Artigo de método

Bioprocesso adsortivo melhora o rendimento da melanina de Pseudomonas stutzeri

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DOI:

10.3791/63339

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12 de janeiro de 2022

 ,  , 
1Department of Chemical Engineering, National Institute of Technology, 2Department of Biotechnology, Manipal Institute of Technology

Neste artigo

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo sobre bioprocesso adsortivo para produzir um produto biológico, especialmente um pigmento que inibe sua própria biossíntese e inibe o crescimento do microrganismo que o produz.

Resumo

As melaninas são pigmentos naturais, e a presença de anel indol e vários grupos funcionais torna a melanina a escolha ideal para muitas aplicações, como agentes de proteção UV, cuidados com a pele, cosméticos, etc. Um Pseudomonas stutzeri marinho produz melanina sem a adição de tirosina. A inibição do feedback foi observada pela melanina no cultivo de uma bactéria marinha produtora de melanina, Pseudomonas stutzeri. A melanina também demonstrou inibição do crescimento microbiano. A análise baseada no modelo Han-Levenspiel identificou a inibição não competitiva da melanina no crescimento celular. A enzima tirosinase, que produz melanina, foi inibida pela melanina. O gráfico recíproco duplo da reação enzimática na presença de diferentes concentrações de melanina revelou inibição não competitiva do produto. Um bioprocesso adsortivo baseado em adsorvente foi desenvolvido para reduzir a inibição de feedback pela melanina. Diferentes adsorventes foram selecionados para selecionar o melhor adsorvente para adsorção de melanina. A quantidade e o tempo de dosagem foram otimizados para desenvolver o bioprocesso de adsorção, o que resultou em um aumento de 8,8 vezes na produção de melanina pela bactéria marinha Pseudomonas stutzeri (153 mg/L a 1349 mg/L) sem suplementação de tirosina e extrato de levedura.

Introdução

As melaninas são compostos polifenóis cuja unidade monomérica é o anel indol. As melaninas são responsáveis pela maioria das colorações preta, marrom e cinza de plantas, animais e microrganismos1. As melaninas mais comuns são as eumelaninas, que são pigmentos marrom-escuros ou pretos amplamente distribuídos em vertebrados e invertebrados2. Cefalópodes, plantas e micróbios são as principais fontes de melanina3. A melanina obtida a partir de microrganismos tem várias vantagens sobre a melanina de cefalópodes e plantas. Eles são rápidos em crescimento e não causam problemas de variações sazonais. Além disso, eles se modificam de acordo com o meio de crescimento e as condições operacionais fornecidas. Considerando todos esses fatos, as fontes microbianas são exploradas como uma importante fonte de melanina com potenciais aplicações comerciais 4,5,6. Guo et al. usaram Streptomyces kathirae SC-1 recombinante para produzir melanina de até 28,8 g/L em meio otimizado7. Lagunas-Muñoz et al. Obteve cerca de 6 g/L de melanina em E. coli recombinante 8. Wang et al. obtiveram cerca de 4,2 g/L de melanina solúvel após otimização do meio9. Os pesquisadores também investigaram culturas marinhas para produzir melanina. Kiran et al. produziram melanina a partir de espécies marinhas de Pseudomonas 10. Kumar et al. isolaram Pseudomonas stutzeri HMGM-7 de algas marinhas, que produziram melanina em caldo nutritivo. Todos os produtores de melanina relatados requerem suplementos de meio, extrato de levedura e/ou peptona para a produção de melanina, o que pode dificultar o aumento de escala do bioprocesso. Raman et al. investigaram a produção de melanina a partir de Aspergillus fumigatus AFGRD105, que não exigiu aditivos caros11.

