Isolamento de células-tronco mesenquimais de tecido adiposo de rato para diferenciação em células produtoras de insulina

As células-tronco mesenquimais (MSCs), também conhecidas como células estromais mesenquimais, estão entre os tipos de células mais amplamente utilizados para a medicina regenerativa ^1,2. São classificadas como células-tronco adultas e caracterizadas pelo potencial de diferenciação multilineagem e capacidade de auto-renovação³. Os MSCs podem ser isolados e obtidos de várias fontes, incluindo tecido adiposo, medula óssea, sangue periférico, tecido do cordão umbilical e sangue, folículos capilares e dentes ^4,5.

O isolamento das células-tronco do tecido adiposo é visto como atraente e promissor devido ao seu fácil acesso, rápida expansão in vitro e alto rendimento⁶. As células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo (Ad-MSCs) podem ser isoladas de diferentes espécies, como humanos, bovinos, ratos, ratos e, mais recentemente, cabras⁷. Foi comprovado que os Ad-MSCs são agora potenciais candidatos à engenharia de tecidos e terapia gene/célula que podem até ser usados para desenvolver uma alternativa autóloga para a reparação a longo prazo de lesões de tecido mole ou defeitos ^7,8.

A Sociedade Internacional de Terapia Celular e Genética (ISCT) definiu três critérios mínimos que devem ser apresentados pelos MSCs para caracterização completa⁹. Primeiro, eles devem ser adeptos de plástico. Em segundo lugar, os MSCs devem expressar marcadores de superfície de células-tronco mesenquimais como CD73, CD90 e CD105 e falta de expressão dos marcadores hematopoiéticos CD45, CD34, CD14 ou CD11b, CD79α ou CD19 e HLA-DR. Finalmente, os MSCs devem exibir a capacidade de diferenciar-se nas três linhagens mesenquimais: adipócitos, osteocitos e condrócitos. Curiosamente, os MSCs também podem se diferenciar em outras linhagens, como células neuronais, cardiomiócitos, hepatócitos e células epiteliais^10,11.

De fato, os MSCs possuem propriedades únicas que lhes permitem ser aplicados como potenciais agentes terapêuticos na terapia regenerativa para diferentes doenças. Os MSCs podem segregar fatores solúveis para induzir um ambiente imunomodulatório que proporciona benefícios terapêuticos¹². Além disso, os MSCs podem migrar para locais de lesões e microambientes tumorais para fornecer terapia direcionada; no entanto, os mecanismos não são totalmente elucidados¹³. Além disso, os MSCs têm a capacidade de segregar exosósmos, vesículas extracelulares na nanoescala que carregam uma carga de RNAs não codificantes, proteínas e fatores solúveis, que recentemente surgiram como um novo mecanismo do potencial terapêutico dos MSCs em várias doenças¹⁴.

Mais importante, os MSCs têm gerado atenção marcante para seu potencial de diferenciação em células produtoras de insulina (IPCs), seja por modificação genética^15,16 ou através da utilização de vários fatores indutores extrínsecos dentro da mídia cultural in vitro¹⁷. O período de indução do IPC varia muito, pois depende do protocolo de indução utilizado e dos fatores extrínsecos utilizados. O processo de diferenciação pode durar de dias a meses, e requer uma combinação de fatores indutores exógenos que devem ser adicionados e/ou retirados em diferentes estágios. Muitos desses fatores que têm sido utilizados para a diferenciação pancreática endócrina são compostos biologicamente ativos que têm sido mostrados para promover a proliferação ou diferenciação/neogênese de células β e/ou aumentar o teor de insulina dos IPCs 18,19,20,21. Vale ressaltar aqui que os MSCs também têm tido efeitos terapêuticos no diabetes e suas complicações através de diversos mecanismos, incluindo seu secretome, bem como uma ampla gama de ações imuno-modulatórias 22,23,24.

Neste protocolo, apresentamos um protocolo passo detalhado para o isolamento e caracterização de Ad-MSCs a partir de gordura epidídica de ratos, seguido por um protocolo simples e relativamente curto para a geração de IPCs a partir de Ad-MSCs.

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas, e todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética da Faculdade de Farmácia, Universidade Britânica no Egito (BUE), Cairo, Egito. O protocolo de isolamento Ad-MSC foi adotado por Lopez e Spencer, com modificações¹⁵.

