Artigo de método

Comparação de métodos para isolar fungos entomopatômicos de amostras de solo

DOI:

10.3791/63353

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6 de janeiro de 2022

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1Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Instituto de Veterinária, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, 2Laboratório de Taxonomia Bioquímica e Bioprospecção de Fungos/Coleção de Cultura de Fungos Filamentosos, Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), 3Departamento de Parasitologia Animal, Instituto de Veterinária, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro

Neste artigo

Resumo

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Colônias fúngicas entomopatômicas são isoladas de amostras de solo tropical usando isca tenebrio , isca de Galleria , bem como meio artificial seletivo, ou seja, ágar de dextrose de batata enriquecido com extrato de levedura suplementado com clorofenicol, tiaabzolendae e ciclohexmida (meio CTC).

Resumo

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O objetivo do presente estudo é comparar a eficácia do uso de iscas de insetos versus meio seletivo artificial para isolar fungos entomopatogênicos (EPF) a partir de amostras de solo. O solo é um rico habitat para microrganismos, incluindo o EPF particularmente pertencente aos gêneros Metarhizium e Beauveria, que podem regular pragas de artrópodes. Produtos biológicos à base de fungos estão disponíveis no mercado principalmente para controle de pragas de artrópodes agrícolas. No entanto, apesar da alta biodiversidade endêmica, apenas algumas cepas são usadas em bioprodutos comerciais em todo o mundo. No presente estudo, 524 amostras de solo foram cultivadas em ágar de dextrose de batata enriquecido com extrato de levedura suplementado com clorofenicol, thiabendazol e cicloheximida (meio CTC). O crescimento das colônias fúngicas foi observado durante 3 semanas. Todos os Metarhizium e Beauveria EPF foram morfologicamente identificados no nível do gênero. Além disso, alguns isolados foram identificados molecularmente no nível da espécie. Vinte e quatro dessas 524 amostras de solo também foram pesquisadas para ocorrência de EPF utilizando o método de isca de insetos (Galleria mellonella e Tenebrio molitor). Foram isoladas 51 cepas de EPF (41 Metarhizium spp. e 10 Beauveria spp.) das 524 amostras de solo. Todas as cepas fúngicas foram isoladas de plantações ou pastagens. Das 24 amostras selecionadas para comparação, 91,7% foram positivas para ePF usando isca galleria , 62,5% usando isca Tenebrio e 41,7% utilizando CTC. Nossos resultados sugeriram que o uso de iscas de insetos para isolar o EPF do solo é mais eficiente do que usar o meio CTC. A comparação de métodos de isolamento, além da identificação e conservação da EPF, tem impacto positivo no conhecimento sobre biodiversidade. O aprimoramento da coleção EPF apoia o desenvolvimento científico e a inovação tecnológica.

Introdução

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O solo é a fonte de vários microrganismos, incluindo fungos entomopatômicos (EPF). Este grupo particular de fungos é reconhecido por sua capacidade de colonizar e muitas vezes matar hospedeiros artrópodes, especialmente insetos1. Após isolamento, caracterização, seleção de cepas virulentas e registro, a EPF é produzida em massa para o controle artrópode-praga, que sustenta sua relevância econômica2. Assim, o isolamento da EPF é considerado o primeiro passo para o desenvolvimento de um biopesticida. Beauveria spp. (Hipocreales: Cordycipitaceae) e Metarhizium spp. (Hipocreales: Clavicipitaceae) são os fungos mais comuns usados para o controle artrópode-praga3. A EPF foi isolada com sucesso do solo, artrópodes com micose visível, plantas colonizadas e rizosfera vegetal 4,5.

O isolamento da EPF também pode ser útil para estudar a diversidade, distribuição e ecologia desse grupo em particular. A literatura recente relatou que o uso de EPF é subestimado, citando diversas aplicações não convencionais de EPF, como sua capacidade de melhorar o crescimento das plantas4, remover contaminantes tóxicos do solo e ser utilizado na medicina6. O presente estudo tem como objetivo comparar a eficiência da isolação do EPF do solo usando iscas de insetos versus cultura artificial 7,8,9. O uso da Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Phyralidae) como isca de inseto no contexto do isolamento da EPF tem sido bem aceito. Essas larvas são usadas em todo o mundo pela comunidade científica como modelo experimental para estudar interações hospedeiro-patógeno10,11. A larva tenebrio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae) é considerada outro modelo de inseto para estudos envolvendo virulência e isolamento da EPF, uma vez que este inseto é fácil de raro em laboratório a um baixo custo 7,12.