Uma bactéria marinha conhecida como Pseudomonas stutzeri, isolada de algas marinhas, foi selecionada para a produção de melanina. Este microrganismo não requer suplementação adicional de tirosina e extrato de levedura para a produção de melanina solúvel e cresce em meios à base de água do mar, reduzindo assim a pegada hídrica potável e o custo médio. Thaira et al. relataram um bioprocesso otimizado usando farinha de bolo de coco para produção de nanopigmento de melanina usando essa bactéria marinha em uma publicação anterior12. A melanina produzida foi usada para a remoção altamente eficiente de metais pesados das águas subterrâneas sintéticas. No entanto, durante a otimização do meio, foi identificada uma inibição plausível do feedback da melanina no crescimento e na formação do produto. Portanto, neste protocolo, a inibição de feedback da melanina é investigada e quantificada usando o modelo generalizado de Han-Levenspiel. Um protocolo de bioprocesso adsortivo simples e eficaz é desenvolvido para reduzir ao máximo a inibição do feedback.

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Protocolo

1. Crescimento e manutenção da cultura de Pseudomonas stutzeri .

  1. Obtenha a bactéria Pseudomonas stutzeri do MTCC Chandigarh (fornecido como ampola liofilizada).
    1. Desinfete a superfície da ampola com álcool (70%). Marque a ampola perto do meio do medidor e quebre na área marcada.
      NOTA: Deve-se ter cuidado ao abrir a ampola, pois o conteúdo está no vácuo. Tome precauções ao quebrar a ampola, pois uma abertura de encaixe puxará o tampão de algodão para uma extremidade e uma abertura apressada liberará as partículas finas liofilizadas do micróbio no ar.
    2. Remova cuidadosamente o tampão de algodão com uma pinça esterilizada e adicione 0,3 mL de caldo Luria Bertani (LB) à ampola. Deixe repousar por 30 min.
    3. Inocular 100 μl da suspensão para 10 ml de caldo LB (em balão cónico de 100 ml) e colocá-lo no agitador da incubadora a 180 rpm mantido a 37 °C. Transferir simultaneamente 100 μL da suspensão para o ágar LB sólido e espalhar para obter colónias isoladas. Incubar a 37 °C durante a noite.
  2. Quando a cultura crescer, armazene-a a 4 °C.
  3. Faça a subcultura a cada 4 semanas, colocando uma colônia em uma placa de ágar LB fresca e incubando a placa a 37 ° C durante a noite para que as colônias apareçam.

2. Estudos de inibição da melanina no crescimento e na atividade enzimática

  1. Prepare o meio de cultura adicionando 51,4 g/L de glicose, 49,8 g/L de farinha de bolo de coco, 0,09 g/L, 0,03 g/L e 0,05 g/L de CuSO4, FeSO4 e MgSO4, respectivamente, em água do mar artificial (Tabela de Materiais). Realizar todas as experiências num balão agitado de 250 ml com volume de enchimento de 15 ml a 200 rpm, 37 °C e pH inicial de 7.
  2. Adicione diferentes concentrações de melanina (100 mg/L, 200 mg/L, 500 mg/L e 1000 mg/L) em cada meio de cultura no início do bioprocesso.
  3. Meça a taxa de crescimento específico, a atividade enzimática das células e a melanina em diferentes intervalos de tempo do bioprocesso para cada concentração de melanina adicionada (seção 3.2).

3. Modelação da cinética de inibição da melanina

  1. Use a seguinte equação generalizada de Han e Levenspiel13 para modelar a cinética de inibição da produção de melanina,
    figure-protocol-1 (1)
    Onde
    μ = taxa de crescimento específico aparente (1/h)
    μmax = taxa máxima de crescimento específico (1/h)
    p = concentração do produto (g/L)
    p *= concentração crítica do produto na qual o crescimento cessa (g/L)
    s = concentração do substrato (g/L)
    m,n = parâmetros
    A equação acima pode ser reescrita como
    figure-protocol-2 (2)
    Onde
    figure-protocol-3 (3)
    e figure-protocol-4 (4)
    A equação acima pode ser reorganizada para um gráfico recíproco duplo de 1/μ versus 1/s, conforme indicado abaixo
    figure-protocol-5 (5)
  2. Desenhe uma linha reta usando os dados de diferentes taxas de crescimento específicas e concentrações de substrato usando a equação acima. A interceptação no eixo Y e X, respectivamente, dá μmax e Ks, que podem ser substituídos nas equções 3 e 4, respectivamente, para obter μobs e Kobs.
    A equação (3) pode ser escrita como
    figure-protocol-6 (6)
  3. Calcule a taxa de crescimento específico da cultura cultivada na etapa 2.2 e nomeie-a como μobs.
  4. Utilizar o valor da taxa de crescimento específico obtido no passo 3.3 da equação (6). Ajuste os dados a uma equação linear e calcule a inclinação e a interceptação.
  5. Utilizar a equação (3) para calcular a taxa máxima de crescimento específico na ausência de melanina.