1. Isolamento de Ad-MSCs de almofadas de gordura epidídica de ratos

1. Use ratos sprague-dawley machos pesando 250-300 g que não têm mais de 1 mês de idade (dois por isolamento). Anestesiar os animais, então eutanásia-los por deslocamento cervical. Pulverizar o animal eutanizado com 70% de etanol. Extirpa a pele e o músculo na parte inferior do abdômen, e depois retire os dois testículos para expor as almofadas de gordura epidídica.
2. Corte suavemente as almofadas de gordura epidídica e tenha cuidado para não cortar os vasos sanguíneos.
3. Isole o tecido adiposo ao redor da epidídico, em seguida, coloque-o em uma placa de Petri contendo soro fisco tamponado por fosfato (PBS).
4. No armário de biossegurança, corte essas almofadas de gordura em pequenos pedaços usando fórceps e bisturi. Transfira estes pedaços de tecido adiposo cortados em um tubo centrífuga de 50 mL contendo 10 mL de PBS estéril.
5. Lave os tecidos de gordura picados 5 vezes com 10 mL de PBS cada vez para remover o sangue contaminante. Os seguintes procedimentos de lavagem devem ser meticulosamente realizados.
   1. Adicione 10 mL de PBS ao tecido e misture bem por 45 s. Em seguida, deixe o tecido se estabelecer através da gravidade mantendo o tubo em pé por 5 minutos para se separar em duas camadas.
   2. Aspire o PBS do infranatante utilizando uma seringa de 10 ml e substitua por 10 mL fresco de PBS para outra lavagem.
   3. Repita esta etapa de lavagem 4-5 vezes até que o PBS esteja livre de sangue. Isso indica que a maioria, se não todos, do sangue é removido.
6. Após a lavagem, resuspenque o tecido adiposo em 10 mL de solução de colagenase (0,1% colagenase tipo 1 em PBS). Sele o tubo firmemente com parafilm, depois incuba-o em um banho de água tremendo (37 °C, 80 rpm, por 45 min) até que o tecido seja quase homogêneo.
   NOTA: Evite a digestão completa do tecido (quando a solução se torna completamente homogênea com o desaparecimento completo de todos os resíduos/pedaços de tecido), pois afeta negativamente a cultura das células posteriormente. Normalmente, a digestão leva de 30 a 45 minutos.
7. Uma vez que a digestão da colagemnase é feito, vórtice do tubo para 15 s, em seguida, centrífuga por 5 min a 300 x g. Vórtice o tubo novamente para 10 s, seguido por outra centrifugação de 5 min. Em seguida, serão observadas três camadas. Descarte cuidadosamente a camada de óleo, seguida pela camada aquosa, sem perturbar a pelota de fração vascular estromida (SVF).
   NOTA: Remova o supernatante contendo adipócitos e a solução de colagemnase. Primeiro, remova os adipócitos e a camada de óleo que acompanha com uma pipeta de 10 mL para garantir a remoção completa das gotículas de óleo e, em seguida, remova a camada aquosa por baixo.
8. Resuspenque a pelota SVF na parte inferior do tubo em 10 mL de solução BSA estéril (1% de albumina, solução de fração V de soro bovino em PBS), depois centrifugar o tubo por 5 min a 300 x g.
9. Após a centrifugação, descarte o supernascimento e suspenda a pelota SVF em 8,5 mL de mídia completa para Ad-MSCs (composta por dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mix F-12 [DMEM/F12] complementada com 10% de FBS, Penicilina U/mL 100 U/mL, 100 μg/mL streptomicina, 0,25 μg/mL anfotericina B e 2 mM L-glutamina).
10. Cultue as células em um frasco de^{25 cm 2} a 37 °C abaixo de 5% de CO_2. No dia seguinte, verifique as células anexadas, remova as células suspensas e substitua a mídia. Depois, mude a mídia dia não.
11. Passagem as células a cada 5-7 dias quando elas são 80%-90% confluentes usando Trypsin-EDTA. Use células entre as passagens 3-5 para os experimentos subsequentes descritos neste protocolo. Uma apresentação esquemática de todas as etapas de isolamento é fornecida na Figura 1.
    NOTA: Normalmente, a potência trypisn-EDTA pode variar entre diferentes fornecedores, por isso tente minimizar o tempo de experimentação para evitar efeitos tóxicos nas células.

