Encapsulamento rápido do Citoesqueleto Reconstituído Dentro de Vesículos Unilamellar Gigantes

Os compartimentos de bicamadas lipídicas são usados como modelo de células sintéticas para estudar reações orgânicas fechadas e processos baseados em membrana ou como módulos portadores em aplicações de entrega de medicamentos ^1,2. A biologia de baixo para cima com componentes purificados requer sistemas experimentais mínimos para explorar propriedades e interações entre biomoléculas, como proteínas e lipídios ^3,4. No entanto, com o avanço do campo, há uma necessidade aumentada de sistemas experimentais mais complexos que imitem melhor as condições nas células biológicas. Encapsulamento em GUVs é uma abordagem prática que pode oferecer algumas dessas propriedades semelhantes a células, fornecendo uma bicamada lipídica deformável e seletivamente permeável e um espaço de reação confinado. Em particular, a reconstituição in vitro de sistemas citoesqueléticos, como modelos de células sintéticas, pode beneficiar da encapsulamento nos compartimentos^{de membrana 5}. Muitas proteínas citoesqueléticas se ligam e interagem com a membrana celular. Como a maioria dos conjuntos citoesqueléticos formam estruturas que abrangem toda a célula, sua forma é naturalmente determinada pelo confinamento do tamanho de^{células 6}.

Diferentes métodos são utilizados para gerar GUVs, como o inchaço ^7,8, pequena fusão vesícula ^9,10, transferência de emulsão^11,12, hastil¹³ pulsado e outras abordagens microfluidas^14,15. Embora esses métodos ainda sejam utilizados, cada um tem suas limitações. Assim, uma abordagem robusta e direta com alto rendimento de encapsulamento guv é altamente desejável. Embora técnicas como inchaço espontâneo e eletroswelling sejam amplamente adotadas para a formação de GUVs, esses métodos são principalmente compatíveis com composições lipídicas específicas¹⁶, tampões de baixa concentração de sal¹⁷, menor tamanho molecular encapsulante¹⁸, e requerem um alto volume do encapsulante. A fusão de múltiplas pequenas vesículas em um GUV é inerentemente energeticamente desfavorável, exigindo assim especificidade em composições lipídicas carregadas⁹ e/ou agentes indutores de fusão externos, como peptídeos¹⁹ ou outros produtos químicos. A transferência de emulsão e os métodos microfluidos, por outro lado, podem exigir estabilização de gotículas através da remoção de surfactante e solvente após a formação de bicamadas, respectivamente^18,20. A complexidade da configuração experimental e do dispositivo em técnicas microfluidas, como o haseamento pulsado, impõem um desafio adicional²¹. cDICE é um método baseado em emulsão derivado de princípios semelhantes que regem a transferência de emulsão^22,23. Uma solução aquosa (solução externa) e uma mistura lipídica-óleo são estratificadas por forças centrífugas em uma câmara cilíndrica rotativa (câmara cDICE) formando uma interface saturada lipídica. Fechar gotículas aquosas lipídicas na câmara cDICE rotativa resulta em zipping de um bicamado enquanto gotículas cruzam a interface lipídica-saturada na solução aquosa externa^22,24. A abordagem cDICE é uma técnica robusta para encapsulamento guv. Com o método modificado apresentado, não apenas o alto rendimento de vesícula típico para cDICE com um tempo de encapsulamento significativamente menor (alguns segundos) é alcançado, mas o tempo de geração de GUV que permite a observação de processos dependentes do tempo (por exemplo, formação de rede citosqueletal actin) é significativamente reduzido. O protocolo leva cerca de 15-20 minutos desde o início até a coleta e imagem do GUV. Aqui, a geração de GUV é descrita usando o método cDICE modificado para encapsular actina e proteínas de ligação de actina (ABPs). No entanto, a técnica apresentada é aplicável para encapsular uma ampla gama de reações biológicas e interações de membrana, desde a montagem de biopolímeros até a expressão proteica livre de células até a transferência de carga baseada em fusão de membrana.

1. Preparação de mistura óleo-lipídida

NOTA: A etapa precisa ser realizada em um capô de fumaça seguindo todas as diretrizes de segurança para o manuseio do clorofórmio.