4. Desenvolvimento do bioprocesso adsortivo

  1. Realizar todas as experiências num balão agitado de 250 ml com volume de enchimento de 15 ml a 200 rpm, 37 °C e pH inicial de 7.
  2. Conduza o bioprocesso final otimizado em um biorreator de tanque agitado de 5 L com um volume de arquivamento de 3 L. Manter o pH da cultura entre 7-7,5 e o oxigênio dissolvido entre 50%-60% da saturação nos estudos do biorreator.

5. Seleção do melhor adsorvente entre diferentes adsorventes disponíveis

  1. Adicione diferentes adsorventes, como alumina, zeólita, celita, terra de Fuller e carvão ativado em diferentes frascos contendo o caldo de cultura.
  2. Adicionar cada adsorvente separadamente ao caldo de cultura a uma concentração de 1 g/l e mantê-lo num agitador rotativo a 150 rpm durante 12.
  3. Separar os adsorventes por centrifugação a 5000 x g durante 10 min e medir a absorvância do sobrenadante a 400 nm com um espectrofotómetro.
  4. Selecione o adsorvente que adsorve a quantidade máxima de melanina do caldo de cultura.

6. Efeito do tempo de dosagem do adsorvente

  1. Inicie o bioprocesso e adicione o adsorvente produzindo a maior adsorção de melanina da cultura (selecionada após a seção 5). A concentração selecionada na etapa inicial é de 1 g/L.
  2. Medir a produção máxima de melanina de acordo com o protocolopublicado anteriormente 12.
  3. Repita a etapa 6.1 adicionando o adsorvente após 12 h do início do bioprocesso e meça a produção de melanina em diferentes momentos do bioprocesso.
  4. Repita a etapa 6.3 adicionando o adsorvente após 24 h, 36 h e 48 h do início do bioprocesso.
  5. Compare a melanina produzida em cada bioprocesso e identifique o melhor tempo de dosagem para a máxima produção e recuperação de melanina.

7. Efeito da quantidade de dosagem de adsorvente

  1. Adicionar diferentes concentrações do melhor adsorvente (0,5, 1, 2, 4, 6, 8 e 10 g/L) às culturas no momento identificado na secção 6.
  2. Colha o bioprocesso por centrifugação a 5000 x g por 10 min.
  3. Recolher o sobrenadante e calcular a quantidade de melanina medindo a absorvância a 400 nm.
  4. Lave o pellet contendo adsorvente duas vezes cada com água destilada e etanol para remover células e outros compostos ligados ao adsorvente. Execute a etapa de lavagem por centrifugação a 5000 x g por 10 min.
  5. Adicione uma solução de NaOH 0,1 M ao adsorvente lavado para dessorver a melanina.
  6. Centrifugar a mistura a 5000 x g durante 10 minutos e medir a quantidade de melanina no sobrenadante a 400 nm com um espectrofotómetro.
  7. Repita o processo de dessorção três vezes ou até que o adsorvente volte à sua cor normal.
  8. Reduza o pH desta solução concentrada de melanina dessorvida para 3 ou menos adicionando 1 N HCl usando um agitador com esferas magnéticas para precipitar a melanina. Armazene a solução ácida na geladeira por 1 h para aumentar a precipitação, se necessário.
  9. Lavar três vezes a melanina precipitada assim obtida com água destilada por centrifugação a 5000 x g durante 10 min, secar e conservar a 4 °C.