2. Caracterização de Ad-MSCs por imunofenofoteping utilizando análises de citometria de fluxo

1. Na passagem 3, divida as células usando Trypsin-EDTA. Lave com PBS 2 vezes e conte as células com um hemótmetro.
2. Incubar 100.000 células a 4 °C no escuro por 20 min com cd90 ou CD105 (marcadores mesenquimais) ou anticorpo monocloiético CD34 (marcador hematopoiético) rotulado com fluoresceína-isothiocyanato (FITC).
3. Lave as células e suspenda-as em 500 μL de tampão FACS. Análise por citometria de fluxo²⁵.

3. Avaliação do potencial de diferenciação de Ad-MSCs isolados em várias linhagens mesenquimais

1. Diferenciação adipogênica
   1. Resuspend as células em mídia completa (como descrito na etapa 1.9.), em seguida, cultura as células a uma densidade de 3,7 x 10⁴ células/bem em uma placa de cultura tecidual de 24 poços. Incubar a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO₂. Em seguida, mude a mídia a cada 3 dias até que as células atinjam quase 100% de confluência, o que geralmente leva 3 dias.
   2. Quando as células atingirem a confluência desejada, substitua a mídia de proliferação pelo media de diferenciação adipogênica (consistindo de mídia LG-DMEM complementada com 10% de FBS, Penicilina U/mL 100 μg/mL, 0,25 μg/mL de anfonotericina B e 2 mM L-glutamina com suplemento adipogênico 1x, fornecido com o Kit de Identificação Funcional de Células-Tronco Mesenquimal) para induzir adipogenese. Em seguida, mude a mídia a cada 3 dias (0,5 mL/well). Tome cuidado para realizar a substituição da mídia suavemente para não interromper os vacuoles lipídes.
   3. Após 21 dias, avalie a diferenciação adipogênica por exame microscópico da aparência de vacuoles lipídicos e pela coloração do Vermelho-Óleo.
   4. Prepare uma solução de estoque de Óleo Vermelho dissolvendo 30 mg de mancha vermelha de óleo em 10 mL de isopropanol, e depois mantenha-a por pelo menos 20 minutos em temperatura ambiente. Depois, prepare uma solução de trabalho misturando 3 peças de solução de estoque com 2 peças de água dupla destilada (ddH₂O), misture-as bem e mantenha-a por 10 minutos à temperatura ambiente, depois depois depois por papel filtro.
   5. Para documentar a diferenciação adipogênica, lave as células 2 vezes com PBS e, em seguida, fixe-as usando formalina tamponada neutra 10% (0,75 ml/bem) por 15 minutos. Depois disso, lave as células 2 vezes com PBS usando 1 mL/poço e incuba as células por 5 minutos cada vez. É importante aspirar completamente o PBS antes de adicionar a solução de trabalho Oil Red.
   6. Após a última lavagem, adicione a solução de trabalho Oil Red às células e incuba-as por 60 min a 37 °C. Depois, remova a solução de manchas e lave suavemente as células 2 vezes com PBS. Observe as gotículas lipídicas manchadas sob o microscópio.
2. Diferenciação osteogênica
   1. Semente 7,4 x 10³ células/bem (0,5 mL médio/bem) em uma placa de 24 poços e incuba-las a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO₂ em mídia completa (como descrito na etapa 1.9.) por 3 dias para atingir quase 70% de confluência.
   2. Induzir as células com o suplemento osteogênico (fornecido com o kit) em mídia LG-DMEM suplementada com 10% de FBS, penicilina U/mL, 100 μg/mL estreptomicina, 0,25 μg/mL amphoterina B e 2 mM L-glutamina.
   3. Continue a indução osteogênica por 21 dias, mudando a mídia de diferenciação a cada 3 dias.
   4. Prepare uma solução de trabalho da mancha Alizarin Red S dissolvendo 200 mg de mancha De Alizarin Em 9 mL de ddH₂O, e depois ajuste o pH para 4.1-4.3 usando hidróxido de amônio e HCl. Em seguida, compor o volume para 10 mL por ddH₂O. Na sequência, remova quaisquer precipitados por filtragem usando papel filtro.
   5. Lave as células 2 vezes com PBS e, em seguida, fixe-as usando formalina 10% tamponada (0,75 mL/bem) por 15 minutos. Depois, lave as células 2 vezes usando PBS (1 mL/well). Cada vez, incuba as células por 5 minutos.
   6. Incubar as células fixas com a solução Alizarin-Red S preparada de 2% para 30 min em uma incubadora de 37 °C.
   7. Depois disso, remova a solução de manchas, lave as células 2 vezes com ddH₂O e uma vez com PBS, e então observe a matriz extracelular rica em cálcio manchada para avaliar a diferenciação osteogênica sob o microscópio.
3. Diferenciação condrogênica
   1. Sementes 7,4 x 10³ células/bem (0,5 mL médio/bem) em uma placa de 24 poços e incuba-las a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO₂ em mídia completa (como descrito na etapa 1.9.) por 3 dias para atingir quase 70% de confluência.
   2. Quando a confluência desejada for alcançada, induza a diferenciação condrogênica das células com DMEM/F12 sem soro contendo selênio de insulina-transferrina (ITS), suplemento condrogênico (fornecido com o kit), penicilina u/mL 100, Estreptomicina 100 μg/mL, 0,25 μg/mL de anfotericina B e 2 mM L-glutamina²¹.
   3. Incubar as células com a mídia condrogênica por 21 dias, alterando a mídia de diferenciação condrogênica a cada 3 dias.
   4. Prepare uma solução de trabalho da mancha Alcian Blue 8GX da seguinte forma: Primeiro, prepare uma solução de ácido acético glacial de 3% em ddH₂O adicionando 3 mL de ácido acético glacial a 97 mL de ddH₂O. Em seguida, prepare uma solução de trabalho da mancha Alcian Blue 8GX misturando 0,1 g em 100 mL de solução de ácido glacial de 3% e remova quaisquer precipitados por filtragem usando papel filtro.
   5. Lave as células 2 vezes com PBS e, em seguida, fixe-as usando formalina 10% tamponada (0,75 mL/bem) por 15 minutos. Depois, lave as células 2 vezes usando PBS (1 mL/well). Cada vez, incuba as células por 5 minutos.
   6. O próximo passo é incubar as células na mancha 8GX azul alciana preparada em 3% de ácido acético glacial por 60 min a 37 °C. Lave as células manchadas 2 vezes com ddH₂O e uma vez com PBS, e então observe os proteoglicanos manchados sob o microscópio.

