Artigo de método

Reconstrução computacional de ilhotas pancreáticas como ferramenta de análise estrutural e funcional

DOI:

10.3791/63351

⸱

9 de março de 2022

 ,  , 
1Department of Electrical Engineering, Universidad Autónoma Metropolitana

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neste protocolo, as ilhotas pancreáticas são reconstruídas e analisadas usando algoritmos computacionais implementados em uma aplicação multiplataforma dedicada.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As propriedades estruturais das ilhotas pancreáticas são fundamentais para a resposta funcional das células secretantes de insulina, glucagon e somatostatina, devido às suas implicações na comunicação intraisleta via sinalização elétrica, paracrina e autocririna. Neste protocolo, a arquitetura tridimensional de uma ilhota pancreática é primeiro reconstruída a partir de dados experimentais usando um novo algoritmo computacional. Em seguida, são obtidas as propriedades morfológicas e de conectividade da ilhota reconstruída, como o número e percentuais dos diferentes tipos de células, volume celular e contatos célula-célula. Em seguida, a teoria da rede é usada para descrever as propriedades de conectividade da ilhota através de métricas derivadas da rede, como grau médio, coeficiente de cluster, densidade, diâmetro e eficiência. Finalmente, todas essas propriedades são avaliadas funcionalmente através de simulações computacionais usando um modelo de osciladores acoplados. No geral, descrevemos aqui um fluxo de trabalho passo a passo, implementado no IsletLab, um aplicativo multiplataforma desenvolvido especificamente para o estudo e simulação de ilhotas pancreáticas, para aplicar uma nova metodologia computacional para caracterizar e analisar ilhotas pancreáticas como um complemento ao trabalho experimental.

Introdução

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O pâncreas é dividido em regiões referidas como cabeça, pescoço, corpo e cauda, cada uma com estruturas, funções e posição anatômicadiferentes 1,2. Do ponto de vista funcional, o pâncreas pode ser dividido em sistemas endócrinos e exócrinos com o primeiro responsável pela secreção de hormônios criticamente envolvidos na regulação da homeostase glicemia, enquanto este último contribui para a digestão alimentar através da secreção de enzimas no duodeno1. As ilhotas pancreáticas constituem o tecido endócrino do pâncreas e são responsáveis pela secreção de glucagon, insulina e somatostatina, secretadas de células de β, e δ, respectivamente3. Além de seus mecanismos de regulação intrínseca, essas células são reguladas via comunicação elétrica direta (entre células β e prováveis β e δ células), e também por sinalização paracrina e autocririna 4,5,6. Ambos os mecanismos são altamente dependentes da arquitetura de ilhotas (ou seja, a composição e organização dos diferentes tipos de células dentro da ilhota)7,8. É importante ressaltar que a arquitetura de ilhotas é alterada na presença de diabetes, provavelmente perturbando a comunicação intraisleta como resultado 9,10.

O estudo das ilhotas pancreáticas envolve uma ampla gama de metodologias experimentais. Entre elas, o uso de técnicas de fluorescência para determinar o número, localização e tipo das diferentes células da ilhota permitiu estudar as propriedades estruturais e morfológicas das ilhotas pancreáticas 11,12,13 e obter uma melhor compreensão das implicações funcionais em saúde e doença. Como complemento, modelos computacionais de células pancreáticas 14,15,16 e, mais recentemente, ilhotas pancreáticas 12,17,18,19 foram utilizadas nas últimas décadas para avaliar aspectos difíceis ou até impossíveis de abordar experimentalmente.

Neste protocolo, buscamos preencher a lacuna entre o trabalho experimental e computacional, delineando uma metodologia para reconstruir arquiteturas de ilhotas, analisar suas propriedades morfológicas e conectividade por meio de métricas quantitativas e realizar simulações básicas para avaliar as implicações funcionais das propriedades ilhotas.

O protocolo descrito abaixo é baseado em algoritmos computacionais especificamente projetados para o estudo de ilhotas pancreáticas. Em resumo, na primeira etapa do protocolo, a arquitetura de ilhotas é reconstruída a partir de dados experimentais utilizando o algoritmo recentemente proposto por Félix-Martínez et al.19 em que posições nucleares obtidas através de 4′,6-diamidino-2-pheilndole (DAPI) coloração e tipos celulares identificados através de imunofluscência (como descrito em detalhes por Hoang et al.11,12 ) são processados em um procedimento de otimização iterativo. Isso leva à determinação do tamanho e posição ideais de cada célula e à obtenção de uma ilhota composta de células não sobrepostas. Em segundo lugar, com base na arquitetura reconstruída, os contatos célula-célula são identificados para determinar as propriedades de conectividade e gerar a rede de ilhotas correspondente que permite ao usuário obter métricas quantitativas para descrever melhor a arquitetura de ilhotas (detalhes sobre o algoritmo de reconstrução podem ser consultados no trabalho original sobre o assunto19). Finalmente, simulações funcionais básicas são realizadas utilizando-se a abordagem de modelagem proposta por Hoang et al.12 em que, com base na natureza pulsante da secreção hormonal observada experimentalmente20,21, cada célula é tratada como um oscilador e, portanto, a ilhota é representada como uma rede de osciladores acoplados seguindo as propriedades de conectividade da ilhota reconstruída.