8. Modelagem matemática do bioprocesso

  1. Cinética de crescimento da biomassa
    1. Quantificar a taxa de crescimento da biomassa utilizando o seguinte modelo de Verhulset modificado desenvolvido para a inibição do produto, conforme descrito pela equação a seguirindicada 14,15,16,17,
      figure-protocol-7 (7)
      Onde
      x = concentração de biomassa (g/L)
      xm = concentração máxima de biomassa (g/L)
      μobs = taxa máxima de crescimento específico (1/h) dada pela equação (2)
      Vazques et al. (2008) derivaram ainda a seguinte equação para a concentração de biomassa da equação (7)
      figure-protocol-8 (8)
      Onde
      vx = taxa de crescimento da biomassa (g/L/h) = μobs·x
      μobs       = taxa de crescimento específico observada (1/h)
      τx = tempo de atraso (h)
      t = tempo (h)
    2. Use a Equação (8) para calcular a concentração de biomassa em diferentes momentos do bioprocesso e simular o perfil de crescimento de Pseudomonas stutzeri.
  2. Cinética de consumo de substrato
    NOTA: O substrato é usado para crescimento de biomassa, formação de produtos e manutenção em um bioprocesso.
    1. Use a seguinte equação para equilibrar a utilização do substrato no bioprocesso,
      figure-protocol-9 (9)
      A maior parte da glicose é usada para geração de biomassa; portanto, para simplificar, negligenciar o consumo de substrato para a formação do produto reduziria a equação (9) a,
      figure-protocol-10 (10)
      Onde
      S = concentração do substrato (g/L)
      YP/S = coeficiente de rendimento do produto, ou seja, coeficiente de rendimento de melanina (g/g)
      P = concentração do produto (g/L), ou seja, concentração de melanina (g/L)
      YX/S = coeficiente de rendimento de biomassa (g/g)
      ms = coeficiente de manutenção (g/g/h)
      Integrando a equação acima do tempo t = 0 ao tempo t = t, e substituindo o valor de x da equação (8) obtém-se a seguinte equação para o perfil de concentração do substrato17,
      figure-protocol-11 (11)
      Onde, s0 = concentração inicial do substrato (g/L) e x0 = concentração inicial de biomassa (g/L)
    2. Use a equação (11) para calcular a concentração de substrato em diferentes intervalos de tempo do bioprocesso ou, se a concentração de substrato for conhecida, use a mesma equação para estimar os parâmetros fornecidos na equação.
  3. Cinética de produção de melanina
    1. Use a equação Ludeking-Pirate para simular a produção de melanina. No entanto, a melanina está associada ao crescimento e, portanto, o termo de formação de produto não associado ao crescimento é negligenciado, e a equação simplificada pode ser escrita como,
      figure-protocol-12 (12)
      Onde
      α = constante Ludeking-Pirate ligada à formação de produtos associados ao crescimento (g/g)
      A equação de integração (12) do tempo t = 0 a t = t resulta na seguinte equação para o perfil de concentração do produto
      figure-protocol-13 (13)
    2. Use a equação (13) para calcular α.
  4. Estimativa de parâmetros cinéticos
    1. Estime todos os parâmetros mencionados acima pelo método não linear de estimativa de parâmetros usando qualquer ferramenta de software adequada (por exemplo, ferramenta de resolução do Microsoft Excel).
    2. Use dados de experimentos em lote para estimativa de parâmetros e minimize a soma do erro quadrado (SSE) usando a ferramenta Solver, conforme fornecido pela equação a seguir,
      Minimizar
      figure-protocol-14 (14)
      Onde
      xsim = valor simulado e xexp = valor experimental

