Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

אנקפסולציה מהירה של שלד ציטוסקי משוחזר בתוך בועיות יונילאמלריות ענקיות

Published: November 10, 2021 doi: 10.3791/63332
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 1,4,5,6
1Department of Mechanical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 2John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences, Harvard University, 3Department of Cellular and Molecular Biophysics, Max Planck Institute of Biochemistry, 4Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 5Department of Biophysics, University of Michigan, Ann Arbor, 6Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor
* These authors contributed equally

Summary

מאמר זה מציג שיטה פשוטה לייצור מהיר של שלפוחיות חד-שכבתיות ענקיות עם חלבוני שלד ציטוסקטליים עטופים. השיטה מוכיחה את עצמה כיעילה לשילוב מחדש מלמטה למעלה של מבנים ציטוסקטליים באינטראקציות כליאה וציטוסקלטון-ממברנה.

Abstract

שלפוחיות חד-שכבתיות ענקיות (GUVs) משמשות לעתים קרובות כמודלים של ממברנות ביולוגיות ולכן הן כלי נהדר לחקר תהליכים תאיים הקשורים לממברנה במבחנה. בשנים האחרונות, אנקפסולציה בתוך GUVs הוכיחה את עצמה כגישה מועילה לניסויים חוזרים בביולוגיה של התא ובתחומים קשורים. הוא מחקה טוב יותר את תנאי הכליאה בתוך תאים חיים, בניגוד לשיקום ביוכימי קונבנציונלי. לעתים קרובות לא קל ליישם שיטות לעטיפה בתוך GUVs, ושיעורי ההצלחה יכולים להיות שונים באופן משמעותי ממעבדה למעבדה. טכניקה אחת שהוכחה כמוצלחת לעטוף מערכות חלבונים מורכבות יותר נקראת אנקפסולציה רציפה של ממשק טיפות (cDICE). כאן מוצגת שיטה מבוססת cDICE לעטיפה מהירה של חלבוני שלד ציטוסקטליים ב-GUVs עם יעילות אנקפסולציה גבוהה. בשיטה זו, ראשית, טיפות שומנים-חד-שכבתיות נוצרות על ידי תחליב של תמיסת חלבון בעלת עניין בתערובת שומנים/שמן. לאחר שמוסיפים אותם לתוך תא מודפס בתלת-ממד מסתובב, טיפות חד-שכבתיות אלה עוברות דרך מונו-שכבתי שומנים שני בממשק מים/שמן בתוך החדר כדי ליצור GUVs המכילים את מערכת החלבון. שיטה זו מפשטת את ההליך הכולל של אנקפסולציה בתוך GUVs ומאיצה את התהליך, ובכך מאפשרת לנו להגביל ולהתבונן באבולוציה הדינמית של הרכבת הרשת בתוך בועיות דו-שכבתיות של שומנים. פלטפורמה זו שימושית לחקר המכניקה של אינטראקציות שלד-ממברנה ציטוסקית בכליאה.

Introduction

תאי דו-תאי ליפידים משמשים כתאים סינתטיים לדוגמה לחקר תגובות אורגניות סגורות ותהליכים מבוססי ממברנה או כמודלים נשאים ביישומי אספקת תרופות 1,2. ביולוגיה מלמטה למעלה עם רכיבים מטוהרים דורשת מערכות ניסוי מינימליות כדי לחקור תכונות ואינטראקציות בין ביומולקולות, כגון חלבונים ושומנים 3,4. עם זאת, עם התקדמות התחום, יש צורך גובר במערכות ניסוי מורכבות יותר המחקות טוב יותר את התנאים בתאים ביולוגיים. אנקפסולציה ב- GUVs היא גישה מעשית שיכולה להציע חלק מהתכונות דמויות התאים הללו על ידי מתן דו-שכבת שומנים מעוותת וחדירה באופן סלקטיבי ומרחב תגובה מוגבל. בפרט, שחזור חוץ גופי של מערכות שלד ציטוסקטליות, כמודלים של תאים סינתטיים, יכול להפיק תועלת מאנקפסולציה בתאי ממברנה5. חלבונים ציטוסקטליים רבים נקשרים ומתקשרים עם קרום התא. מכיוון שרוב מכלולי השלד הציטוסקטליים יוצרים מבנים המשתרעים על פני כל התא, צורתם נקבעת באופן טבעי על ידי כליאה בגודל תא6.