1. Tome 0,5 mL de clorofórmio em um frasco de vidro de 15 mL. Adicione 88 μL de 25 mg/mL dioleoyl-fosfocholina (DOPC), 9,3 μL de colesterol de 50 mg/mL, e 5 μL de 1 mg/mL dioleoyl-phosphoethanolamina-lissamina rhodamina B (rhodamina PE) (ver Tabela de Materiais) no frasco de vidro de 15 ml.
   NOTA: As frações finais de mol do DOPC e do colesterol no óleo/óleo mineral de silicone são de 69,9% e 30%, respectivamente. Foi estabelecido que o colesterol 20-30 mol% é uma concentração otimizada para fluidez de membrana e estabilidade de GUVs gerados utilizando a técnica apresentada ^25,26. Fisiologicamente, esses valores estão bem dentro da faixa de concentração de colesterol encontrada nas membranas plasmáticas de células mamíferas⁶. Os estoques lipídides são adquiridos como soluções em clorofórmio e armazenados a -20 °C. Os frascos de caldo lipídicos devem ser aclimatados à temperatura ambiente antes de serem abertos.
2. Pipeta 7,2 mL de óleo de silicone e 1,8 mL de óleo mineral em um segundo frasco de 15 mL (ver Tabela de Materiais). Geralmente, isso precisa ser feito em um porta-luvas de baixa umidade, principalmente se o óleo mineral for reutilizado.
3. Misture os óleos por vórtice na velocidade de rotação máxima (3200 rpm) por 10 s, adicione a mistura ao frasco contendo a mistura lipídica-em-clorofórmio e coloque-a imediatamente na batedeira do vórtice. Vórtice para 10-15 s na velocidade máxima de rotação (3200 rpm). A mistura lipídica-em-óleo resultante deve ser ligeiramente nublada, uma vez que os lipídios não são totalmente dissolvidos no óleo, mas sim dispersos como pequenos agregados²⁴.
4. Coloque a dispersão lipídica em óleo em um sônico de banho (ver Tabela de Materiais) com potência ultrassônica de 80 W e frequência operacional de 40 kHz à temperatura ambiente por 30 minutos. Use a mistura imediatamente ou armazene a 4 °C para um máximo de 24 horas.