9. Técnicas analíticas

  1. Extração de melanina
    1. Centrifugue a cultura de crescimento a 5000 x g por 10 min para remover a biomassa.
    2. Adicione um volume igual de 1 M NaOH ao sobrenadante.
    3. Acidifique o sobrenadante alcalino a pH 2 adicionando 1 N HCl para precipitar a melanina.
    4. Centrifugar o sobrenadante acidificado a 12000 x g durante 20 min para recolher a melanina.
    5. Lave a melanina coletada três vezes com 5 mL de água destilada, seque durante a noite em temperatura ambiente (RT) e armazene a 4 ° C18.
  2. Quantificação de melanina
    1. Preparar diferentes concentrações de soluções de melanina (0-500 mg/l) dissolvendo a quantidade adequada de melanina em água do mar artificial (pH 8).
    2. Medir a absorvância a 400 nm com o espectrofotómetro18.
    3. Prepare a curva de calibração usando os dados acima.
    4. Centrifugar a cultura de crescimento a 5000 x g durante 10 minutos para remover a biomassa e medir a absorvância do sobrenadante a 400 nm. Calcular a concentração de melanina na cultura de crescimento utilizando a curva de calibração preparada no passo 9.2.3
  3. Ensaio de tirosinase
    1. Siga o protocolo fornecido abaixo para o ensaio da enzima tirosinase desenvolvido por Ren et al. (2013)19 para determinar a atividade enzimática da tirosinase extraída do caldo de cultura de Pseudomonas stutzeri .
    2. Centrifugue a cultura bacteriana a 5.000 x g para coletar as células.
    3. Sonicar as células em tampão fosfato frio a 100 mM de pH 6,5 e centrifugar o homogeneizado a 9000 x g durante 15 min e recolher o sobrenadante, uma fonte de enzima tirosinase.
    4. Adicione 0,2 ml da solução enzimática obtida no passo acima a 2,8 ml de tampão fosfato de sódio 0,1 M (pH 6,5) contendo 1 mM de L-tirosina (substrato).
    5. Observe a formação de dopacromo medindo a absorbância a 475 nm.
    6. Calcule a atividade da tirosinase da seguinte forma. Uma unidade internacional (UI) de atividade da tirosinase é definida como a quantidade de enzima necessária para oxidar 1 μmol de L-tirosina em dopacromo por minuto. Calcule isso usando o coeficiente de extinção molar do dopacromo (3600 L · M-1 · cm-1) pela seguinte equação,
      figure-protocol-15 (15)
  4. Estimativa de biomassa
    1. Colete 5 mL das amostras em um intervalo de 4 h no gabinete de Biossegurança, mantendo a esterilidade. Acenda o tampão de algodão do frasco antes e depois da coleta das amostras para reduzir as chances de contaminação. Meça a densidade óptica (OD) das amostras a 660 nm para todas essas amostras.
      NOTA: O meio não inoculado serve como branco. Essas leituras serão usadas para estudar o crescimento dos microrganismos.
    2. Centrifugar o caldo de cultura a 5000 x g durante 10 min e 4 °C, recolher o sedimento e secar o sedimento durante 8 h a 60 °C numa estufa de ar quente para obter a massa de células secas.
    3. Preparar a curva de calibração utilizando a DO medida no passo 9.4.1 e a biomassa correspondente obtida no passo 9.4.2
    4. Use a curva de calibração (OD = 0.82٠Biomassa (g/L)) para medir a quantidade desconhecida de biomassa medindo a densidade óptica do caldo de cultura a qualquer momento.
  5. Estimativa de DNA
    1. Estime a quantidade de DNA na amostra medindo a densidade óptica a 260 nm.
    2. Calcular o ADN utilizando a seguinte fórmula:
      figure-protocol-16 (16)
      Onde
      A260= Absorbância a 260 nm
      0,1 = Volume da amostra
      1 = Absorvância da solução-padrão de ADN de concentração de 50 μg/ml, a 260 nm
  6. Estimativa de proteína
    1. Estime a quantidade de proteína nas amostras usando um kit de estimativa de proteína de Bradford (Tabela de Materiais).
    2. Adicione 5 mL do reagente de Bradford a 0,1 mL do sobrenadante e mantenha por 5 min. As proteínas presentes no sobrenadante reagem com o reagente de Bradford para formar um complexo colorido.
    3. Medir a absorvância a 595 nm20 com o espectrofotómetro.
  7. Estimativa do açúcar redutor total (TRS)
    1. Meça o TRS pelo método dinitrosalicílico (DNS)21.
    2. Preparar a solução de DNS dissolvendo 1 g de DNS em 50 ml de água destilada. Adicionar 30 g de tartarato de sódio e potássio a esta solução em pequenas quantidades até que a cor da solução se torne amarelo leitoso, seguido de amarelo-alaranjado transparente com a adição de 20 ml de NaOH 2 N. Aumente o volume para 100 mL usando água destilada e armazene-o no escuro.
    3. Preparar a solução de trabalho de glicose (0,01 M) dissolvendo 180 mg de glicose em 100 ml de água destilada num balão normal.
    4. Pipete a solução de glicose padrão (0,2, 0,4, 0,6, 0,8 e 1 mL) em 5 tubos de ensaio separados. Use um tubo de ensaio contendo água destilada (1mL) como solução em branco.
    5. Aumente o volume para 2 mL em cada tubo de ensaio usando água destilada.
    6. Adicione 1 mL de reagente DNS a cada tubo de ensaio e cubra com papel alumínio.
    7. Aqueça os tubos de ensaio em banho-maria fervente por 5 min e deixe esfriar até RT.
    8. Adicione 9 mL de água destilada a cada tubo de ensaio e misture bem. Medir a DIÂMETRO externo do conteúdo a 575 nm utilizando um espectrofotómetro.
    9. Meça a concentração usando uma tabela de calibração preparada com a quantidade de glicose no eixo X versus absorbância a 575 nm (A575) no eixo Y.
  8. Análise de tamanho de partícula
    1. Dispersar a melanina biossintetizada em água destilada (1 ml) utilizando um sonicador.
    2. Adicione a solução de amostra dispersa (1 mL) no analisador de nanopartículas e meça o tamanho da partícula de acordo com o protocolo do fabricante.
  9. Análise de Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)
    1. Secar o pó de melanina obtido após a extracção, mantendo-o a 60 °C durante 8 h.
    2. Carregue o pó de melanina na matriz de amostra TEM e meça o tamanho usando o microscópio eletrônico de transmissão seguindo o protocolo do operador.