4. Diferenciação de Ad-MSCs em IPCs

1. Na passagem 3, divida os Ad-MSCs usando Trypsin-EDTA. Primeiro, remova a mídia, depois lave as células enquanto ainda estiver presa no frasco de cultura com 5 mL de PBS. Em seguida, adicione 5 mL de Trypsin-EDTA ao frasco de 75 cm² e incubar a 37 °C por 3-10 min.
   NOTA: Tente induzir as células em passagens precoces, geralmente entre P3-P5, pois passagens tardias afetam negativamente as propriedades das células e as habilidades de diferenciação^17,24.
2. Depois, inspecione as células para desprendimento e por ser uma suspensão unicelular. Adicione 5 mL de mídia DMEM/F12 completa ao frasco para inibir a ação de trypsin. Colete a suspensão da célula e transfira-a para um tubo de 15 mL e, em seguida, adicione mais 5 mL de mídia DMEM/F12 completa ao tubo.
3. Centrifugar as células a 300 x g por 2 min para pelotar as células.
4. Lave as células uma vez com PBS, centrífuga novamente a 300 x g por 2 min e, em seguida, resuspended a pelota de célula em 3-5 mL de mídia DMEM/F12 completa.
5. Conte as células usando corante de exclusão azul trypan e um hemótmetro.
6. Em seguida, semente as células em placas de 6 poços (1 x 10⁶ células/placa) e uma placa de 12 poços (para ensaio GSIS; 1 x 10⁶ células/placa) e incubar em uma incubadora de 37 °C, 5% CO₂ em mídia completa (como descrito na etapa 1,9.) por 3 dias para atingir quase 90% de confluência.
7. No dia da indução, remova a mídia, lave as células com PBS e, em seguida, pré-induza as células por 2 dias por mídia de pré-indução (DMEM/F12 complementado com 10% de FBS, Penicilina U/mL 100 μg/mL, 0,25 μg/mL de anfotericina B, 2 mM L-glutamina, 10 mM de nicotinamida [NA]e 1mM β-mercaptoethanol [β-ME]).
8. Induzir as células por mais 1 dia usando DMEM de alta glicose (HG-DMEM, 4,5g/L de glicose) suplementada com 2,5% FBS, penicilina U/mL, 100 μg/mL streptomicina, 0,25 μg/mL de anfotericina B, 2 mM L-glutamina, 10 mM NA e 1mM β merc-mercaptotanol. Coletar pelotas de células no final desta etapa (células D3 designadas neste protocolo).
9. Incubar as células por mais 7 dias na mídia de indução de diferenciação final composta por HG-DMEM suplementada com 2,5% de FBS, Penicilina U/mL 100 U/mL, 100 μg/mL streptomicina, 0,25 μg/mL anfotericina B, 2 mM L-glutamina, 10 mM NA, 1mM β-mercaptoethanol e 10 nM exendin-4.
10. Ao final do período especificado, colete pelotas celulares (denominadas Final neste protocolo) e avalie a diferenciação bem sucedida das células por manchas DTZ e ensaio GSIS, conforme segue neste protocolo.
11. Avalie os IPCs gerados seguindo as etapas 5 e 6 abaixo.