שיטות שונות משמשות ליצירת GUVs, כגון נפיחות 7,8, היתוך שלפוחית קטן 9,10, העברת תחליב11,12, סילון פועם13, וגישות מיקרופלואידיות אחרות14,15. למרות ששיטות אלה עדיין בשימוש, לכל אחת מהן יש את המגבלות שלה. לפיכך, גישה חזקה ופשוטה עם תפוקה גבוהה של אנקפסולציה GUV היא רצויה מאוד. אף על פי שטכניקות כגון נפיחות ספונטנית ואלקטרוסוולינג מאומצות באופן נרחב ליצירת GUVs, שיטות אלה תואמות בעיקר להרכבי שומנים ספציפיים16, מאגרי ריכוז מלח נמוכים17, גודל מולקולרי אנקפסולנטי קטן יותר18, ודורשים נפח גבוה של האנקפסולנט. התמזגות של שלפוחיות קטנות מרובות לתוך GUV היא שלילית מטבעה מבחינה אנרגטית, ולכן דורשת ספציפיות בהרכבי שומנים טעונים9 ו/או חומרים חיצוניים הגורמים לאיחוי, כגון פפטידים19 או כימיקלים אחרים. העברת תחליב ושיטות מיקרופלואידיות, לעומת זאת, עשויות לדרוש ייצוב טיפות באמצעות פעילי שטח והסרת ממסים לאחר היווצרות דו-שכבתית, בהתאמה18,20. המורכבות של מערך הניסוי והמכשיר בטכניקות מיקרופלואידיות כגון סילון פועם מטילים אתגר נוסף21. cDICE היא שיטה מבוססת אמולסיה הנגזרת מעקרונות דומים המסדירים העברת תחליב22,23. תמיסה מימית (תמיסה חיצונית) ותערובת שומנים-שמן מרובדים על ידי כוחות צנטריפוגליים בתא גלילי מסתובב (תא cDICE) היוצרים ממשק רווי שומנים. טפטוף של טיפות מימיות חד-שכבתיות של שומנים חד-שכבתיים לתוך תא ה-cDICE המסתובב גורם לרוכסן של דו-שכבתי כאשר טיפות חוצות את הממשק רווי השומנים אל תוך התמיסה המימית החיצונית22,24. גישת cDICE היא טכניקה חזקה עבור אנקפסולציה של GUV. עם השיטה המתוקנת המוצגת, לא רק תפוקת השלפוחית הגבוהה האופיינית ל- cDICE עם זמן אנקפסולציה קצר משמעותית (כמה שניות) מושגת, אלא שזמן יצירת GUV המאפשר תצפית על תהליכים תלויי זמן (למשל, היווצרות רשת ציטוסקטלית של אקטין ציטוסקלית) מצטמצם באופן משמעותי. הפרוטוקול לוקח בערך 15-20 דקות מההתחלה לאיסוף GUV והדמיה. כאן, יצירת GUV מתוארת באמצעות שיטת cDICE שעברה שינוי לעטיפת חלבונים קושרי אקטין ואקטין (ABPs). עם זאת, הטכניקה המוצגת ישימה לתמצות מגוון רחב של תגובות ביולוגיות ואינטראקציות עם ממברנות, החל מהרכבת ביופולימרים, דרך ביטוי חלבונים ללא תאים וכלה בהעברת מטען מבוססת היתוך ממברנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת תערובת שמן-שומנים

הערה: הצעד צריך להתבצע במכסה אדים בהתאם לכל הנחיות הבטיחות לטיפול בכלורופורם.

  1. קח 0.5 מ"ל של כלורופורם בבקבוקון זכוכית 15 מ"ל. הוסיפו 88 μL של 25 מ"ג/מ"ל דיאוליאויל-פוספוכולין (DOPC), 9.3 μL של 50 מ"ג/מ"ל כולסטרול, ו-5 μL של 1 מ"ג/מ"ל דיאוליאויל-פוספואתנולמין-ליסאמין-ליסמין רודמין B (רודמין PE) (ראו טבלת חומרים) לתוך בקבוקון הזכוכית של 15 מ"ל.
    הערה: השברי השומה הסופיים של DOPC וכולסטרול בשמן סיליקון/מינרלי הם 69.9% ו-30%, בהתאמה. נקבע כי 20-30 מול% כולסטרול הוא ריכוז אופטימלי לנזילות הממברנה וליציבות של GUVs שנוצרו באמצעות הטכניקה המוצגת25,26. מבחינה פיזיולוגית, ערכים אלה נמצאים היטב בטווח ריכוזי הכולסטרול המצויים בקרוםהפלזמה של תאי יונקים 6. מלאי שומנים נרכשים כפתרונות בכלורופורם ומאוחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. בקבוקוני מלאי שומנים צריכים להיות מאוכלסים לטמפרטורת החדר לפני שהם נפתחים.
  2. פיפטה 7.2 מ"ל של שמן סיליקון ו-1.8 מ"ל של שמן מינרלי בבקבוקון שני של 15 מ"ל (ראו טבלת חומרים). בדרך כלל, זה צריך להיעשות בתא כפפות בלחות נמוכה, בעיקר אם נעשה שימוש חוזר בשמן המינרלי.
  3. מערבבים את השמנים על ידי מערבולת במהירות הסיבוב המרבית (3200 סל"ד) למשך 10 שניות, מוסיפים את התערובת לבקבוקון המכיל את תערובת השומנים בכלורופורם ומניחים אותה מיד על מערבל המערבולות. מערבולת ל-10-15 שניות במהירות הסיבוב המרבית (3200 סל"ד). תערובת השומנים בשמן שנוצרת צריכה להיות מעט עכורה, שכן השומנים אינם מומסים במלואם בשמן אלא מפוזרים כאגרגטים קטנים24.
  4. שים את פיזור השומנים בשמן בסוניקטור אמבטיה (ראה טבלת חומרים) עם הספק על-קולי של 80 W ותדר הפעלה של 40 קילוהרץ בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. יש להשתמש בתערובת באופן מיידי או לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לכל היותר.