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Resultados

A Figura 1A,B demonstra o crescimento e a produção de melanina sob a influência de diferentes concentrações iniciais de melanina. O crescimento celular e a produção de melanina diminuíram substancialmente com o aumento da concentração inicial de melanina. Na concentração inicial de melanina de 500 mg/L no meio, a biomassa e a melanina reduziram para quase 50% do valor máximo obtido no controle. A 1000 mg/L de concentração inicial de melanina, houve produção marginal de melan...

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Discussão

A inibição do produto é um grande gargalo no bioprocessamento, o que leva à redução da produtividade. Existem vários métodos para reduzir a inibição do produto, como bioprocesso contínuo e técnicas de remoção de produto in situ. No entanto, essas opções requerem uma revisão completa da instalação de bioprocessamento existente 23,24,25,26,27,28.

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Divulgações

Os autores não têm nenhum conflito de interesse

Agradecimentos

Agradecemos ao Departamento de Ciência e Tecnologia (DST/TSG/WP/2014/58), à Índia e ao Instituto Nacional de Tecnologia de Karnataka por fornecer financiamento para o desenvolvimento do protocolo acima.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
  Alumina + A15A26A3: A13A3: A16A3: A17HiMediaGRM1909
Carvão ativadoHiMediaPCT1001
Água do mar artificial MeioHiMediaM1942
Kit de reagentes BradfordHiMediaML106
CeliteHiMediaGRM226
CentrífugaREMICM-8
Tubos de centrífugaHiMediaPW1207
Ácido dinitrosalicílicoHiMediaGRM1582
Balão ErlenmeyerBorosil4980021
terra de fullerHiMediaGRM232
GlicoseHiMediaMB037
HClHiMediaAS004
L-tirosinaHiMediaRM069
Microsoft ExcelMicrosoft
Analisador de nanopartículasHORIBA ScientificNanopartica SZ-100
Meio de ágar nutrienteHiMediaM001
Placa de PetriHiMediaPW054
Tampão de fosfatoHiMediaM1452
Hidróxido de sódioHiMediaMB095
EspectrofotômetroThermofisherGenesys 10
Biorreator de tanque agitadoScigenicsBioferm LS
TE BufferHiMediaML060
Microscópio Eletrônico de TransmissãoJEOLJEM-2100
ZeólitaHiMediaGRM3834

Referências

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