5. Mancha de dithizone

1. Prepare a solução de estoque de manchas dithizone (DTZ) da seguinte forma: Dissolva completamente 25 mg de DTZ em 2,5 mL de sulfóxido de dimetil (DMSO), divida em alíquotas e armazene a −20 °C no escuro até usar.
2. Para coloração, prepare uma solução de trabalho 1:100 (volume/volume) diluindo a solução de estoque em meio de cultura completa (HG-DMEM complementada com 5% FBS, penicilina U/mL, 100 μg/mL estreptomicina, 0,25 μg/mL de anfoterina B e 2 mM L-glutina). Em seguida, filtre a solução de funcionamento através de um filtro de seringa de 0,2 μm.
3. Em seguida, para as células de cultura de coloração DTZ especificadas em uma placa de 6 poços e, depois de aspirar a mídia cultural, lave as células uma vez com PBS e, em seguida, adicione 2 mL de solução de trabalho DTZ em cada poço. Incubar por pelo menos 2 h a 37 °C na incubadora de CO₂ .
4. Lave cuidadosamente as células 2 vezes com PBS. Após a última lavagem, adicione 2 mL de PBS em cada poço. Em seguida, observe os IPCs vermelhos vermelhos sob um microscópio invertido. Use Ad-MSCs não induzidos inicialmente cultivados em meio de crescimento completo (10% FBS - DMEM/F12) como controle.

6. Expressão genética de marcadores de células β por RT-qPCR

1. Extração de RNA
   1. Após a diferenciação, colete as pelotas de célula e armazene-as a −80 °C até usar. Suspenda cada pelota celular (derivada dos seis poços de uma placa de 6 poços agrupadas) em 1 mL de reagente de extração de RNA de tiocianato de guanidium em um tubo sem nuclease de 1,5 mL, juntamente com tubulação para cima e para baixo várias vezes. Incubar as amostras diluídas à temperatura ambiente por 5 minutos para permitir a dissociação completa dos complexos de nucleoproteína.
   2. Adicione 200 μL de clorofórmio por 1 mL de reagente de extração de RNA, e tampar com segurança os tubos para serem vigorosamente agitados à mão por 15 s. Em seguida, incubar por 3 minutos em temperatura ambiente.
   3. Centrifugar as amostras a 13.800 x g por 15 min a 4 °C. Isso levará à separação da mistura em uma fase de clorofórmio inferior, uma interfase e uma fase aquosa superior incolor, com o RNA permanecendo na fase aquosa.
   4. Coloque a fase aquosa superior em um novo tubo, evitando cuidadosamente tocar na interfase.
   5. Adicione 600 μL de isopropanol de 100% à fase aquosa (volume 1:1), depois misture as amostras completamente por inversão 25 vezes e incubar à temperatura ambiente por 10 minutos.
   6. Centrifugar as amostras a 18.800 x g por 30 min a 4 °C. O RNA precipitado forma uma pequena pelota em gel no lado do tubo.
   7. Retire o supernatante e lave as pelotas com 1 mL de 80% de etanol gelado. Depois de adicionar o etanol, conduz lentamente a tubulação múltipla da pelota de RNA para 10 s.
   8. Centrifugar as amostras por 5 min a 9.600 x g a 4 °C. Descarte o supernatante e deixe as pelotas de RNA secas por 5-10 minutos.
   9. Após a secagem, dissolva as pelotas de RNA em 25-100 μL de água sem RNase (de acordo com o tamanho inicial da pelota) ao esbotoar várias vezes até a solubilização completa em tubos livres de nuclease de 1,5 mL. Evite a secagem excessiva da pelota de RNA.
      NOTA: Normalmente, a pelota fica transparente quando seca. No entanto, uma vez que esteja claro, prontamente resususpensá-lo para evitar o ressecamento excessivo da pelota.
   10. Quantifique o RNA determinando as densidades ópticas (OD) a 260 nm e 280 nm, usando água sem nuclease como em branco.
   11. Certifique-se de que as amostras tenham OD260/OD280 = 1,8-2,0.
2. Síntese cDNA
   1. Síntese cDNA do RNA total isolado usando um kit de síntese cDNA.
   2. Realize a reação de síntese cDNA de acordo com as instruções do fabricante. Em um tubo PCR de 200 μL, adicione um volume de solução RNA contendo 0,5 μg de RNA total ao mix mestre de reação mostrado na Tabela 1.
   3. Depois de adicionar o RNA ao mix mestre, insira a mistura através de um programa de ciclismo de 50 °C por 30 minutos para um ciclo, seguido por um ciclo de inativação de 95 °C por 2 min, utilizando um cicloviário térmico.
   4. Diluir o cDNA usando água sem nuclease para uma concentração final de 2 ng/μL. Armazene a −20 °C para RT-qPCR subsequente.
3. RT-qPCR usando SYBR Green Master Mix
   1. Realize a reação RT-qPCR para cada gene alvo usando o modelo cDNA de acordo com a mistura de reação mostrada na Tabela 2. Faça todas as medidas em triplicados.
   2. Os conjuntos de primers utilizados são mostrados na Tabela 3. Realize todos os procedimentos RT-qPCR no gelo.
   3. Realize a reação RT-qPCR usando uma máquina PCR em tempo real nas configurações padrão do programa. As condições térmicas de ciclismo incluíram desnaturação inicial de 95 °C por 10 min, seguida por 45 ciclos de desnaturação (95 °C, 15 s) e ressarem/extensão combinadas (60 °C, 1 min).
   4. Determine os valores C_t e detecte os níveis de expressão de acordo com ^2-ΔΔCt, com β-actin como um controle interno.