Dada a complexidade computacional dos algoritmos utilizados neste protocolo, todas as etapas envolvidas foram implementadas em um aplicativo autônomo22 com o objetivo principal de abordar essas ferramentas computacionais para todos os leitores interessados, independentemente de seu nível de experiência no uso de software especializado ou linguagens de programação.

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Protocolo

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NOTA: Um diagrama esquemático do protocolo é mostrado na Figura 1. Uma descrição passo a passo é dada da seguinte forma (consulte o Arquivo Suplementar 1 para obter detalhes sobre os painéis de controle usados em cada etapa do protocolo).

figure-protocol-1
Figura 1: Diagrama de fluxo. Um diagrama de fluxo descrevendo a ordem sequencial do protocolo conforme implementado no IsletLab. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Instalação do IsletLab no Linux

NOTA: Siga as instruções dadas nas seções 2 e 3 do Arquivo Suplementar 2 para instalar o IsletLab nas janelas ou macOS.

  1. Abra um navegador de internet e vá para https://github.com/gjfelix/IsletLab. Baixe e extraia os arquivos do repositório do IsletLab.
    NOTA: O Arquivo Suplementar 3 inclui uma cópia da versão do IsletLab usada neste protocolo.
  2. Verifique se os compiladores GCC e NVCC estão instalados. Abra um terminal e digite os seguintes comandos:
    gcc --versão
    nvcc --versão
    Siga as instruções listadas na seção 1 do Arquivo Suplementar 2 se algum desses comandos não for reconhecido pelo sistema.
  3. Baixe e instale a plataforma de ciência de dados (ver Tabela de Materiais). Abra um terminal e vá para a pasta IsletLab.
  4. Crie um novo ambiente digitando o seguinte comando no terminal:
    conda env criar -f isletlabgui_v1.0.yml
  5. Ativar o novo ambiente digitando:
    conda ativar isletlab_v1.0
  6. Inicie o aplicativo IsletLab digitando o seguinte comando no terminal (ver Figura 2 para uma descrição da janela principal):
    píton isletlabgui_v1.0.py

figure-protocol-2
Figura 2: A interface de usuário do IsletLab. A interface é composta por três painéis principais: configuração (1), estatística (2) e gráficos (3) painéis. A barra de ferramentas gráfica (4) está localizada na parte inferior do painel gráfico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Reconstrução de ilhotas