Métodos independentes da cultura, como o uso de uma variedade de técnicas de PCR, podem ser aplicados para detectar e quantificar o EPF em seus substratos, incluindo o solo13,14. No entanto, para isolar adequadamente essas colônias fúngicas, seu substrato deve ser cultivado em um meio artificial seletivo9, ou os fungos presentes nas amostras podem ser iscas usando insetos sensíveis15. Por um lado, o CTC é um meio artificial sem dodine que consiste em ágar de dextrose de batata enriquecido com extrato de levedura suplementado com clorofenicol, thiabendazol e cicloheximida. Este meio foi desenvolvido por Fernandes et al. 9 para maximizar a recuperação de Beauveria spp. e Metarhizium spp. do solo. Por outro lado, as larvas G. mellonella e T. molitor também podem ser usadas com sucesso como iscas para obter isolados de EPF do solo. No entanto, de acordo com Sharma et al.15, menos estudos relataram o uso concomitante e a comparação desses dois insetos iscas. Os solos de vinhedos portugueses apresentaram recuperações significativas de Metarhizium robertsii (Metscn.) Sorokin usando T. larvas molitor em comparação com as larvas G. mellonella; em contraste, Beauveria bassiana (Bals. -Criv.) O isolamento vuill estava ligado ao uso das iscas de G. mellonella 15. Portanto, a decisão sobre qual método de isolamento da EPF utilizar (ou seja, G. mellonella-isca, T. molitor-isca ou meio CTC) deve ser considerada de acordo com o objetivo do estudo e a infraestrutura laboratorial. O objetivo do presente estudo é comparar a eficácia do uso de iscas de insetos versus meio seletivo artificial para isolar o EPF a partir de amostras de solo.

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Protocolo

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Como o presente estudo teve acesso ao patrimônio genético brasileiro, a pesquisa foi registrada no Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do Conhecimento Tradicional Associado (Sisgen) sob o código AA47CB6.

1. Amostragem do solo

  1. Colete 800 g de solo (com ou sem incidentes raízes secundárias da planta) a uma profundidade de 10 cm usando uma pequena pá. Guarde-os em sacos de polipropileno à temperatura ambiente até o início do experimento.
    NOTA: Pequenas raízes também podem ser coletadas, pois o EPF tem competência de rizosfera. Quanto mais rápido o processamento das amostras, melhor porque os esporos fúngicos podem ser menos viáveis com o tempo. No presente estudo, as amostras foram analisadas no máximo 7 dias após a coleta.
  2. Use um GPS para identificar a localização das amostras coletadas em latitude e longitude e classificar a área coletada de acordo com o tipo de solo (por exemplo, pastagens, floresta tropical nativa, beiras de lagos ou lavouras).

