coloridas mostrando leucócitos ocluindo alças capilares. As formações de Rouleaux (setas, inseridas no painel F) aparecem como hemácias firmemente unidas em uma configuração de "moeda empilhada" que em grande parte retém seu agrupamento agrupado mesmo na turbulência do fluxo sanguíneo. Essas estruturas patológicas eram facilmente discerníveis em maiores profundidades dentro do glomérulo. Ratos MWF operados por simulação eram em grande parte desprovidos dessas estruturas, tendo apenas 0,05 ± 0,05 ocorrências 25 seções ópticas do topo, tomadas a 1 μm de passos de volume glomerular. Em contraste, o UUO de 5 semanas em ratos MWF e SD teve um aumento acentuado nas formações de Rouleaux com ocorrências de 2,27± 0,46 e 1,46 ± seções ópticas de 0,73/25 do topo, tomadas a passos de 1 μm, respectivamente. Barras de escala= 20 μm, n = 3 ratos machos por grupo. As barras de erro indicam desvio padrão. Abreviaturas: UUO = obstrução ureteral unilateral; DP = Sprague-Dawley; MWF = Munique Wistar Frömter; RBC = hemácias; leucócitos = glóbulo branco. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Aumento significativo da permeabilidade da albumina capilar glomerular após UUO de 5 semanas. Os painéis A, B e C mostram imagens pseudocoloridas de um volume 3D para o canal de albumina sérica de ratos em MWF não tratados, MWF UUO de 5 semanas e UUO SD de cinco semanas, respectivamente. As imagens são apresentadas em uma paleta de pseudocores para destacar a quantidade apreciável de albumina filtrada vista no espaço de Bowman, particularmente no painel B (asterisco). (A) O espaço de Bowman (asterisco) mostra o nível normal de albumina tipicamente observado em ratos MWF não tratados, indiscernível aos olhos. Imagens de glomérulos foram tiradas antes da infusão de albumina para subtrair os valores de fluorescência de fundo daqueles obtidos após a administração de albumina. (D) Gráfico com o coeficiente de peneiramento glomerular para albumina em ratos MWF não tratados, com valor de 0,015 ± 0,002. Este valor aumentou significativamente para 0,045± 0,05 em ratos UUO MWF de 5 semanas e 0,052 ± 0,075 em ratos UUO SD de cinco semanas. Este parâmetro é um valor raciociado de intensidades fluorescentes do Espaço de Bowman dividido pelo valor do plasma e não tem unidade de medida associada. Barra de escala = 20 μm, n = 3 ratos machos por grupo. A escala de intensidade de pseudocores está localizada abaixo do painel D. As barras de erro indicam desvio padrão. Abreviaturas: UUO = obstrução ureteral unilateral; DP = Sprague-Dawley; MWF = Munique Wistar Frömter; RBC = hemácias; leucócitos = glóbulo branco. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Função reduzida nos túbulos proximais após UUO de 5 semanas. (A) Uma imagem de um glomérulo superficial e do segmento S1 de um rato Munich Wistar Frömter normal tirada 40 min após a infusão de TR-RSA e Cascade Blue dextran. A internalização do TR-RSA pode ser observada no segmento S1 e no túbulo proximal. Em contraste, ratos MWF (B) e ratos SD (C), submetidos a UUO de 5 semanas, apresentam túbulos proximais severamente alterados com captação mínima ou nenhuma de TR-RSA. Os lisossomos autofluorescentes (A) normalmente pequenos e pontuados tornam-se estruturas amarelo-alaranjadas grandes e vacuolares, muitas vezes com um colapso completo do lúmen tubular, que não pode ser encontrado nos conjuntos de dados tridimensionais. (C) Os túbulos distais normalmente desprovidos de qualquer forma de autofluorescência agora contêm acumulações autofluorescentes. A pontuação dos túbulos proximais ao redor dos glomérulos em imagens semelhantes tiradas 45-60 min após a infusão, para a captação de albumina, mostrou uma diferença significativa entre o grupo MWF operado por simulação e ambos os grupos UUO de 5 semanas. Ratos MWF não tratados tiveram um valor de captação fracionada do túbulo proximal de 0,556 ± 0,126. Tanto os ratos UUO MWF e SD de cinco semanas apresentaram valores significativamente menores de 0,049 ± 0,126 e 0,00 ±0,00, respectivamente. Barra de escala= 20 μm, n = 3 ratos machos por grupo. As barras de erro indicam desvio padrão. Abreviaturas: UUO = obstrução ureteral unilateral; DP = Sprague-Dawley; MWF = Munique Wistar Frömter; RBC = hemácias; leucócitos = glóbulo branco; TR-RSA = Albumina sérica de rato vermelho texano. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Alterações da expressão gênica com UUO . (A) Um mapa de calor dos dados. (B) Alterações genéticas normalizadas para todos os dados em um gráfico de dispersão. A expressão de genes nos rins de controle foi plotada de baixa a alta expressão, e os genes dos rins SHAM e UUO foram comparados com os níveis de expressão de controle. Os pontos de dados genéticos que se aproximam do valor diagonal dos genes de controle indicam níveis de expressão semelhantes para ambos os grupos, enquanto os pontos de dados acima ou abaixo da diagonal indicam níveis de expressão mais altos ou mais baixos, respectivamente. Observe que os genes SHAM se agrupam mais próximos da expressão diagonal de controle do que os genes UUO, que são mais variáveis. Abreviação: UUO = obstrução ureteral unilateral. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Progressão da lesão de 5 a 12 semanas de UUO. Comparação dos parâmetros de imagem UUO de 5 e 12 semanas em três ratos MWF machos e três ratos machos SD em cada ponto de tempo. Os dados de cinco semanas são os mesmos dos números anteriores. Observe o aumento da densidade glomerular e o GSC para albumina com UUO contínuo. Abreviaturas: UUO = obstrução ureteral unilateral; DP = Sprague-Dawley; MWF = Munique Wistar Frömter; GSC = coeficiente de peneiramento glomerular. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 2: Análise dos marcadores de inflamação em glomérulos de UUO e ratos controle. Pares de sondas de genes e CodeSets foram projetados e usados conforme indicado pela NanoString. Mais de 100 genes foram analisados, além de controles positivos e negativos, conforme especificado pelo Nanostring. Todos os genes (sondas) com sua expressão agrupada e valores de DP são mostrados na tabela. A Figura 6A é um mapa de calor dos dados, enquanto a Figura 6B apresenta as alterações genéticas para todos os dados em um gráfico de dispersão. Observe as semelhanças entre os controles e o SHAM e as mudanças distintas para a maioria dos genes no UUO. Abreviaturas: UUO = obstrução ureteral unilateral; DP = desvio padrão. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Os autores não têm conflitos de interesse.