Tabela 1: síntese cDNA de volumes de mixagem mestre.

Tabela 2: Mistura de reação RT-qPCR.

Tabela 3: Sequências de primer para frente e para trás.

7. Secreção de insulina estimulada por glicose

1. Preparação do buffer de bicarbonato Ringer (KRB) da Kreb
   1. Prepare a solução tampão de bicarbonato ringer (KRB) da Kreb com as concentrações de glicose de 2 mM (baixa glicose) e 20 mM de glicose (alta glicose) para o ensaio de secreção de insulina estimulada pela glicose (GSIS). Os componentes utilizados para a preparação do buffer KRB são fornecidos na Tabela 4.
   2. Ajuste o pH do buffer usando 1 N HCl para cerca de 7,25-7,35 (ou seja, 0,1-0,2 unidades abaixo do pH 7.4 desejado, pois pode subir durante a filtragem).
   3. Adicione a albumina de soro bovino (BSA) recentemente em uma concentração de 0,1 % (peso/volume).
   4. Adicione glicose depois (18 mgs para 50 mL de KRB para preparar o tampão de KRB de baixa glicose de 2 mM, e 180 mgs para 50 mL de KRB para preparar o tampão de 20 mM de alta glicose KRB).
   5. Esterilize os buffers LG e HG KRB preparados por filtragem através de um filtro de seringa de 0,2 μm para estar pronto para o ensaio GSIS.
2. Ensaio GSIS
   1. Inicialmente semente 1 x 10⁵ células/poço em uma placa de cultura celular de 12 poços e induzir essas células usando exatamente o mesmo protocolo de indução de diferenciação.
   2. No final do protocolo de indução, lave suavemente os IPCs gerados (na placa) 2 vezes com PBS e uma vez com LG-KRB.
   3. Depois, incubar os IPCs com 300 μL de LG-KRB/well por 1 h e, em seguida, descartar este buffer.
   4. Em seguida, incubar os IPCs com 300 μL de 2 mM (LG) ou 20 mM (HG) tampão KRB por mais 1h. Ao final do período de incubação, colete o supernascido e armazene a −80 °C para o ensaio subsequente de insulina secretado usando um kit ELISA comercial e seguindo as instruções do fabricante.
      NOTA: Tente ser o mais suave possível ao aspirar ou adicionar o buffer PBS e KRB ao realizar o ensaio GSIS.