2. Métodos de isolamento para fungos entomopatômicos

  1. Isolamento utilizando meio artificial seletivo CTC.
    1. Para preparar o meio CTC [ágar de dextrose de batata mais extrato de levedura (PDAY) suplementado com 0,5 g/L de clororamfenicol, 0,001 g/L de thiabendazole, e 0,25 g/L de ciclohônima9], pesar todos os reagentes individualmente, misturá-los em água destilada e esterilizar o meio em autoclave. Em um armário de biossegurança, placa de 23 mL do meio em placas de Petri de 60 mm x 15 mm.
      ATENÇÃO: Enquanto pesam os reagentes CTC, use um jaleco, máscara, luvas e óculos porque o cicloheximida e o clorofenícol são tóxicos.
    2. Pesar 0,35 ± 0,05 g de cada amostra de solo (com ou sem raízes) e colocá-lo em um microtubo de 1,5 mL.
    3. Em um armário de biossegurança, adicione 1 mL de estéril 0,01% (vol/vol) de suspensão aquosa monooleate monooleana de polioximeeno ao microtubo contendo solo e vórtice para 30 s.
    4. Remova 50 μL do supernasce e pipete-o no centro das placas de Petri com meio CTC. Disperse as suspensões de forma homogênea na superfície do meio usando uma espátula drigalski estéril (6 mm de diâmetro).
      NOTA: Pelo menos três réplicas para cada amostra de solo devem ser preparadas.
    5. Incubar as placas em câmaras climáticas (25 ± 1 °C, umidade relativa ≥80%) no escuro e observar o crescimento das colônias fúngicas após 7, 14 e 21 dias de incubação.
    6. Observe a macromorfologia e micromorfologia das colônias fúngicas que buscam EPF. Transfira as culturas EPF para o ágar de dextrose de batata mais 0,05% de clorofenicol (PDAC) até que sejam obtidas culturas puras.
      NOTA: Utilize as teclas de descrição apresentadas abaixo na etapa 3 para identificação de colônias EPF.
  2. Isolamento usando iscas de insetos
    1. Use larvas desinfetadas por superfície G. mellonella e T. molitor em estágio final. Mergulhe as larvas em hipoclorito de sódio de 0,5% por 1 min para esterilização. Lave as larvas duas vezes usando água estéril.
      NOTA: Foram utilizadas larvas G. mellonella do quarto estágio no presente estudo. Os estágios larvais t. molitor não foram padronizados.
    2. Use potes de plástico para montar as iscas. Adicione 250 g de solo coletado a cada pote plástico (largura de 98 mm x 47 mm de altura x 142 mm de comprimento). Separe 15 larvas de cada espécie (T. molitor e G. mellonella) e deposite cinco larvas por pote plástico. Armazene os potes a 25 ± 1 °C e a umidade relativa ≥ 80% no escuro.
      NOTA: Faça 10 pequenos furos (2 mm de diâmetro) nas tampas da panela para permitir a ventilação. Um dispositivo de ferro aquecido afiado pode ser usado para perfurar os furos.
    3. Homogeneize o solo dia sim, dia não para permitir o máximo contato das larvas com o solo.
      NOTA: A umidade é importante para suportar a infecção fúngica das larvas. Para manter a umidade no solo, pulverize água destilada estéril na superfície do solo sempre que necessário. Não mergulhe a amostra do solo na água.
    4. Analise os potes diariamente em busca de insetos mortos.
      NOTA: Observe as larvas remanescentes na colônia diariamente em busca de sinais patológicos invertebrados para garantir que os insetos não estejam infectados. Como alternativa, potes de controle com solo estéril podem ser incluídos no estudo para verificar o estado de saúde das larvas de insetos.
    5. Remova os insetos mortos e esterilize-os superficialmente com hipoclorito de sódio de 0,5% por 1 min. Coloque os insetos estéreis em uma câmara úmida (umidade relativa ≥ 80%) a 25 ± 1 °C por 7 dias para favorecer a exteriorização de fungos entomopatômicos (micose).
    6. Após a micose, colhe a conidia da superfície dos insetos. Use um loop microbiológico para colocar a conidia no meio PDAC sob um microscópio estereoscópico. Como alternativa, coloque toda a larva infectada no meio PDAC. Incubar as placas de cultura em uma câmara climática a 25 ± 1 °C e a umidade relativa ≥ 80%.
    7. Observe a macromorfologia e micromorfologia das colônias fúngicas nas placas para confirmar a identidade da EPF. Repita a colheita no PDAC até que sejam obtidas colônias fúngicas puras.
      NOTA: Utilize as teclas de descrição apresentadas abaixo na etapa 3 para identificação de colônias EPF.

