Artigo de método

Um novo método de teste optocinético para medir a visão de ratos

DOI:

10.3791/63357

⸱

27 de julho de 2022

 ,  , 
1Roski Eye Institute, Department of Ophthalmology, Keck School of Medicine, University of Southern California, 2USC Ginsburg Institute for Biomedical Therapeutics, University of Southern California

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O método de teste comportamental do nistagmo optocinético (OKN) é usado para a avaliação da acuidade visual em roedores. Aqui é demonstrado um método simples que pode ser facilmente configurado em laboratórios de pesquisa para uma avaliação confiável da função visual em ratos normais e experimentais.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O nistagmo optocinético (OKN) é um movimento reflexivo do olho iniciado pelo movimento de estímulos visuais no campo de visão. O movimento de rastreamento da cabeça associado ao OKN é comumente usado como uma medida da função visual em roedores. Para registrar as respostas do OKN em ratos normais e experimentais, um aparelho simples e barato foi desenvolvido. Essa configuração usa duas telas de tablet para exibir o estímulo visual OKN que consiste em listras pretas e brancas de alto contraste geradas usando o aplicativo da Web de visualização OKN Stripes, um software disponível gratuitamente. O rato é colocado dentro de um suporte de acrílico transparente que limita o movimento para que a cabeça do rato fique continuamente voltada para a tela do OKN. A posição do suporte do rato pode ser alterada para ajustar a distância entre o rato e a tela do visor. Uma microcâmera posicionada acima do suporte do rato é usada para registrar as atividades visuais do rato. Essas gravações podem ser usadas para avaliações quantitativas. Com base na presença ou ausência de rastreamento de cabeça claro, as respostas OKN em diferentes frequências espaciais podem ser determinadas. Os dados coletados demonstram uma nova técnica para medição confiável da acuidade visual em ratos degenerados normais e retinianos.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Quando o olho é exposto a movimentos visuais sustentados de campo total, um padrão distinto de movimentos oculares de rastreamento rápido e suave e movimentos da cabeça de baixa aceleração emergem na direção do movimento visual, chamado nistagmo optocinético (OKN)1,2. A via neurológica do OKN passa da retina para o corpo geniculado lateral, lobo occipital e flóculo cerebelar e se conecta aos neurônios motores oculares3. Danos neurais em qualquer lugar ao longo dessas vias neurais podem levar a mudanças nas respostas do OKN. A resposta do OKN é usada como uma ferramenta para avaliar a simetria cerebral, a cegueira psicogênica e a acuidade visual em pacientes humanos 4,5. A acuidade visual é avaliada pela quantificação das respostas funcionais, que podem ser essenciais para determinar o sucesso de tratamentos e experimentos centrados na restauração da visão perdida devido a doenças neurodegenerativas 3,6,7. Em animais, as respostas OKN podem ser usadas para avaliar com precisão a acuidade visual, o que fornece aos pesquisadores a capacidade de coletar dados quantitativos e qualitativos sobre a função visual. Em roedores, é possível medir a acuidade visual dos olhos esquerdo e direito de forma independente com base no sentido de rotação das listras tanto no sentido horário quanto no sentido anti-horário8. Esse movimento no sentido anti-horário e horário expõe cada olho ao movimento naso-temporal (NT) ou tempo-nasal (TN)9, respectivamente. O estímulo TN resulta em uma resposta significativamente maior em comparação com o estímulo NT, uma vez que os roedores são mais sensíveis aos perigos vindos de trás ou de lado.

Anteriormente, a função visual em ratos normais de laboratório e ratos degenerados da retina foi testada usando diferentes métodos de teste OKN 6,10,11,12,13. No entanto, certas variabilidades nos escores de acuidade visual são observadas entre diferentes estudos, incluindo os dados mostrados na presente investigação. Essa variabilidade pode ser atribuída principalmente às diferenças na configuração de teste usada. Diferenças no tamanho da arena de teste e no tipo de estímulo visual OKN usado 6,10 podem ser os principais fatores. Os estímulos usados nesses experimentos incluem grades de onda senoidal para a aparência de um cilindro virtual14, cilindros rotativos intercambiáveis15 e listras de alto contraste (preto e branco) exibidas em quatro monitores de computador10. As principais limitações associadas a esses aparelhos e métodos de teste OKN incluem o grande tamanho do equipamento, o movimento dos animais na arena de teste e a incidência frequente de queda do animal da plataforma de teste 7,11,12.