2. Geração vesícula

1. Monte o eixo impresso em 3D (Arquivo Suplementar 1) feito de resina preta (ver Tabela de Materiais) na placa de agitação do banco e coloque a velocidade de rotação a 1200 rpm.
2. Monte a câmara cDICE impressa em 3D (Arquivo Suplementar 2) feita de resina clara (ver Tabela de Materiais) no eixo (Figura 1A,B).
3. Prepare soluções de actin e actin-binding proteins (ABP) separadamente em um volume total de 20 μL.
   1. Prepare 1-10 μM de actin no tampão globular actin (G-buffer), incluindo 10% atto 488 actin (ver Tabela de Materiais).
      NOTA: 1x G-buffer compreende 5 mM de Tris-HCl, pH 8.0 e 0,2 mM de CaCl₂.
   2. Adicione tampão de polimerização de actina filamentous (F-buffer) para iniciar a polimerização de actin no gelo. Mantenha as soluções no gelo para retardar a polimerização da actina antes da adição de um crosslinker.
      NOTA: O 1x F-buffer contém 50 mM de KCl, 2 mM de MgCl₂ e 3 mM de ATP em 10 mM de Tris, pH 7.5.
   3. Aguarde 15 minutos para permitir o início da polimerização de actin no gelo antes de adicionar crosslinkers de interesse na razão molar desejada. Mantenha a solução no gelo até o encapsulamento.
   4. Prepare as proteínas de ligação de actina (ABPs) separadamente em um microtubo (Figura 1C).
      NOTA: Esta etapa é realizada quando uma combinação de ABPs (por exemplo, myosin, α-actinin, fascin, complexo Arp2/3) encapsula com actin 25,26,27. Nesses casos, a quantidade desejada de cada ABP é retirada de seu estoque e adicionada ao microtubo designado para ABPs. Como a solução total deve ser de 20 μL, devem ser preparados alíquotas de estoque de ABPs para que a quantidade desejada da mistura total de ABP não exceda 5-6 μL. A única ABP utilizada nos resultados representativos aqui é a fascin, a preparação da qual é mencionada abaixo.
      1. Aliquot 1,57 μL de fascin de um estoque de fascina de 1,75 mg/mL (ver Tabela de Materiais), e adicionar diretamente à solução de actin na etapa 2.7. Isso corresponde a 2,5 μM de fascin na solução.
4. Adicione 7,5% do meio gradiente de densidade (ver Tabela de Materiais) na solução de actina para criar um gradiente de densidade entre a fase externa e aquosa interna para facilitar a sedimentação do GUV.
5. Dispense 700 μL da solução externa de 200 mM de glicose na câmara (Figura 1D, à esquerda).
   NOTA: A osmolaridade da solução interna determina a concentração de glicose. Para esses experimentos, a osmolaridade da solução interna é ~200 mOsm, por isso uma solução de glicose de 200 mM é usada como solução externa.
6. Adicione uma quantidade suficiente de mistura lipídica-óleo (>3 mL com base no tamanho da câmara) na câmara até que 60%-80% da câmara seja preenchida (Figura 1D, à direita). Uma interface será formada entre a mistura lipída-óleo e a solução externa.
7. Transferir ABPs (preparados na etapa 2.3.4) para a solução actin. Utilizando uma pipeta regular de 100-1000 μL, transfira imediatamente os 700 μL da mistura lipídio-óleo para a mistura actin-ABP (Figura 1E, à esquerda). Pipeta para cima e para baixo 8 vezes para gerar gotículas lipídicas-monocamadas do tamanho celular com diâmetro na faixa de 7-100 μm (Figura 1E, meio).
   NOTA: O passo 2.7 precisa ser concluído em poucos segundos para evitar qualquer montagem de rede actin antes do encapsulamento. Assim, antes de realizar a etapa, certifique-se de que as pontas da pipeta já estão inseridas nas pipetas e prontas para transferir as misturas.
8. Usando a mesma pipeta de 100-1000 μL, dispense imediatamente toda a emulsão para a câmara rotativa. As gotículas adquirirão um segundo folheto de lipídios cruzando a monocamada lipídica na interface da solução óleo-exterior, formando ASSIM GUVs (Figura 1E, à direita).
9. Retire a câmara da placa de agitação e descarte a maior parte da mistura lipídica-óleo inclinando a câmara no recipiente de resíduos para que uma grande parte da mistura lipídica-óleo seja drenada da grande abertura no centro da câmara.
   NOTA: Desta forma, a mistura lipída-óleo é retirada da câmara, evitando a mistura de lipídio-óleo com a solução externa na próxima etapa.
10. Segure a câmara com a tampa voltada para o usuário. Abra a tampa da câmara e incline ligeiramente a câmara em direção ao usuário. A interface entre a solução externa contendo GUVs e a mistura lipídica-óleo é visível a partir da abertura da câmara (onde a tampa está localizada).
11. Usando uma pipeta, colete solução externa suficiente contendo GUVs e dispense 50-300 μL da solução externa em uma placa de 96 poços para obter uma densidade adequada de GUVs.
    NOTA: Seguindo este protocolo, um total de cerca de 2 x 10⁵ GUVs são liberados na solução externa dentro da câmara. A dispersão do GUV não foi quantificada; no entanto, o diâmetro de cerca de 90% dos GUVs está na faixa de 12-30 μm. GUVs com qualquer diâmetro na faixa de 7-50 μm podem ser encontrados na população. Dependendo do meio de gradiente de densidade encapsulada, tamanho guv e profundidade da solução na placa do poço, leva de 2-15 minutos para os GUVs se estabelecerem na superfície. O rendimento dos GUVs com pacotes de actin reconstituídos é de cerca de 90%.