2. יצירת שלפוחית

  1. הרכיבו את הפיר המודפס בתלת-ממד (קובץ משלים 1) העשוי משרף שחור (ראו טבלת חומרים) על לוח ההתעוררות של הספסל והגדירו את מהירות הסיבוב ל-1,200 סל"ד.
  2. הרכיבו את תא ה-cDICE המודפס בתלת-ממד (קובץ משלים 2) העשוי משרף שקוף (ראו טבלת חומרים) על הפיר (איור 1A,B).
  3. הכן פתרונות אקטין וחלבונים קושרי אקטין (ABP) בנפרד בנפח כולל של 20 μL.
    1. הכן 1-10 מיקרומטר של אקטין במאגר אקטין כדורי (G-buffer), כולל 10% ATTO 488 אקטין (ראה טבלת חומרים).
      הערה: 1x G-buffer מורכב מ-5 mM של Tris-HCl, pH 8.0 ו-0.2 mM של CaCl2.
    2. הוסיפו חיץ פילמור אקטין נימה (F-buffer) כדי להתחיל בפולימריזציה של אקטין על קרח. שמור את הפתרונות על קרח כדי להאט את הפילמור של אקטין לפני הוספת crosslinker.
      הערה: מאגר F 1x מכיל 50 mM של KCl, 2 mM של MgCl2, ו-3 mM של ATP ב-10 mM של Tris, pH 7.5.
    3. המתן במשך 15 דקות כדי לאפשר ייזום של פילמור אקטין על קרח לפני שתוסיף לינקרים צולבים בעלי עניין ביחס הטוחנת הרצוי. שמור את התמיסה על קרח עד לעטיפה.
    4. הכינו חלבונים קושרי אקטין (ABPs) בנפרד במיקרו-צינור (איור 1C).
      הערה: שלב זה מבוצע כאשר שילוב של ABPs (למשל, מיוזין, α-אקטינין, fascin, Arp2/3 complex) מתמצת עם אקטין 25,26,27. במקרים כאלה, הכמות הרצויה של כל ABP נלקחת מהמלאי שלה ומתווספת למיקרו-טיוב המיועד ל-ABPs. מכיוון שהפתרון הכולל הוא להיות 20 μL, יש להכין ציטוטים מלאי של ABPs כך שהכמות הרצויה של תערובת ה- ABP הכוללת לא תעלה על 5-6 μL. ה- ABP היחיד המשמש בתוצאות המייצגות כאן הוא קסם, שהכנתו מוזכרת להלן.
      1. Aliquot 1.57 μL של fascin מתוך 1.75 מ"ג /מ"ל של מלאי fascin (ראה טבלת חומרים), ולהוסיף ישירות לתמיסת אקטין בשלב 2.7. זה מתאים 2.5 μM של fascin בתמיסה.
  4. הוסף 7.5% ממדיום גרדיאנט הצפיפות (ראה טבלת חומרים) לתמיסת האקטין כדי ליצור גרדיאנט צפיפות בין הפאזה החיצונית והפנימית מימית כדי להקל על שקיעת GUV.
  5. מחלקים 700 μL של התמיסה החיצונית של 200 mM של גלוקוז לתוך החדר (איור 1D, משמאל).
    הערה: התנודות של התמיסה הפנימית קובעות את ריכוז הגלוקוז. עבור ניסויים אלה, האוסמולריות של התמיסה הפנימית היא ~ 200 mOsm, ולכן תמיסת גלוקוז של 200 mM משמשת כפתרון החיצוני.
  6. הוסיפו כמות מספקת של תערובת שמן שומנים (>3 מ"ל בהתבסס על גודל התא) לתוך התא עד למילוי של 60%-80% מהתא (איור 1D, מימין). ייווצר ממשק בין תערובת השומנים-שמן לבין התמיסה החיצונית.
  7. העברת ABPs (שהוכן בשלב 2.3.4) לפתרון אקטין. באמצעות פיפטה רגילה של 100-1000 μL, מעבירים מיד את ה-700 μL של תערובת השומנים-שמן לתערובת האקטין-ABP (איור 1E, משמאל). פיפטה למעלה ולמטה 8 פעמים כדי ליצור טיפות חד-שכבתיות בגודל תא בקוטר של 7-100 מיקרומטר (איור 1E, אמצע).
    הערה: יש להשלים את שלב 2.7 תוך מספר שניות כדי להימנע מכל הרכבה של רשת אקטין לפני האנקפסולציה. לכן, לפני ביצוע הצעד, ודא כי קצות פיפטה כבר מוכנסים לתוך pipettes מוכן להעביר את התערובות.
  8. באמצעות אותה פיפטה של 100-1000 μL, מיד מחלקים את כל האמולסיה לתא המסתובב. טיפות ירכשו עלון שני של שומנים על ידי חציית מונו-שכבת השומנים בממשק הפתרון החיצוני של השמן, ובכך ייצרו GUVs (איור 1E, מימין).
  9. מוציאים את התא מצלחת הערבוב ומשליכים את רוב תערובת השומנים-שמן על ידי הטיית התא במיכל הפסולת כך שחלק גדול מתערובת שמן השומנים מנוקז מהפתח הגדול שבמרכז התא.
    הערה: בדרך זו, תערובת שמן השומנים נמשכת מהתא, תוך הימנעות מערבוב של תערובת שמן שומנים עם התמיסה החיצונית בשלב הבא.
  10. החזיקו את התא כשהמכסה שלו פונה לכיוון המשתמש. פתחו את מכסה התא והטו מעט את התא לכיוון המשתמש. הממשק בין התמיסה החיצונית המכילה GUVs לבין תערובת שמן השומנים נראה מפתח התא (שם נמצא המכסה).
  11. באמצעות פיפטה, אספו מספיק תמיסות חיצוניות המכילות GUVs וחלקו 50-300 מיקרול' של הפתרון החיצוני לצלחת של 96 בארות כדי להשיג צפיפות מתאימה של GUVs.
    הערה: בעקבות פרוטוקול זה, בסך הכל כ-2 x 105 GUVs משוחררים בפתרון החיצוני בתוך התא. פיזור ה-GUV לא כומת; עם זאת, הקוטר של כ -90% של GUVs הוא בטווח של 12-30 μm. GUVs עם כל קוטר בטווח של 7-50 מיקרומטר ניתן למצוא באוכלוסייה. בהתאם למדיום שיפוע הצפיפות העטוף, גודל ה-GUV ועומק הפתרון בלוח הבאר, לוקח ל-GUVs 2-15 דקות להתיישב על פני השטח. התשואה של GUVs עם חבילות אקטין משוחזרות היא כ -90%.