  1. Prepare os dados de entrada. Organize os dados de ilhotas de entrada (ou seja, tipos de células e coordenadas de três dimensões (3D) em um arquivo de quatro colunas em que a coluna 1 contém o tipo de célula (codificado como 11: ª célula, 12: β células, 13: δ células) e as colunas 2 a 4 contêm as coordenadas x, y e z, respectivamente (consulte um trecho de um arquivo de entrada na seção 5 do Arquivo Suplementar 2 ou no arquivo de teste de entrada incluído no repositório do IsletLab).
  2. Certifique-se de que o arquivo de entrada não inclua cabeçalhos de coluna. Use o arquivo de entrada de exemplo incluído no repositório DolletLab para seguir o protocolo, se necessário (Input_Islet_test.txt).
    NOTA: Os dados de entrada utilizados para desenvolver os algoritmos implementados no IsletLab foram obtidos experimentalmente conforme descrito em detalhes por Hoang et al.11,12 usando a coloração da DAPI para determinar as posições nucleares e a imunofluorescência para identificar os tipos celulares.
  3. Clique no botão 'Carregar ilhota inicial ' e selecione o arquivo contendo dados de entrada para gerar uma ilhota inicial, a representação 3D e as estatísticas correspondentes. Em caso de erro, a seguinte mensagem será exibida: 'Arquivo de isícula de carregamento de erro'. Para corrigir isso, repita o passo 2.1.
  4. Configure o processo de reconstrução. Clique no botão Configurações de Reconstrução e modifique os parâmetros de otimização (consulte as seções 4 e 5 do Arquivo Suplementar 2 para uma breve descrição do algoritmo e dos parâmetros mostrados na janela de configurações de reconstrução).
  5. Definir a temperatura inicial = 1, fator de iterações = 1, e fator de aceitação = 1. Clique no botão OK para salvar os valores dos parâmetros.
    NOTA: Como regra geral, um aumento no parâmetro de temperatura, bem como nas iterações e fatores de aceitação, produzirá melhores resultados de reconstrução em termos das células experimentais incluídas na ilhota reconstruída em detrimento de um aumento no tempo de computação.
  6. Clique no botão Reconstruir ilhotas para abrir a janela de registro de reconstrução (consulte a seção 6 do Arquivo Suplementar 2 para obter uma descrição das informações fornecidas no registro de reconstrução).
  7. Clique no botão Executar para iniciar o processo de reconstrução. Monitore o processo de otimização até que a mensagem: 'Por favor, feche esta janela para continuar' é exibida. Feche a janela de registro de reconstrução para gerar a representação visual da ilhota reconstruída e para calcular as estatísticas relacionadas (ver a coluna esquerda na Figura 3A-C).
  8. Avalie os resultados do processo de reconstrução analisando as estatísticas de otimização mostradas na guia final de ilhotas do painel estatístico. Particularmente, concentre-se em maximizar a porcentagem de células experimentais incluídas nas ilhotas reconstruídas (% de experimentais) ou equivalentemente, na minimização do número de sobreposições (também mostradas graficamente no enredo de convergência, coluna direita na Figura 3A-C).
  9. Se a % da estatística experimental for considerada baixa de acordo com os objetivos do usuário, reinicie o IsletLab como descrito na etapa 9.1 e aumente a temperatura inicial, fator de iterações e fator de aceitação nos ajustes de reconstrução e repita as etapas 2.1-2.4 até que os resultados satisfatórios sejam obtidos (> 95% das células experimentais). Consulte as seções 5-7 do Arquivo Suplementar 2 para maior descrição do processo de reconstrução e dos resultados relacionados.

3. Identificação de contatos célula a célula

  1. Clique no botão Configurações de reconstrução e defina o parâmetro Tolerância de Contato para definir a tolerância de contato entre células e clique em OK para salvar os valores dos parâmetros.
    NOTA: O parâmetro de tolerância ao contato representa a distância máxima entre as células para ser considerado como em contato.
  2. Clique no botão Contatos célula-célula para identificar as células em contato próximo. Na guia contatos, verifique se há células em contato mostradas graficamente (linhas pretas) no painel gráfico e nas estatísticas correspondentes (ou seja, contatos total, homotípico e heterotípico e contatos β-β, δ-δ, β δ, β-δ) mostrados no painel de estatísticas (ver a coluna esquerda da Figura 4A-C).
  3. Aumente (diminua) o parâmetro de tolerância ao contato para aumentar (diminuir) o número de contatos célula-célula. Consulte a seção 8 do Arquivo Suplementar 2 para obter detalhes sobre a identificação de contatos célula-célula e os resultados associados.

4. Construção da rede de ilhotas

  1. Clique no botão Build Network para gerar a rede de ilhotas e para calcular as métricas de rede associadas (consulte a coluna direita na Figura 4A-C).
    NOTA: Uma descrição adicional dos resultados relacionados à rede de ilhotas geradas é dada na seção 9 do Arquivo Suplementar 2.