Para minimizar as limitações acima, um novo aparelho para testes de OKN em ratos foi desenvolvido. Esse aparelho é comparativamente barato, comprovadamente eficiente, fácil de operar e permite a avaliação da função visual (Figura 1). O aparelho usa duas telas de tablet para exibir os estímulos visuais OKN (software de visualização) em diferentes frequências espaciais. Uma microcâmera é usada para registrar as atividades do animal durante os testes para posterior análise dos dados. Com o objetivo de fazer um aparelho OKN fácil de configurar em laboratórios de pesquisa, esta nova configuração descreve modificações críticas no aparelho de teste OKN existente. Os estímulos OKN usados aqui consistem em listras pretas e brancas em diferentes frequências espaciais e diferentes direções de rotação (da esquerda para a direita ou da direita para a esquerda). O principal componente do aparelho de teste OKN inclui duas telas de tablet com tela sensível ao toque (7,9 polegadas) usadas para exibir os estímulos OKN (Figura 2). Dois suportes ajustáveis são usados para manter as telas do tablet na posição desejada. Os suportes são fixados com segurança à borda de uma mesa de procedimento que permite o ajuste de sua altura e ângulo. Os ratos são colocados em um suporte de rato voltado para as telas de exibição. Os porta-ratos são feitos de tubo de plástico transparente (polimetilmetacrilato). O suporte é fixado a um pedestal e a um suporte de metal para garantir uma colocação estável na mesa de procedimentos. O tamanho dos tubos de retenção varia de 4 a 6 polegadas de comprimento e 2,5 a 3 polegadas de diâmetro, dependendo do tamanho dos ratos usados. A distância entre o rato e a tela do visor é ajustada alterando a posição do porta-rato. O suporte do rato ajuda a manter a exposição contínua da cabeça do rato em direção às telas e reduz seus movimentos durante o teste. Uma microcâmera é usada para registrar as respostas de rastreamento da cabeça. As deficiências dessa nova configuração incluem diferentes taxas de atualização para a tela e a possibilidade de ilusões de ótica ao usar listras estreitas. No entanto, eles podem ser considerados problemas comuns associados a uma configuração OKN baseada em computador. Além dos problemas acima, na configuração atual, os ratos não são testados usando um cilindro virtual14 que influencia a resposta OKN ideal. A novidade desse método está na técnica e no aparato em que o método é empregado. Esta técnica pode ser facilmente configurada em laboratórios de pesquisa para medição confiável da acuidade visual em roedores.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os procedimentos em animais foram realizados em conformidade com as diretrizes experimentais aprovadas pelas autoridades regionais e aceitas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade do Sul da Califórnia (USC), e em conformidade com a Declaração da Associação para Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmológica e Visual e a diretiva europeia 2010/63/UE sobre a proteção de animais usados para fins científicos.

NOTA: Os ratos usados neste estudo são ratos degenerados da retina pigmentada do Royal College of Surgeons (RCS) e ratos Long Evans (LE). A Figura 3 mostra uma ilustração esquemática mostrando diferentes estágios de teste e análise de OKN.