3. Identificação da EPF (Metarhizium spp. e Beauveria spp.)

  1. Analise as características macromorfológicas das culturas fúngicas nas placas (ou seja, superfície e reverso das colônias, sua forma, borda, taxa de crescimento, cor, textura, pigmento difusível, exsudatos e conidia aérea) após 14 dias a 25 ± 1 °C e umidade relativa ≥ 80%.
  2. Transfira a conidia aérea para culturas de slides (técnica de microcultura)16 por 3 dias a 25 ± 1 °C e umidade relativa ≥ 80% e mancha com azul lactofenol para observar as características microscópicas (ou seja, arranjo de conidia, conidioforos, forma e tamanho de conidia)17,18, 19,20.
  3. Observe as estruturas fúngicas microscópicas a 400x usando um microscópio óptico para confirmar a identificação do EPF.
    NOTA: As chaves morfológicas para ePF estão descritas nos relatórios por Bischoff et al., Rehner et al., Seifert et al., e Humber 17,18,19,20. A macro e micromorfologia das colônias fúngicas são os critérios mais frequentes utilizados para identificar fungos filamentosos no nível do gênero. Dependendo do gênero do EPF, essas características morfológicas mudarão. Humber20 apresenta uma chave de identificação para os principais gêneros de entomopatógenos fúngicos. As colônias de metarhizium spp. por exemplo, são geralmente circulares, em pó, exibindo diferentes tons de verde, e podem apresentar exsudato. Microscopicamente, essas colônias têm células conidiogêneas apical em conidioforos amplamente ramificados e densamente entrelaçados formando um hímeno compacto, e cilíndrico a conidia elípsida em cadeias paralelas formando colunas ou massas semelhantes a placas. Colônias beauveria spp. geralmente são brancas, em pó ou algodão. Eles exibem células conidiogêneas com uma porção basal dilatada que se estende apicamente em direção em ziguezague. Conidioforos beauveria formam aglomerados densos de conidia em forma de globo. São necessárias análises moleculares para a identificação do EPF no nível da espécie.
  4. Realizar análises moleculares nos isolados para identificação taxonômica no nível da espécie. Para as cepas EPF isoladas neste estudo, ou seja, Metarhizium spp. e Beauveria spp., realizam análises moleculares com base nos relatórios de Bischoff et al.17 e Rehner et al.18.
  5. Após a confirmação dos isolados como EPF, deposite os isolados em uma coleção de culturas fúngicas. No presente estudo, os isolados foram depositados na coleta de culturas fúngicas entomopatômicas do Laboratório de Controle Microbiano (LCM) da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro.

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Resultados

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Foram coletadas 524 amostras de solo em pastagens: pastagem de gado (165 amostras), floresta tropical nativa (90 amostras), beira do lago (42 amostras) e cultivo/lavoura (227 amostras) entre 2015 e 2018 no Estado do Rio de Janeiro. Os detalhes das coordenadas geográficas das amostras positivas para ePF são dados na Tabela Complementar 1.

Das 524 amostras de solo, 500 amostras foram analisadas apenas utilizando-se do meio CTC, e 24 amostras foram analisadas concomitantemente ut...

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Discussão

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Habitats naturais e agrícolas do solo são ambientes típicos da EPF22 e um excelente reservatório natural. No presente estudo, foram abordados dois métodos de isolamento da EPF utilizando iscas de insetos versus meio seletivo. O primeiro passo para o isolamento é a coleta das amostras de solo. O armazenamento adequado e a identificação das amostras do solo são cruciais. Informações sobre a latitude, longitude, tipo de solo e bioma são essenciais para estudos envolvendo epidemiológicos, modelagem e ...

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse.

Agradecimentos

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Este estudo foi financiado em parte pela Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) do Brasil, pelo Código Financeiro 001, Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (número do projeto E-26/010.001993/2015) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) do Brasil.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AutoclavePhoenix Luferco9451
Gabinete de biossegurançaAirstream ESCOAC2-4E3
CloranfenicolSigma-AldrichC0378
Câmaras climáticasEletrolabEL212/3
LamínulaRBR3871
CicloheximidaSigma-AldrichC7698
Espátula DrigalskiMarienfeld1800024
aplicativo GPSAplicativo de geolocalização2.1.2005
Solução de azul de lactofenolSigma-Aldrich61335
MicroscópioZeiss Axio star plus1169 149
Câmera de microscópioZeiss Axiocam 105 cor426555-0000-000
Microscópio softwereZen lite Zeiss 3.0
Olenk5-7105-1
MicrotuboMARCAZ336769-1PAK
Placas de PetriKasviK30-6015
Ponta de pipetaVattenVT-230-200C/VT-230-1000C
PippetteHTL - LabmateproLMP 200 / LMP 1000
Potes de plásticoPrafesta descartá veis8314
Sacos de polipropilenoExtrusa38034273/5561
Ágar batata dextroseKasviK25-1022
Prisma software 9.1.2Pá Pá
Tramontina77907009
Tenebrio mollitorSafariQP98DLZ36
ThiabendazolSigma-AldrichT8904
Tween 80Vetec60REAVET003662
VortexBiomixerQL-901
Extrato de leveduraKasviK25-1702
Lâmina de microscópio

Referências

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