Tabela 4: Os componentes utilizados para a preparação do buffer KRB.

8. Análise estatística

1. Expresse todos os dados como ± erro padrão da média (SEM). Todas as comparações foram feitas utilizando-se análise unidirecional de variância (ANOVA) e teste pós-hoc de Tukey usando software estatístico. Os resultados com valores p **p ≤ 0,01 e *p ≤ 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Isolamento e caracterização de Ad-MSCs
Como mostrado na Figura 2, as células isoladas do tecido adiposo mostraram uma população heterogênea de células arredondadas e semelhantes a fibroblastos a partir do dia seguinte de isolamento (Figura 2A). 4 dias após o isolamento, as células do fibroblasto começaram a aumentar em número e tamanho e crescer como uma população homogênea pela passagem 1 (Figura 2B,C). Essas células continuaram a crescer como células de plástico aderir, semelhantes a fibroblásticos, como mostrado até a passagem 3, cumprindo o primeiro critério das características do MSC (Figura 2D). Estes Ad-MSCs mostraram características de cultura muito boas, e este protocolo foi considerado um protocolo relevante, fácil e relativamente rápido para isolar Ad-MSCs de almofadas de gordura epidídmicas.

O passo seguinte foi caracterizar os Ad-MSCs isolados. De acordo com o ISCT, os MSCs devem seguir os três critérios de adesão plástica, expressão de CDs mesenquimais com falta de marcadores hematopoiéticos e a capacidade de diferenciar-se em adipócitos, osteocitos e condrócitos. Como mostrado na Figura 3A, a análise de citometria de fluxo mostrou que a maioria dessas células expressas CD90 e CD105 (76,4% e 73,6%, respectivamente). Enquanto isso, foram quase negativos para CD34 (0,1%).

Além disso, após a indução da diferenciação dessas células, elas mostraram a capacidade de diferenciar-se em adipócitos, osteocitos e condrócitos. Como mostrado na Figura 3B (painel superior), os adipócitos mostraram manchas vermelhas de óleo de vacuoles lipíduos quando comparados ao controle de células não induzidas. Os osteocitos apresentaram coloração vermelha característica (Figura 3B, painel médio) quando comparadas às células de controle. Finalmente, as células induzidas por condrócitos mostraram coloração azul da matriz extracelular quando comparadas ao controle de células não induzidas (Figura 3B, painel inferior).

Esses dados indicam claramente que as células isoladas do tecido adiposo não só apresentam boas características de cultura, mas também exibem todos os critérios propostos para os MSCs.

Diferenciação dos Ad-MSCs em células produtoras de insulina (IPCs)
Como mostrado na Figura 4A, usamos um protocolo relativamente simples e curto para diferenciar os Ad-MSCs em IPCs. Após a indução da diferenciação, os IPCs induzidos foram avaliados de várias formas. As células induzidas apresentaram alterações morfológicas marcadas. Como mostrado na Figura 4B (painel superior), as células induzidas mostraram morfologia arredondada, semelhante a cluster quando comparadas com a morfologia fibroblástica normal dos Ad-MSCs. Curiosamente, ao coloração com dithizone, esses aglomerados mostraram uma mancha vermelha, que é uma característica de grânulos de zinco de mancha de célula β (Figura 4B, painel inferior).

Posteriormente, os IPCs gerados foram geneticamente avaliados para a expressão dos marcadores β-células específicos quando comparados com as células de controle não induzidas. Como mostrado na Figura 5A-E, as células induzidas foram capazes de expressar vários marcadores β-células específicas, indicando sua capacidade de gerar IPCs. Quanto ao marcador de endoderme definitivo FOXA2-a (como mostrado na Figura 5A)-, foi altamente expresso na diferenciação da D3 quando comparado ao controle, atingindo quase 30 vezes e depois diminuindo para apenas 10 vezes o controle nas células diferenciadas finais (D3: 28,37 ± 0,88; Final: 12.10 ± 1.27; p < 0,05). Quanto ao Pdx-1 (que é considerado um marcador precoce de células β), foi elevado tanto em células D3 quanto em células diferenciadas finais, atingindo quase 20 vezes quando comparado ao controle de células não induzidas (D3: 22,39 ± 5,14; Final: 17.13 ± 0.342; p < 0,05; Figura 5B). Em relação aos outros marcadores de células β, ou seja, NKX6.1, MafA e insulina-1 (Ins1), todos eles mostraram elevação a partir da D3 até a diferenciação final, Atingindo quase 8 vezes, 12 vezes e 300 vezes, respectivamente, quando comparado ao controle de células não induzidas (NKX6.1: D3: 1,94 ± 0,86, Final: 7,97 ± 1,34, p<0,05; MafA: D3: 6,59 ± 0,4, Final: 11,54 ± 2,40, p < 0,05; e Ins1: D3: 27,29 ± 20,27, Final: 318,20 ± 76,09, p < 0,05) (Figura 5C-E). Isso indica que esses Ad-MSCs podem se diferenciar em IPCs expressando marcadores de células β.