3. הדמיה ושחזור תמונה בתלת-ממד

  1. הגדר את לוחית הבאר 96 על הבמה של מיקרוסקופ הפוך המצויד ביחידת קונפוקל של דיסק מסתובב (או סריקת לייזר), EMCCD או מצלמת sCMOS, ועדשת מטרה טבילת שמן 60x (ראה טבלת חומרים).
  2. התמקד בכל אזור עניין (ROI) וקח רצף תמונות z-stack מה- ROI עם מרווח z-step של 0.5 מיקרומטר.
    הערה: מכיוון שניתן לעקור מעט את ה-GUVs על פני השטח לאורך זמן, מומלץ לצלם קבוצה מרובת אורכי גל של תמונות בכל מישור z אם מצלמים פלואורופורים מרובים, כלומר לצלם קבוצה של תמונות של 561 ננומטר ו-488 ננומטר בכל נתיב z בכל פעם כדי ללכוד תמונות ATTO 488 actin ו-Rhod PE.
  3. שמור כל רצף תמונה של z-stack בתבנית .tiff.
  4. פתח רצף תמונות בעל עניין בתוכנת עיבוד תמונה (ImageJ/Fiji). זהה את התמונה בעוצמה הגבוהה ביותר. החזק את "ctrl+shift+c" כדי לפתוח את החלון בהירות וניגודיות ולחץ על איפוס.
  5. מתפריט ImageJ/Fiji, עבור אל נתח > הגדר קנה מידה והזן את המרחק הפיזי הידוע ואת היחידה שלו עבור כל פיקסל תמונה.
  6. מתפריט ImageJ/Fiji, עבור אל Image > Stacks > פרויקט תלת-ממד כדי לשחזר תמונה תלת-ממדית ממחסנית z. הגדר את "שיטת ההקרנה" כנקודת בהירות, "ריווח פרוסות (μm)" כ - 0.5, וסימן ביקורת אינטרפולציה. ניתן להשתמש באפשרויות ברירת המחדל עבור שאר ההגדרות.
    הערה: ייתכן שמרווחי z במיקרוסקופים מסוימים אינם מכוילים, והתנועה בפועל בכיוון z עשויה להיות שונה במקצת מהמרווח z שהוזן (כלומר, 0.5 מיקרומטר). במקרים כאלה, ניתן להשתמש בדגימת כיול תלת-ממדית כגון מיקרו-ספירות פלואורסצנטיות בקוטר ידוע כדי לקבל את מרווח ה-z בפועל. ערך זה ישמש אפוא כ"מרווח פרוסות (μm)" עבור הקרנה תלת-ממדית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי להדגים את הדור המוצלח של GUVs של שלדיים באמצעות הפרוטוקול הנוכחי, נבנו מחדש מבנים של צרור קסין-אקטין ב-GUVs. Fascin הוא קרוסלינקר קצר של חוטי אקטין היוצר צרורות אקטין נוקשים המיושרים במקביל ומטוהר מ- E. coli כחלבון היתוך גלוטתיון-S-טרנספראז (GST)26. 5 μM של אקטין שוחזר לראשונה, כולל 0.53 μM של ATTO488 אקטין במאגר פילמור אקטין ו-7.5% ממדיום שיפוע הצפיפות. עם הוספת קסין בריכוז של 2.5 מיקרומטר ועטיפת תערובת הפאסין-אקטין, נוצרו מבני צרור אקטין ב-GUVs. רצפי תמונה קונפוקליים של Z-stack של מבני צרור האקטין העטופים ב-GUVs המסומנים ב-PE של רודמין נלכדו 1 שעות לאחר האנקפסולציה (איור 2A). באמצעות פרוטוקול זה, התחרות האינהרנטית והמיון של האקטין קרוסלינקרים, α-אקטינין ופאסין, שיחד יוצרים תבניות שונות של צרור אקטין באופן תלוי גודל GUV, הודגמו בעבר26.