5. Simulação funcional da ilhota reconstruída

  1. Mude para a guia de simulação do painel de configuração da interface (Figura 5).
  2. Selecione o modo desejado de frequência intrínseca - Constante ou Aleatória - e clique no botão Configurar frequência intrínseca para definir a frequência dos osciladores (em Hz). Se for selecionada uma frequência intrínseca aleatória, defina a média e o desvio (em Hz) para gerar frequências aleatórias normalmente distribuídas (ver seção 11 do Arquivo Suplementar 2 para uma descrição dos parâmetros de simulação).
  3. Selecione o modo desejado da fase inicial - Constante ou Aleatório. Se uma fase inicial constante for selecionada, clique no botão Configurar fase inicial para definir a fase dos osciladores (em radians). Se a fase inicial aleatória for selecionada, o sistema atribuirá fases aleatórias entre 0 e 2π a todos os osciladores.
    NOTA: Se uma fase inicial constante for selecionada, todos os osciladores serão iniciados em fase.
  4. Clique no botão Configurar Interações para definir os parâmetros de interação célula-celular na janela de força de interação. Para obter uma descrição dos parâmetros de interação, consulte a seção 11 do Arquivo Suplementar 2.
  5. Configure a simulação definindo o tempo total de simulação (em s), etapa de tempo (em s) e fator de salvamento (números de etapas entre os pontos de dados salvos). Na simulação mostrada na Figura 5 o tempo total foi de 20000, com um passo de tempo de 0,1 s e um fator de salvamento de 500.
  6. Defina o número de blocos, threads e recursos de plataforma de computação disponíveis para realizar a simulação. Defina esses parâmetros de acordo com as características específicas da unidade de processamento gráfico (GPU) disponível.
    NOTA: No exemplo mostrado na Figura 5, foram utilizados 36 blocos e 64 threads por bloco (2304 núcleos de plataforma de computação) desde que foi utilizada uma GPU com 36 multiprocessadores e 64 núcleos de plataforma de computação por multiprocessadores. O valor do parâmetro de capacidade da plataforma de computação utilizado foi de 75, uma vez que a capacidade da plataforma de computação de hardware era 7.5 (ver seção 10 do Arquivo Suplementar 2 para obter detalhes sobre esses parâmetros).
  7. Clique no botão Executar simulação para abrir a janela de registro de simulação. Clique no botão Executar para iniciar a simulação e monitore o processo até que a legenda: 'Por favor, feche a janela para continuar' seja exibida. Consulte a seção 12 do Arquivo Suplementar 2 para obter detalhes sobre o registro de simulação.
  8. Feche a janela de registro de simulação para observar os resultados da simulação (ver Figura 5). Detalhes sobre os resultados da simulação são dados na seção 13 do Arquivo Suplementar 2.

6. Salve o projeto (opcional)

  1. Clique em Arquivar > Projeto de Exportação na barra de menu. Selecione o diretório no qual o arquivo do projeto será salvo e clique no botão OK .
    NOTA: O nome do arquivo do projeto é determinado automaticamente com base no nome do arquivo de dados inicial. Se o projeto não for salvo, todos os resultados e arquivos relacionados serão excluídos automaticamente.
  2. Carregue um projeto exportado clicando em Arquivo > Projeto de Carga.

7. Salvar figuras (opcional)

  1. Clique no Ícone salvar plot localizado na barra de ferramentas do plot para salvar a visualização atual em um arquivo de imagem. Repita esta etapa para todas as figuras criadas ao longo do protocolo.
    NOTA: As visualizações de gráficos e ilhotas podem ser modificadas usando os ícones disponíveis na barra de ferramentas de plot do painel gráfico.

8. Projeto de carga (opcional)

  1. Clique em Arquivar > Carregar projeto no menu principal e selecione um arquivo de projeto salvo anteriormente, conforme descrito nas etapas 6.1-6.2.
    NOTA: Um projeto não será carregado corretamente se o arquivo do projeto tiver sido modificado externamente. Se um projeto for carregado com sucesso, apenas os recursos de simulação estarão disponíveis.

9. Reinicie o processo de reconstrução e análise (opcional)

  1. A qualquer momento o usuário pode selecionar Arquivo > Reiniciar para descartar todos os resultados e iniciar uma nova reconstrução e análise.

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Resultados

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A reconstrução das ilhotas pancreáticas utilizando a metodologia proposta por Félix-Martínez et al.19 é altamente dependente dos parâmetros dados ao algoritmo de otimização (definido nos cenários de reconstrução). Um exemplo disso é mostrado visualmente na Figura 3, onde ilhotas reconstruídas obtidas usando diferentes conjuntos de parâmetros são mostradas. Primeiro, na Figura 3A, uma reconstrução que incluiu 86,6% das células incluídas no...

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Discussão

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O protocolo acima descreve uma abordagem prática para reconstruir e analisar arquiteturas de ilhotas pancreáticas usando novos algoritmos computacionais. O principal objetivo deste trabalho é permitir que a comunidade de pesquisa de ilhotas obtenha métricas quantitativas para caracterizar as propriedades morfológicas e conectividade das arquiteturas de ilhotas pancreáticas e avaliar as possíveis implicações funcionais dessas propriedades através de simulações computacionais.

Embora os...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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G.J. Félix-Martínez agradece ao CONACYT (Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, México) e ao Departamento de Engenharia Elétrica da Universidad Autónoma Metropolitana (Cidade do México) pelo apoio dado a este projeto. Agradecemos ao Dr. Danh-Tai Hoang, ao Dr. Manami Hara e ao Dr. Junghyo Jo pelo excelente trabalho e generosidade em compartilhar as arquiteturas de ilhotas que tornaram esse trabalho possível com a comunidade de pesquisa.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
gráfica NVIDIA compatível com CUDANecessária para as simulações funcionais
IsletLabhttps://github.com/gjfelix/IsletLab (Siga as instruções para baixar e instalar o aplicativo.)
Placa

Referências

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