1. Procedimentos

  1. Preparação da configuração
    1. Mantenha o rato na gaiola e por 30 min dentro da sala de testes com as luzes da sala apagadas.
      NOTA: Isso ajuda a minimizar o estresse que ocorre durante o transporte e fornece uma condição de iluminação uniforme para todos os experimentos.
    2. Defina a posição das telas do tablet voltadas uma para a outra em 155° para exibir o aplicativo da Web de visualização OKN Stripes.
    3. Coloque o suporte de rato no meio de duas telas de tablet a 4,5 polegadas do centro.
      NOTA: Nesta posição, a cabeça do rato estará a cerca de 3.5 polegadas de distância da tela.
    4. Clique no aplicativo da Web de visualização OKN Stripes na área de trabalho do tablet para exibir estímulos visuais (listras pretas e brancas) começando com a frequência espacial mais baixa.
      NOTA: São utilizadas frequências espaciais 0,08, 0,15, 0,2, 0,24, 0,28, 0,33, 0,38 ciclos por graus (c/d), começando na frequência espacial mais baixa (0,08c/d) e mudando para frequências espaciais mais altas (até 0,38 c/d). Em cada frequência espacial, os ratos são testados nas direções horário e anti-horário na rotação das listras (1 min cada).
  2. Procedimento de teste OKN
    1. Selecione um suporte de rato de tamanho adequado.
    2. Traga o rato em direção à abertura do porta-rato e guie-o cuidadosamente para dentro.
    3. Deixe o rato se acomodar dentro do suporte (1-2 min) antes do teste.
      NOTA: Com o manuseio adequado, é possível manter o rato dentro do suporte na maioria dos casos; Quando necessário, o porta-rato é mantido alto (até 2 pés acima da mesa) por alguns segundos até que o rato se acalme. Descobriu-se que o medo da altura reduz a tendência do rato de descer do porta-rato. Tempo adicional (1-2 min) é dado para o rato se acomodar, se necessário.
    4. Insira o pedestal do suporte de rato no suporte de metal para sua colocação estável.
      NOTA: Esta configuração permite alterar a distância de visualização do rato da tela do tablet.
    5. Ligue a câmera para iniciar a gravação de vídeo.
    6. Clique em OKN Stripes Visualization Web Application na área de trabalho da tela do tablet e comece a executar o programa.
    7. Execute os estímulos OKN na direção da esquerda para a direita ou da direita para a esquerda.
      NOTA: A rotação das listras no sentido horário ativa o olho esquerdo, enquanto a rotação no sentido anti-horário ativa o olho direito. A direção inicial de rotação foi escolhida aleatoriamente para evitar possíveis habituações.
    8. Observe o comportamento de rastreamento da cabeça do rato.
    9. Comece a testar usando a frequência espacial mais baixa (0,08 c/d) e, em seguida, aumente a frequência espacial em uma ordem gradual (em ordem crescente).
    10. Observe a presença ou ausência de respostas OKN.
    11. Continue o teste, nenhum período de descanso é dado entre diferentes frequências espaciais.
    12. Pare a gravação de vídeo depois de completar todas as frequências espaciais e salve os dados usando o número de identificação do rato.
    13. Retire o rato do suporte e coloque-o na gaiola por aproximadamente 30 minutos de descanso entre testes consecutivos.
    14. Repetir os testes três vezes por rato.

