Técnica modificada para o uso de corações murinos neonatais na preparação de Langendorff

Resumo

O presente protocolo descreve a canonização aórtica e a perfusão retrógrada do coração murino neonatal ex-vivo . Uma estratégia de duas pessoas, usando um microscópio de dissecação e uma agulha de bitola pequena, permite a cannulação confiável. A quantificação da tensão contítil longitudinal é alcançada usando um transdutor de força conectado ao ápice do ventrículo esquerdo.

Resumo

O uso do coração perfumado ex-vivo tem sido uma pedra angular da investigação isquemia-reperfusão desde o seu desenvolvimento por Oskar Langendorff há mais de um século. Embora essa técnica tenha sido aplicada a camundongos nos últimos 25 anos, seu uso nesta espécie tem sido limitado a animais adultos. O desenvolvimento de um método bem-sucedido para cannular consistentemente a aorta murina neonatal permitiria o estudo sistemático do coração isolado perfusado retrógrado durante um período crítico de desenvolvimento cardíaco em uma espécie geneticamente modificável e de baixo custo. A modificação da preparação de Langendorff permite a canulação e o estabelecimento de reperfusão no coração murino neonatal, minimizando o tempo isquêmico. A otimização requer uma técnica de duas pessoas para permitir a cannulação bem sucedida da aorta do rato recém-nascido usando um microscópio de dissecação e uma agulha modificada comercialmente disponível. O uso desta abordagem estabelecerá de forma confiável a perfusão retrógrada dentro de 3 minutos. Como a fragilidade do coração do camundongo neonatal e o tamanho da cavidade ventricular impedem a medição direta da pressão intraventricular gerada usando um balão, é necessário o uso de um transdutor de força conectado por uma sutura ao ápice do ventrículo esquerdo para quantificar a tensão contratitil longitudinal. Este método permite aos pesquisadores estabelecer com sucesso uma preparação isolada de coração murino de fluxo constante, permitindo o estudo da biologia cardíaca do desenvolvimento de forma ex-vivo . É importante ressaltar que este modelo será uma poderosa ferramenta para investigar as respostas fisiológicas e farmacológicas à isquemia-reperfusão no coração neonatal.

Introdução

Os preparativos do coração ex-vivo têm sido um grampo de estudos fisiológicos, fisiopatológicos e farmacológicos há mais de um século. Decorrente do trabalho de Elias Cyon na década de 1860, Oskar Langendorff adaptou o modelo isolado de sapo para perfusão retrógrada, pressurizando a raiz aórtica para fornecer fluxo coronário com um perfusado oxigenado¹. Usando sua adaptação, Langendorff foi capaz de demonstrar uma correlação entre circulação coronária e função mecânica². O ex-vivo coração retrógrado perfumado, mais tarde homônimo apelidado de técnica Langendorff, tem permanecido uma pedra angular da inv....

Protocolo

As aprovações do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Centro Médico da Universidade de Columbia foram obtidas para todos os métodos descritos. No estudo, foram utilizados 10 camundongos do pós-natal masculino do tipo selvagem 10 camundongos.

1. Preparação do aparelho Langendorff

1. Para minimizar a complexidade, use perfusato oxigenado não recirculante dentro do aparelho Langendorff (ver Tabela de Materiais) através de fluxo constante ou pressão constante.
   1. Use tampão Krebs-Henseleit (KHB), contendo 120 mmol/L de NaCl, 4,7 mmol/L de KCl, 1,2 mmol/L de MgSO₄,....

Resultados

Os ratos P10 foram usados para modelar um ponto de tempo na infância humana^26,27. Quinze corações isolados de camundongos C57Bl/6 foram colhidos e culados com sucesso. Corações foram perfundidos com um fluxo contínuo de 2,5 mL ^min-1 de KHB oxigenado aquecido. Foram medidos parâmetros metabólicos, incluindo extração de glicose, consumo de oxigênio, produção de lactato e parâmetros fisiológicos, como frequência cardíaca, pressão de perfusão e resistência.......

Discussão

O presente trabalho descreve a canonização aórtica bem sucedida e a perfusão retrógrada no coração isolado do camundongo recém-nascido. É importante ressaltar que permite aos pesquisadores superar as barreiras que a idade de murina jovem e o pequeno tamanho do coração apresentaram anteriormente⁸. Embora não seja complexa no design, a abordagem requer um grau significativo de habilidade técnica. Os principais passos que inevitavelmente desafiarão até mesmo os investigadores mais tecnicamente profic.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Aparelho Langendorff para roedores	Radnoti	130102EZ
24 G cateter	BD	381511
26 G agulha em seringa de 1 mL combo	BD	309597
agulha de aço 26 G	BD	305111
5-0 Silk Suture	Ethicon	S1173
Bio Amp	ADInstruments	FE135
Bio Cable	ADInstruments	MLA1515
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901-100G
Circulando banho de água de aquecimento	Haake	DC10
tesoura de íris curva	Medline	microscópio de
	Nikon	SMZ-2B
encontrar tesoura de mola	Kent
Transdutor de Força	INS600127 ADInstruments	MLT1030/D
Heparina	Sagent	400-01
Tubulação de alta pressão	Edwards Lifesciences	50P184
pinça de curativo de íris	Kent	INS650915-4
Estilo joalheiro curvo pinça fina	Miltex	17-307-MLTX
KCl	Sigma-Aldrich	P3911-25G
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662-25G
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506-500G
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888-25G
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014-25G
Bomba de rolo	Gilson	Minipuls 3
tesouras de dissecação reta	Kent	INS600393-G
Fio de estimulação cardíaca temporária	Transdutor	TPW30
	ADInstruments	MLT1030/A

dissecação MDS10033Z glicose Sigma-Aldrich G8270-100G de força de ampla faixa Ethicon