Aqui, descrevemos um método detalhado para o isolamento das mitocôndrias do músculo esquelético do camundongo e a análise subsequente da respiração pela Taxa de Consumo de Oxigênio (OCR) usando assins respirométricos à base de microplacas. Este gasoduto pode ser aplicado para estudar os efeitos de múltiplas intervenções ambientais ou genéticas no metabolismo mitocondrial.
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Artigo de método
Isolamento das Mitocôndrias do Músculo Esquelético do Rato para Ensaios Respirométricos
Neste artigo
Resumo
Resumo
A maior parte da energia da célula é obtida através da degradação da glicose, ácidos graxos e aminoácidos por diferentes vias que convergem para o sistema de fosforilação oxidativa mitocondrial (OXPHOS), que é regulado em resposta às demandas celulares. A molécula lipídica Coenzyme Q (CoQ) é essencial nesse processo, transferindo elétrons para o complexo III na cadeia de transporte de elétrons (ETC) através de ciclos constantes de oxidação/redução. O estado mitocôndria e, em última análise, a saúde celular podem ser avaliadas medindo o consumo de oxigênio etc usando assistos respirométricos. Esses estudos são tipicamente realizados em linhas celulares estabelecidas ou primárias que foram cultivadas por vários dias. Em ambos os casos, os parâmetros de respiração obtidos podem ter se desviado de condições fisiológicas normais em qualquer determinado órgão ou tecido.
Além disso, as características intrínsecas das fibras únicas cultivadas isoladas do músculo esquelético impedem esse tipo de análise. Este artigo apresenta um protocolo atualizado e detalhado para a análise da respiração em mitocôndrias recém-isoladas do músculo esquelético do camundongo. Também fornecemos soluções para possíveis problemas que possam surgir em qualquer etapa do processo. O método aqui apresentado poderia ser aplicado para comparar as taxas de consumo de oxigênio em diversos modelos de camundongos transgênicos e estudar a resposta mitocondrial a tratamentos medicamentosos ou outros fatores como envelhecimento ou sexo. Este é um método viável para responder a perguntas cruciais sobre metabolismo e regulação bioenergetics mitocondrial.
Introdução
Mitocôndrias são as organelas metabólicas primárias na célula1. Essas organelas especializadas em membrana usam moléculas de nutrientes para produzir energia na forma de triphosfato de adenosina (ATP) por OXPHOS. Este processo se baseia na transferência de elétrons de moléculas de doadores em uma série de reações redox no ETC2. CoQ é o único lipídio ativo de redox que é endogenosamente produzido em todas as membranas celulares e lipoproteínas circulantes que mostra função antioxidante3. É um componente essencial do ETC, transferindo elétrons do complexo I e fadh2 dependentes de NADH II ....
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Protocolo
A coleta de camundongos e a coleta de tecidos foram realizadas por meio de protocolos aprovados pelo Comitê de Ética da Universidad Pablo de Olavide (Sevilla, Espanha; protocolos 24/04/2018/056 e 03/12/2021/033) de acordo com o Decreto Real Espanhol 53/2013, Diretiva Europeia 2010/63/UE, e outras diretrizes relevantes.
1. Preparação de estoques, buffers e reagentes para os ensaios de respiração
- Prepare as seguintes soluções de estoque, que podem ser armazenadas na temperatura indicada por meses. Use H2O ultrauso em todos os casos.
- Dissolver comprimidos de soro fisiológico tamponado de fosfato (P....
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Resultados
O protocolo aqui apresentado permite a análise in vivo da respiração mitocondrial através do isolamento das mitocôndrias do músculo esquelético do camundongo. Um esboço do método é mostrado na Figura 1. Após dissecar músculos esqueléticos das retalhos (Figura 2), os tecidos são homogeneizados e mitocôndrias purificadas, sob condições isotônicas, através de centrífugas em série. A pureza das diferentes frações obtidas durante o processo de isolamento pod.......