בדומה לגישת האמולסיה ההפוכה ששונתה שהוצגה כאן, תהליך ה-cDICE המסורתי מייצר GUVs שלדיים ציטוסקטליים בעלי תפוקה גבוהה אך דורש משאבת מזרקים ומערך צינורות להזרקה מבוקרת של תמיסת חלבון לתא המסתובב בקצבי זרימה נמוכים בסדר גודל של ננו-ליטרים לשנייה22,28. בגישה זו, האמולסיה נוצרת ישירות בתא cDICE המסתובב; נימי דק מוכנסים לשלב השמן. תמיסת החלבון מוזרקת דרך משאבת מזרק. טיפות נוצרות ונגזזות בקצה הנימי לפני שהן נעות לעבר השלב החיצוני המיימי, שם הן הופכות ל-GUVs, בדומה לשיטה שתוארה לעיל. איור 2B מראה שלפוחיות שמתמצתות תערובת תגובות באמצעות גישה זו. תערובת התגובה מכילה 6 μM של אקטין אשר צרור על ידי 0.9 μM של fascin. כאן, שתי השיטות והתוצאות שלהן אינן מושוות אך יש לציין כי שתיהן מייצרות תפוקה גבוהה של GUVs.

Figure 1
איור 1: מערך ניסיוני ליצירת GUVs. (A) תצוגה עליונה ותצוגת מקטע צדדי של תא ה-cDICE. (ב) תמונות של ההתקנה של התא המסתובב. (ג-ה) איורים סכמטיים של נהלים stepwise ליצירת GUVs. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: אנקפסולציה של מבני צרור אקטין. (A) התמונות מציגות פרוסות קונפוקליות פלואורסצנטיות מייצגות של GUVs (משמאל) והקרנות מקסימליות של ערימת z קונפוקלית של ערוצי אקטין וליפידים (מימין). Fascin, 2.5 μM; אקטין, 5 מיקרומטר (כולל 10% ATTO 488 אקטין). סרגל קנה מידה = 10 μm. (B) אנקפסולציה של מבני צרור אקטין באמצעות cDICE קונבנציונלי. התמונה מציגה הקרנה מקסימלית מייצגת של תמונות פלואורסצנטיות קונפוקליות של צרורות אקטין עטופים שנוצרו בנוכחות קסם. Fascin, 0.9 μM; Actin, 6 μM. סרגל קנה מידה = 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

קובץ משלים 1: עיצוב פיר מודפס בתלת-ממד. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2: עיצוב עבור תא cDICE המודפס בתלת-ממד. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שיטות שונות ליצירת GUVs נחקרו ליצירת תאים סינתטיים עם זאת, המורכבות של ההליכים, זמן ממושך להשגת אנקפסולציה, הגבלת סוגי שומנים והרכב מולקולרי של האנקפסולנט, הצורך בכימיקלים לא פיזיולוגיים כדי להקל על אנקפסולציה, תפוקת GUV נמוכה וחוסר עקביות ביעילות האנקפסולציה המשיכו לאתגר חוקרים בתחום זה. בהתחשב במגוון הרחב של מחקרים פוטנציאליים שניתן להתחיל בביולוגיה סינתטית מלמטה למעלה, גישת אנקפסולציה חלקה של GUV בתפוקה גבוהה התואמת להרכבי שומנים שונים ויכולה לתמצת כל מולקולות ללא קשר לגודלן עשויה לדרבן הזדמנויות חדשות לחקור מערכות סינתטיות מורכבות של ביומימיקינג. שיטת cDICE ביטלה את רוב האתגרים והמגבלות הטבועים בשיטות קודמות ליצירת GUV.