3. Reconstrução de imagens e imagens 3D

1. Configure a placa 96 no estágio de um microscópio invertido equipado com uma unidade confocal de disco giratório (ou escaneamento a laser), um EMCCD ou uma câmera sCMOS, e uma lente objetiva de imersão de óleo 60x (ver Tabela de Materiais).
2. Concentre-se em qualquer região de interesse (ROI) e pegue uma sequência de imagem z-stack do ROI com um intervalo de passo z de 0,5 μm.
   NOTA: Como os GUVs podem ser ligeiramente deslocados na superfície ao longo do tempo, recomenda-se capturar um conjunto de imagens de vários comprimentos de onda em cada z-plane se vários fluoroforos estiverem sendo imagens, ou seja, tirar um grupo de imagens de 561 nm e 488 nm em cada pista z de cada vez para capturar imagens atto 488 actin e Rhod PE.
3. Salve cada sequência de imagem de pilha de z em formato .tiff.
4. Abra uma sequência de imagem de interesse em um software de processamento de imagem (ImageJ/Fiji). Identifique a imagem com a maior intensidade. Segure "ctrl+shift+c" para abrir a janela Brilho & Contraste e clique em Redefinir.
5. No menu ImageJ/Fiji, vá para Analisar > Escala de conjunto e digite a distância física conhecida e sua unidade para cada pixel de imagem.
6. No menu ImageJ/Fiji, vá para Image > Stacks > projeto 3D para reconstruir uma imagem 3D da pilha z. Defina "método de projeção" como Ponto de Brilho, "Espaçamento de fatias (μm)" como 0,5 e marque Interpolar. As opções padrão podem ser usadas para o resto das configurações.
   NOTA: os intervalos z em alguns microscópios podem não ser calibrados, e o movimento real na direção z pode diferir ligeiramente do intervalo z inserido (ou seja, 0,5 μm). Nesses casos, uma amostra de calibração 3D, como microesferas fluorescentes com diâmetro conhecido, pode ser usada para obter o intervalo z real. Esse valor será usado como "Espaçamento de fatias (μm)" para projeção 3D.

Para demonstrar a geração bem sucedida de GUVs citosqueléticos usando o protocolo atual, estruturas de feixe de fascin-actin em GUVs foram reconstituídas. Fascin é um curto crosslinker de filamentos de actina que forma feixes rígidos de actina alinhados paralelos e é purificado de E. coli como Proteína de fusão Glutathione-S-Transferase (GST)26. 5 μM de actina foi primeiro reconstituído, incluindo 0,53 μM de atto488 actin no tampão de polimerização de actina e 7,5% do gradiente de densidade médio. Ao adicionar fascina a uma concentração de 2,5 μM e encapsular a mistura fascin-actin, estruturas de feixe de actina foram formadas em GUVs. Sequências de imagem confocal de pilha de Z das estruturas encapsuladas do feixe de actin nos GUVs rotulados por Rhodamine PE foram capturadas 1 h pós-encapsulamento (Figura 2A). Usando este protocolo, a concorrência inerente e a classificação dos actin crosslinkers encapsulados, α-actinin, e fascin, que, juntos, formam padrões diferentes de feixe de actina de forma dependente do tamanho do GUV, foi previamente demonstrado26.

Como a abordagem de emulsão invertida modificada aqui apresentada, o processo tradicional de cDICE gera GUVs citosqueléticos com alto rendimento, mas requer uma bomba de seringa e configuração de tubo para injeção controlada de solução proteica na câmara rotativa a baixas taxas de fluxo na ordem de nanoliters por segundo22,28. Nesta abordagem, a emulsão é gerada diretamente na câmara rotativa do CDICE; um capilar fino é inserido na fase do óleo. A solução proteica é injetada através de uma bomba de seringa. As gotículas formam-se e são cortadas na ponta capilar antes de viajarem em direção à fase externa aquosa, onde se transformam em GUVs, semelhante ao método descrito acima. A Figura 2B mostra vesículas que encapsulam uma mistura de reação usando esta abordagem. A mistura de reação contém 6 μM de actina que é empacotada por 0,9 μM de fascina. Aqui, os dois métodos e seus resultados não estão sendo comparados, mas note que ambos geram um alto rendimento de GUVs.

Figura 1: Configuração experimental para geração de GUVs. (A) Vista superior e seção lateral da câmara cDICE. (B) Fotos da configuração para a câmara giratória. (C-E) Ilustrações esquemáticas de procedimentos stepwise para geração de GUVs. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Encapsulamento de estruturas de feixe de actina. (A) As imagens mostram fatias confocal representativas de fluorescentes de GUVs (esquerda) e projeções máximas de uma pilha de actina e lipídios confocal (direita). Fascin, 2,5 μM; actin, 5 μM (incluindo 10% ATTO 488 actin). Barra de escala = 10 μm. (B) Encapsulamento de estruturas de feixe de actina utilizando cDICE convencional. A imagem mostra uma projeção máxima representativa de imagens de fluorescência confocal de feixes de actina encapsulados formados na presença de fascina. Fascin, 0,9 μM; Actin, 6 μM. Barra de escala = 10 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo suplementar 1: design do eixo impresso em 3D. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo suplementar 2: Projeto para a câmara cDICE impressa em 3D. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Os autores não declaram conflitos de interesse.