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Discussão
Todos os métodos utilizados para estudar a respiração mitocondrial têm suas limitações; portanto, é crucial selecionar o método que melhor se adequa a uma questão experimental específica. Este trabalho fornece um protocolo atualizado e detalhado para isolar mitocôndrias do músculo esquelético do rato para realizar diferentes ensaios respiratórios para investigar a função mitocondrial. De fato, o estudo de bioenergésicos mitocondriais mitocôndicos em mitocôndrias isoladas usando tecnologias baseadas em microplacas é valio.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm conflitos de interesse para divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos a Juan J. Tena pelo uso do homogeneizador e das instalações de Proteomia e Pecuária CABD para suporte técnico. Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Educação, Cultura e Esportes espanhol através da bolsa FPU16/03264 a J.D.H.C., a Associação Française contre les Myopathies (AFM) através do bolsa de estudos nº 22450 à C.V.-G., uma Subvenção Institucional MDM-2016-0687 (Unidade de Excelência Maria de Maeztu, Departamento de Regulação Genética e Morfogênese na CABD) e BFU2017-83150-P para J.J.C. A Junta de Andalucía concede P18-RT-4572, o Programa de Financiamento feder da União Europeia, e o Ministério da Ciência, Inovação e Universidades espanholas co....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| ADP | Sigma | A5285 | Estoque a -20 ° C |
| AKT anticorpo | Tecnologia de Sinalização Celular | C67E7 | Coelho (Espécie hospedeira) |
| anti-Cabra HRP | Sigma | 401504 | Coelho (Espécie hospedeira) |
| anti-Rato HRP | Cell Signaling | #7076 | Cavalo (Espécie hospedeira) |
| Antimicina A | Sigma | A8674 | Stock em -20 ° C |
| anti-Rabbit HRP | Cell Signaling | #7074 | Cabra (Espécie hospedeira) |
| Ácido ascórbico | Sigma | A5960 | Estoque em RT |
| Anticorpo de bactina | Sigma | MBS4-48085 | Cabra (Espécie hospedeira) |
| Kit de ensaio de proteína Bio-Rad II | Bio-Rad | 5000002 | Inclui 5x reagente Bradford e BSA de concentração conhecida para a curva padrão |
| BSA, fração V, Calbiochem Livre de Ácidos Graxos | 126575 | Stock a 4 & Tubo C | |
| C | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Tampa roxa |
| Anticorpo Calnexina | ThermoFisher | MA3-027 | Mouse (Espécie hospedeira) |
| D-manitol | Sigma | M4125 | Estoque em RT |
| EDTA | BDH | 280254D | Estoque em 4 ° C |
| EGTA | Sigma | E-4378 | Estoque em RT |
| FCCP | Sigma | C2920 | Estoque em -20 ° C |
| gentleMACS Dissociador | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Homogeneizador |
| HEPES | Sigma | H3375 | Estoque em RT |
| HSP70 anticorpo | Proteintech | 10995-1-AP | Coelho (espécie hospedeira) |
| LDH-A anticorpo Santa | Cruz Biotecnologia SC27230 | Cabra (espécie hospedeira) | |
| Cloreto de magnésio | ChemCruz | sc-255260A | Estoque em RT |
| Ácido málico | Sigma | P1645 | Estoque na RT |
| Espectrofotômetro de microplacas | BMG LABTECH GmbH | POLARstar OMEGA S/N 415-0292 | Estoque na RT |
| Água Milli-Q | Sistema Millipore | F7HA17757A | Água ultrapura |
| anticorpo mtTFA | Santa Cruz Biotecnologia SC23588 | Cabra (espécie hospedeira) | |
| Na+/K+-ATPase α 1 anticorpo | Novus Biologicals | NB300-14755 | Camundongo (Espécie hospedeira) |
| Oligomicina | Sigma | O4876 | Estoque a -20 ° C |
| Palmitoyl-L-carnitina | Sigma | P1645 | Stock a -20 ° C |
| PBS | comprimidos Sigma | P4417-100TAB | 1x estoque na RT |
| Di-hidrogenofosfato de potássio | ChemCruz | sc-203211 | Estoque na RT |
| Hidróxido de potássio | Sigma | 60377 | Estoque na RT |
| Ácido pirúvico | Sigma | 107360 | Estoque em 4 ° C |
| Rotenone | Sigma | R8875 | Estoque a -20 ° C |
| Seahorse XF24 analisador de fluxo mitocondrial | Agilent Technologies | 420179 | modelo XFe24 |
| Seahorse XFe24 FluxPak mini | Agilent Technologies | 102342-100 | O kit inclui cartuchos, microplacas e solução calibrante |
| Succinato | Sigma | S7626 | Estoque na RT |
| Sacarose | Sigma | S9378 | Estoque na RT |
| TIMM23 anticorpo | Abcam | ab230253 | Coelho (Espécie hospedeira) |
| TMPD | Sigma | T7394 | Stock a -20 ° C |
| TOMM20 anticorpo | Abcam | ab56783 | Camundongo (espécie hospedeira) |
| Anticorpo VDAC | Abcam | ab15895 | Coelho (espécie hospedeira) |
Referências
- Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
- Alberts, B., et al. The mitochondrion. Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , Garland Science. New York. (2002).
- Turunen, M.....
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Reimpressões e permissões