הגישה והעקרונות השולטים ליצירת GUVs בשיטת cDICE קדמו לפלטפורמה ויושמו בטכניקות קודמות כגון העברת תחליבהפוכה 12. עם זאת, לשיטת העברת האמולסיה ההפוכה יש מגבלות כגון תפוקת שלפוחית נמוכה והטרוגניות של שלפוחית. עבור שיטת cDICE המוצגת כאן, שומנים מפוזרים בשמן בצורה של אגרגטים של עשרות ננומטרים (גודל אגרגט השומנים תלוי בריכוז הכולל של שומנים)24. פיזור השומנים הוא בשני שמנים שאינם ניתנים להסרה, כאשר אחד (שמן מינרלי) יכול להמיס שומנים ושמן שני (שמן סיליקון) שאינו ניתן לטעות עם שומנים. זה יוצר קואקרוואטים של אגרגטים שומנים בדרך של הסטתממסים 29. גישת פיזור מסוימת זו מאפשרת רוויה חד-שכבתית מיידית של טיפות מימיות והתחדשות מהירה יותר של שומנים בממשק מימי השמן כאשר טיפות מימיות חוצות ללא הרף את הממשק המיימי רווי השומנים. זה גם משפר לאחר מכן את רוכסן הדו-שכבתי ליצירת GUVs ומגדיל את תפוקת ה-GUV. הכוחות הצנטריפוגליים הנוצרים על ידי התא המסתובב הם אופטימליים לסגירת טיפות רב-ממדיות על פני הממשק רווי השומנים. הגרסה המקורית של שיטת cDICE משתמשת בזרבובית מיקרו-קפילרית כדי להזריק את התמיסה הפנימית לתערובת השומנים השמן. בגישה זו, כוחות גזירה הנוצרים על ידי תערובת השומנים-שמן המסתובבת יוצרים טיפות מימיות, ובסופו של דבר הופכים ל-GUVs כמתואר. עם זאת, מתוך כוונה לקצר את הזמן הנדרש להכנת פלטפורמת ההזרקה, קריטי במיוחד לתגובות מהירות, כגון הרכבת רשת אקטין וסתימה פוטנציאלית של המיקרו-קפילר, טיפות מימיות עם מונו-שכבות שומניות נוצרות כעת על ידי הוספת תערובת השומנים-שומנים ישירות לתמיסה הפנימית וצנרת למעלה ולמטה. גישה זו מבטלת את הפיגור בזמן באנקפסולציה של GUV לניסוי תגובה מהיר.

בין האתגרים שנגרמו על ידי שיטות מוקדמות יותר ליצירת GUV הוא הגבלת סוגי השומנים (מטען השומנים ושלב השומנים) בהתאם לטכניקה של יצירת GUV. נבדקו מספר סוגי שומנים, כולל DOPC, דיאוליאויל-גליצרו-הוספוסרין (DOPS), דיוליאויל-גליצרו-סוקצינאט (DGS), דימיריסטואיל-גליצריזרו-פוספוקולין (DMPC), ושילובים של שומנים שונים וכולסטרול בריכוזים משתנים. עבור כל התנאים, שיטת cDICE מוצגת כצורת GUVs עם יעילות אנקפסולציה גבוהה בתפוקת GUV גבוהה באופן עקבי. יתר על כן, שיטת cDICE הוכחה גם כמתמצתת ביעילות רכיבים תאיים שונים, כולל חלבוני שלד ציטוסקטליים, תגובות לביטוי חופשי של תאים, חומרי צפיפות, צבעים ומולקולות תאיות אחרות בגדלים שונים ללא אובדן יעילות האנקפסולציה או ירידה בתפוקה. יתר על כן, בדומה לשיטות רגילות להעברת תחליב הפוך30, ה- cDICE המתוקן יכול לאפשר ייצור של GUVs אסימטריים לעבודה עתידית. ניתן להשתמש בהרכבי ליפידים שונים עבור העלון הפנימי והעלון החיצוני, שכן טיפות חד-שכבתיות נוצרות בנפרד (בתוך מיקרו-צינורית על ידי צנרת למעלה ולמטה) לפני רוכסן הדו-שכבתי בתוך תא ה-cDICE. משקעים של שומנים נצפים כאשר תערובת שמן השומנים נשמרת לאורך זמן; עם זאת, אפשר פשוט לסובב את תערובת השומנים-שמן לפני האנקפסולציה כדי לפזר מחדש אגרגטים של שומנים. חשוב לציין כי איכות האנקפסולציה עלולה להיפגע כאשר תערובות שמן השומנים נשמרות זמן רב יותר, כפי שמעידים אגרגטים משמעותיים מהרגיל של שומנים בתערובת השומנים-שמן. אף על פי שלא נבדקו, אגרגטים אלה עלולים לגרום לחוסר שלמות בזיוף דו-שכבתי, והאגרגטים עשויים גם בסופו של דבר להיות עטופים בתמיסה פנימית הפוגעת בסביבה הכימית הרצויה.