2. Análise dos dados

  1. Revise o vídeo gravado e determine a acuidade visual de cada rato, encontrando as frequências espaciais nas quais o rato respondeu.
  2. Registre todas as respostas (presença ou ausência de um rastreamento de cabeça claro) em uma planilha.
  3. Encontre a maior frequência espacial à qual um rato respondeu nos três testes. Esta é considerada a acuidade visual final.
    NOTA: Como a medição da acuidade visual é subjetiva, os dados serão avaliados por dois funcionários independentes do estudo para confirmar a pontuação da acuidade visual para cada rato12. Os resultados são verificados até que a pontuação final seja acordada. Uma resposta OKN positiva é definida como a presença de uma atividade clara e sustentada de rastreamento de cabeça. O rastreamento aleatório da cabeça (não relacionado aos estímulos visuais do OKN) ou a ausência de qualquer movimento da cabeça é considerado uma resposta negativa do OKN.
  4. Realize análises estatísticas para comparar grupos ou entre os dois olhos (olho esquerdo vs olho direito).
    NOTA: Revise as gravações de vídeo para esclarecer se as respostas positivas ou negativas são conduzidas conforme necessário.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O teste OKN foi realizado usando ratos do Royal College of Surgeons (RCS) degenerados em retina (RD) e ratos Long Evans (LE) normais pareados por idade. Os ratos LE (n = 4) foram usados para estabelecer os dados basais para determinar os escores de acuidade visual em ratos normais usando a nova configuração. A análise estatística foi realizada por meio do Microsoft Excel (média ± desvio padrão). Os ratos LE exibiram rastreamento de cabeça robusto em frequências espaciais de 0,15 c / d a 0,33 c / d. Para avaliar a confiab...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OKN é um movimento reflexivo do dente de serra dos olhos em resposta a um estímulo à deriva, que é usado como uma ferramenta para avaliar a acuidade visual em seres humanos3. Em animais, incluindo primatas e roedores, o teste OKN é usado como uma medida quantitativa da função visual. O presente estudo descreve um novo aparelho OKN barato que pode ser facilmente configurado em laboratórios de pesquisa para testes comportamentais OKN em ratos. As avaliações do OKN e...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflitos de interesse a relatar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo foi apoiado pelas concessões do CIRM (Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia) (DISC1-09912 PI- Thomas, DR3-07438- PI- Humayun), Bolsa Irrestrita ao Departamento de Oftalmologia da Research to Prevent Blindness, Nova York, NY, e apoio da Bright Focus Foundation (M2016186, Thomas, PI). A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo National Eye Institute of the National Institutes of Health sob o número de prêmio P30EY029220.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
iPad MiniAppleA1489Dois iPad Minis são usados para exibir o software de visualização OKN Stripes.
Acessório de microcâmera/microcâmeraLanonB097H6WWDSA microcâmera é usada para gravar o experimento. O acessório da microcâmera se conecta à mesa e mantém a câmera voltada para o rato. As respostas de rastreamento da cabeça são registradas e avaliadas em diferentes distâncias, frequências espaciais e direções.
Tubo de Plexiglass / Suporte de RatoMelhores AcrílicosB07KMF31MCO Tubo de Plexiglass é usado para conter o rato, com a cabeça exposta, durante o experimento. O tubo é conectado a outro acessório de tubo de plexiglass vertical para estabilizar o suporte do rato durante o experimento. Todo o aparelho foi projetado e construído no laboratório.
Acessório de Tubo de PlexiglassMelhor AcrílicoB07KMF31MCEste acessório segura o suporte de rato na frente das telas do iPad, e permite que a distância entre o rato e os iPads seja manipulada.
Suportes de TelaKabconB08JLRPKQ1Dois suportes de tela são usados para segurar os iPads para exibir o Software de Visualização OKN Stripes para o rato.
Aplicativo da Web de visualização OKN StripesA licença MIT (MIT) Copyright (c) 2016 Anton Yakushinhttps://antonyakushin.github.io/okn-stripes-visualization/Este aplicativo é um software disponível gratuitamente para exibir estímulos visuais (listras pretas e brancas) em diferentes frequências