Finalmente, essas células foram avaliadas para a secreção da insulina quando desafiadas com concentrações crescentes de glicose. Como mostrado na Figura 5F, a insulina secretada no supernascimento dos IPCs induzidos quando desafiada com glicose de 20 mM foi significativamente maior do que a secretada quando as células foram desafiadas com 2 mM de glicose (HG: 390 pg/mL ± 33 pg/mL; LG: 234 pg/mL ± 32 pg/mL, p < 0,05; Figura 5F)

Esses dados confirmaram que o protocolo utilizado conseguiu diferenciar os Ad-MSCs em IPCs, o que foi geneticamente e funcionalmente confirmado.

Figura 1: Apresentação esquemática das etapas do protocolo utilizadas para o isolamento e caracterização dos Ad-MSCs. Gerado por Biorender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Fotomicrografos que mostram os Ad-MSCs isolados. (A) Células isoladas que exibem morfologia de plástico, semelhante a fibroblastos, começam a aparecer no dia seguinte ao isolamento. (B) Com o tempo, esses Ad-MSCs adeptos (com morfologia semelhante ao fibroblasto) proliferam e aumentam em número, atingindo uma população mais homogênea como fibroblasto em (C) P1 e (D) P3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Caracterização de Ad-MSCs. (A) Análise citométrica de fluxo de Ad-MSCs mostra que essas células são quase negativas para CD34 (painel superior), enquanto a maioria das células expressa CD90 e CD105 (painel inferior). Os ad-MSCs podem se diferenciar nas três linhagens mesenquimais, ou seja, (B) adipócitos (onde as gotículas de óleo são manchadas por óleo vermelho), (C) osteocitos, manchados por alizarina vermelha, e (D) condrócitos, manchados pelo azul alciano (quando comparado ao controle de células não induzidas). Controle: células não induzidas, Diff: células diferenciadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Diferenciação de Ad-MSCs em IPCs. (A) Apresentação esquemática do protocolo de diferenciação utilizado para gerar IPCs a partir de Ad-MSCs, juntamente com fotomicrografos para as células em cada estágio durante a indução da diferenciação para os IPCs. Após a diferenciação, as células perdem sua morfologia fibroblástica e tendem a agregar aglomerados formadores, que tendem a se desprender e crescer em meios de suspensão. (B) Os fotomicrógrafos mostram controle de Ad-MSCs e IPCs gerados pelo protocolo acima mostrando alterações morfológicas de cluster redondo (painel direito) quando comparados com a morfologia semelhante ao fibroblasto dos Ad-MSCs não induzidos (painel esquerdo), não estão manchados (painel superior) ou manchados de DTZ (painel inferior).
Controle: células não induzidas; IPCs: células produtoras de insulina; NA: nicotinamida; β-ME: beta mercaptoetanol; D3: Células induzidas no dia 3 durante a indução da diferenciação para IPCs; D10: IPCs diferenciados finais no final do protocolo de indução; Ex-4: exendin-4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Níveis relativos de expressão de marcadores de células β e GSIS para IPCs. Níveis relativos de expressão por qRT-PCR para (A) FOXA2, (B) Pdx-1, (C) NKX6.1, (D) MafA e (E) Ins-1. (F) Níveis de insulina secretada no supernascedor ao desafiar os IPCs gerados com glicose de 2mM (LG) ou glicose de 20mM (HG). Controle: Ad-MSCs não induzidos, Dia-3: células diferenciadas coletadas na D3; Final: IPCs diferenciados finais; LG: baixa glicose; HG: alta glicose. a: a média é diferente do controle em p < 0,05; b: média é diferente do Dia-3 em p < 0,05; *: a média da LG é diferente do HG em p < 0,05; a comparação foi feita utilizando-se um teste de amostras independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Todos os coautores não declaram conflito de interesses associados a este trabalho.