המגבלה של הגישה המתוקנת המוצגת ליצירת טיפות מימיות היא ביצירת אחידות בגודל הטיפות. למרות שניתן לשפר זאת על ידי שימוש בהזרקה מיקרו-קפילרית של תמיסה פנימית בקצבי זרימה שונים כדי לווסת גדלי GUV, פחות רצוי לנטר תגובות מהירות כמו הרכבה של אקטין ב- GUVs עטופים. על ידי יצירת טיפות על ידי צנרת למעלה ולמטה שמביאה לגדלים שונים של GUV, ניתן לנתח אוכלוסיות של שלפוחיות בגודל דומה. חששות לגבי שימור שמן אפשרי בדו-שכבתיים מעכבים את האימוץ של רוב טכניקות יצירת ה-GUV, כולל טכניקות ליצירת GUV מבוססות תחליב כגון cDICE21. עם זאת, כמות השמן שנותרה בממברנה עשויה להיות מופחתת על ידי שימוש בחומרים אורגניים כגון 1-octanol, אשר ניתן להסיר לאחר יצירת שלפוחית31,32. יש לחקור שינויים עתידיים בשיטה, אולי על ידי שינוי הרכב הממסים.

ישנם תחומים רבים בביולוגיה סינתטית מלמטה למעלה שעדיין לא נחקרו, וייתכן שהם דורשים כליאה המחקה תאים של GUVs. מאמצים ניסיוניים כאלה מחייבים פלטפורמות ליצירת GUV כמו cDICE לייצר GUVs באופן חזק תוך כינוס יעיל של מולקולות שונות בעלות עניין. תהליכים תאיים רבים מתרחשים מהר יותר מהזמן שלוקח לתמצת מולקולות באמצעות טכניקות קודמות ליצירת GUV. כפי שתואר כאן, פתרונות אקטין עטופים במהירות מספקת כדי לצפות בעיוות שלפוחית הנובע מהרכבת רשת אקטין. תאים סינתטיים כאלה עם שלד אקטין משוחזר חשפו תכונות של ארגון רשת אקטין בנוכחות קרוסלינקרים שונים 5,25,33 ושיפוץ ממברנה 25,27,28. הם יהוו השראה לעבודה עתידית ליצירת תאים סינתטיים מתוחכמים יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים על היעדר ניגודי עניינים.

Acknowledgments

APL מכיר בתמיכה של מלגת מחקר של הומבולדט לחוקרים מנוסים ומהקרן הלאומית למדע (1939310 1817909) ומהמכונים הלאומיים לבריאות (R01 EB030031).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18:1 Liss Rhod PE lipid in chloroform Avanti Polar Lipids 810150C
96 Well Optical Btm Pit PolymerBase ThermoFisher Scientific 165305
Actin from rabbit skeletal muscle Cytoskeleton AKL99-A
ATTO 488-actin from rabbit skeletal muscle Hypermol 8153-01
Axygen microtubes (200 µL) Fisher Scientific 14-222-262 for handling ABPs
Black resin Formlabs RS-F2-GPBK-04
Cholesterol (powder) Avanti Polar Lipids 700100P
Choloroform Sigma Aldrich 67-66-3
Clear resin Formlabs RS-F2-GPCL-04
CSU-X1 Confocal Scanner Unit YOKOGAWA CSU-X1
Density gradient medium (Optiprep) Sigma-Aldrich D1556
DOPC lipid in chloroform Avanti Polar Lipids 850375C
Fascin homemade N/A
F-buffer homemade N/A
Fisherbrand microtubes (1.5 mL) Fisher Scientific 05-408-129
FS02 Sonicator Fischer Scientific FS20
G-buffer homemade N/A
Glucose Sigma-Aldrich 158968
iXon X3 camera Andor DU-897E-CS0
Mineral oil Acros Organics 8042-47-5
Olympus IX81 Inverted Microscope Olympus IX21
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective Olumpus 1-U2B933
Silicone oil Sigma-Aldrich 317667