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mustari, M. J., Ono, S. Optokinetic eye movements. Encyclopedia of Neuroscience. , Academic Press. 285-293 (2009).
  2. Gottlob, I. Ups and downs of optokinetic nystagmus. British Journal of Ophthalmology. 84, 445-447 (2000).
  3. Wester, S. T., Rizzo, J. F., Balkwill, M. D., Wall, C. Optokinetic nystagmus as a measure of visual function in severely visually impaired patients. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (10), 4542-4548 (2007).
  4. Daroff, R., Aminoff, M. Encyclopedia of the Neurological Sciences. , Elsevier, Academic Press. (2014).
  5. Squire, L., et al. Fundamental Neuroscience. , Elsevier, Academic Press. Amsterdam, Boston. (2008).
  6. Thomas, B. B., Seiler, M. J., Sadda, S. R., Coffey, P. J., Aramant, R. B. Optokinetic test to evaluate visual acuity of each eye independently. Journal of Neuroscience Methods. 138 (1-2), 7-13 (2004).
  7. Cahill, H., Nathans, J. The optokinetic reflex as a tool for quantitative analyses of nervous system function in mice: Application to genetic and drug-induced variation. PLOS One. 3 (4), 2055(2008).
  8. Segura, F., et al. Development of optokinetic tracking software for objective evaluation of visual function in rodents. Scientific Reports. 8, 10009(2018).
  9. Lev-Ari, T., Katz, H., Lustig, A., Katzir, G. Visual acuity and optokinetic directionality in the common chameleon (Chamaeleo chamaeleon). , Available from: https://www.semanticscholar.org/paper/Visual-Acuity-and-Optokinetic-Directionality-in-the-Lev-Ari-Katz/7bae131729f31f005cf64516ad7285904363c2e9 (2017).
  10. Thomas, B. B., Shi, D., Khine, K., Kim, L. A., Sadda, S. R. Modulatory influence of stimulus parameters on optokinetic head-tracking response. Neuroscience Letters. 479 (2), 92-96 (2010).
  11. Shi, D. S., et al. Characterization of optokinetic response in normal and retinal degenerate rats and mice using a computer-based testing apparatus. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (13), 4422(2008).
  12. Thomas, B. B., et al. Co-grafts of human embryonic stem cell derived retina organoids and retinal pigment epithelium for retinal reconstruction in immunodeficient retinal degenerate royal college of surgeons rats. Frontiers in Neuroscience. 15, 752958(2021).
  13. Thomas, B. B., et al. A new immunodeficient retinal dystrophic rat model for transplantation studies using human-derived cells. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 256 (11), 2113-2125 (2018).
  14. Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (12), 4611-4616 (2004).
  15. Cameron, D., et al. The optokinetic response as a quantitative measure of visual acuity in zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (80), e50832(2013).
  16. Tabata, H., Shimizu, N., Wada, Y., Miura, K., Kawano, K. Initiation of the optokinetic response (OKR) in mice. Journal of Vision. 10 (1), 13(2010).
  17. Huang, Y. -Y., Neuhauss, S. C. F. The optokinetic response in zebrafish and its applications. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 13, 1899-1916 (2008).
  18. Sirkin, D. W., Hess, B. J., Precht, W. Optokinetic nystagmus in albino rats depends on stimulus pattern. Experimental Brain Research. 61 (1), 218-221 (1985).
  19. Dietrich, M., et al. Using optical coherence tomography and optokinetic response as structural and functional visual system readouts in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (143), e58571(2019).
  20. Rajendran Nair, D. S., et al. Long-term transplant effects of iPSC-RPE monolayer in immunodeficient RCS rats. Cells. 10 (11), 2951(2021).
  21. Kretschmer, F., Sajgo, S., Kretschmer, V., Badea, T. C. A system to measure the Optokinetic and optomotor response in mice. Journal of Neuroscience Methods. 256, 91-105 (2015).
  22. Lin, T. -C., et al. Assessment of safety and functional efficacy of stem cell-based therapeutic approaches using retinal degenerative animal models. Stem Cells International. 2017, 9428176(2017).
  23. Ryals, R. C., et al. Long-term characterization of retinal degeneration in Royal College of Surgeons Rats using spectral-domain optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (3), 1378-1386 (2017).
  24. Di Pierdomenico, J., et al. Early events in retinal degeneration caused by rhodopsin mutation or pigment epithelium malfunction: Differences and similarities. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 14(2017).
  25. McGill, T. J., Douglas, R. M., Lund, R. D., Prusky, G. T. Quantification of spatial vision in the Royal College of Surgeons Rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (3), 932-936 (2004).
  26. Hetherington, L., Benn, M., Coffey, P., Lund, R. Sensory capacity of the Royal College of Surgeons rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 3979-3983 (2000).
  27. Sauvé, Y., Pinilla, I., Lund, R. D. Partial preservation of rod and cone ERG function following subretinal injection of ARPE-19 cells in RCS rats. Vision Research. 46 (8), 1459-1472 (2006).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Nistagmo Optocin ticoAcuidade VisualRastreamento da Cabe aEst mulo VisualFrequ ncia EspacialSuporte de PlexiglassMicroc meraDegenera o RetinianaFun o Visual
Vídeo em breve

Artigos relacionados