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Groaz, A., et al. Engineering spatiotemporal organization and dynamics in synthetic cells. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (3), 1685 (2021).
  2. Diltemiz, S. E., et al. Use of artificial cells as drug carriers. Materials Chemistry Frontiers. 5, 6672-6692 (2021).
  3. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
  4. Ganzinger, K. A., Schwille, P. More from less - bottom-up reconstitution of cell biology. Journal of Cell Science. 132 (4), 227488 (2019).
  5. Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: Towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
  6. Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C., Plastino, J. Actin dynamics, architecture, and mechanics in cell motility. Physiol reviews. 94 (1), 235-263 (2014).
  7. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
  8. Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68 (1), 98-105 (2009).
  9. Bailey, A. L., Cullis, P. R. Membrane fusion with cationic liposomes: Effects of target membrane lipid composition. Biochemistry. 36 (7), 1628-1634 (1997).
  10. Haluska, C. K., Riske, K. A., Marchi-Artzner, V., Lehn, J. M., Lipowsky, R., Dimova, R. Time scales of membrane fusion revealed by direct imaging of vesicle fusion with high temporal resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (43), 15841-15846 (2006).
  11. Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets. Journal of Colloid and Interface Science. 376 (1), 119-125 (2012).
  12. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  13. Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Liu, A. P., Parekh, S. H., Fletcher, D. A. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4697-4702 (2008).
  14. Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 51-77 (2020).
  15. Ho, K. K. Y., Murray, V. L., Liu, A. P. Engineering artificial cells by combining HeLa-based cell-free expression and ultrathin double emulsion template. Methods in Cell Biology. , 303-318 (2015).
  16. Akashi, K., Miyata, H., Itoh, H., Kinosita, K. Preparation of giant liposomes in physiological conditions and their characterization under an optical microscope. Biophysical Journal. 71 (6), 3242-3250 (1996).
  17. Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation: From lipid mixtures to native membranes under physiological conditions. Methods in Enzymology. 465, 161-176 (2009).
  18. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: Preparations and applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  19. Pécheur, E. I., Martin, I., Ruysschaert, J. M., Bienvenüe, A., Hoekstra, D. Membrane fusion induced by 11-mer anionic and cationic peptides: A structure− function study. Biochemistry. 37 (8), 2361-2371 (1998).
  20. Morigaki, K., Walde, P. Giant vesicle formation from oleic acid/sodium oleate on glass surfaces induced by adsorbed hydrocarbon molecules. Langmuir. 18 (26), 10509-10511 (2002).
  21. Majumder, S., Wubshet, N., Liu, A. P. Encapsulation of complex solutions using droplet microfluidics towards the synthesis of artificial cells. Journal of Micromechanics and Microengineering. 29 (8), 83001 (2019).
  22. Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), 4610-4614 (2011).
  23. Van de Cauter, L., et al. Optimized cDICE for efficient reconstitution of biological systems in giant unilamellar vesicles. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1690-1702 (2021).
  24. Claudet, C., In, M., Massiera, G. Method to disperse lipids as aggregates in oil for bilayers production. The European Physical Journal E. 39 (1), 1-6 (2016).
  25. Bashirzadeh, Y., Wubshet, N. H., Liu, A. P. Confinement Geometry tunes fascin-actin bundle structures and consequently the shape of a lipid bilayer vesicle. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 610277 (2020).
  26. Bashirzadeh, Y., et al. Actin crosslinker competition and sorting drive emergent GUV size-dependent actin network architecture. Communications Biology. 4, 1136 (2021).
  27. Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes. bioRxiv. , (2021).
  28. Litschel, T., et al. Reconstitution of contractile actomyosin rings in vesicles. Nature Communications. 12 (1), 1-10 (2021).
  29. Vitale, S. A., Katz, J. L. Liquid droplet dispersions formed by homogeneous liquid− liquid nucleation:"The Ouzo effect.". Langmuir. 19 (10), 4105-4110 (2003).
  30. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Engineering asymmetric vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (19), 10718-10721 (2003).
  31. Deshpande, S., Dekker, C. On-chip microfluidic production of cell-sized liposomes. Nature Protocols. 13 (5), 856-874 (2018).
  32. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E. C., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447 (2016).
  33. Wubshet, N. H., Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Fascin-induced actin protrusions are suppressed by dendritic networks in GUVs. Molecular Biology of the Cell. 32 (18), 1634-1640 (2021).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 177 העברת תחליב cDICE GUVs שחזור מלמטה למעלה אקטין קסם
אנקפסולציה מהירה של שלד ציטוסקי משוחזר בתוך בועיות יונילאמלריות ענקיות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bashirzadeh, Y., Wubshet, N.,… More

Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid Encapsulation of Reconstituted Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles. J. Vis. Exp. (177), e63332, doi:10.3791/63332 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter