Estudando o tráfico de proteínas de membrana em células fotorreceptoras de Drosophila usando proteínas marcadas pelo eGFP

Resumo

Aqui, métodos não invasivos são descritos para localização de proteínas de membrana fotorreceptora e avaliação da degeneração da retina no olho composto de Drosophila usando fluorescência eGFP.

Resumo

O tráfico de proteínas de membrana regula a incorporação e remoção de receptores e canais de íons na membrana plasmática. Esse processo é fundamentalmente importante para a função celular e a integridade celular dos neurônios. As células fotorreceptoras de drosophila tornaram-se um modelo para estudar o tráfico de proteínas de membrana. Além da rodopsina, que após a iluminação torna-se internalizada a partir da membrana fotorreceptora e é degradada, o canal de íons de íons potencial-semelhante ao receptor transitório (TRPL) em Drosophila exibe uma translocação dependente da luz entre a membrana fotorreceptora rabdomeral (onde está localizada no escuro) e o corpo celular fotorreceptor (para o qual é transportado após a iluminação). Este transporte intracelular de TRPL pode ser estudado de forma simples e não invasiva expressando TRPL marcado pelo EGFP em células fotorreceptoras. A fluorescência eGFP pode então ser observada tanto no pseudopupil profundo quanto por microscopia de imersão hídrica. Esses métodos permitem a detecção de fluorescência no olho intacto e, portanto, são úteis para ensaios de alto rendimento e telas genéticas para mutantes de Drosophila defeituosos na translocação TRPL. Aqui, a preparação de moscas, as técnicas microscópicas, bem como os métodos de quantificação utilizados para estudar esta translocação acionada pela luz de TRPL são explicados em detalhes. Esses métodos podem ser aplicados também para estudos de tráfico em outras proteínas fotorreceptoras de Drosophila , por exemplo, rhodopsina. Além disso, utilizando proteínas rabdomerais marcadas pelo eGFP, esses métodos podem ser usados para avaliar a degeneração de células fotorreceptoras.

Introdução

Ao fornecer e remover proteínas de e para a membrana plasmática, o tráfico de proteínas de membrana nos neurônios controla o equipamento de membrana plasmática com receptores, bem como canais de íons e, como resultado, regula a função neuronal. A má regulação ou defeitos no tráfico de proteínas normalmente têm efeitos prejudiciais sobre as células e resultam em degeneração neuronal. Em humanos, isso pode causar doenças neurodegenerativas como Alzheimer e Mal de Parkinson ou Retinite pigmentosa¹. Fotorreceptores no olho composto de Drosophila melanogaster tornaram-se um sistema modelo in vivo para estudar o tráfico de ....

Protocolo

1. Considerações gerais

1. Use estoques de Drosophila expressando uma proteína de fluorescência localizada permanentemente para análise morfológica (por exemplo, TRP:::eGFP, eGFP::NINAC) e proteínas translocantes para análises sobre tráfico de proteínas (por exemplo, TRPL:::eGFP, Arr2:::eGFP).
2. Condições de exposição à luz pré-dedeterminadas de moscas selecionadas para a abordagem experimental.
   1. Para adaptação escura, mantenha as moscas em caixas escuras pelo período desejado a 25 °C. Para iluminação de até 16 h em experimentos de translocação (por exemplo, TRPL::eGFP expressando moscas), mantenha moscas sob um tubo fl....

Resultados

Foram geradas moscas transgênicas de Drosophila expressando uma proteína de fusão TRPL::eGFP sob o controle do promotor de rodopsina 1. Nestas moscas, TRPL::eGFP é expresso em células fotorreceptoras R1-6 do olho composto e exibe uma localização dependente da iluminação. Quando as moscas são mantidas no escuro, TRPL::eGFP é incorporada aos rabdomiôs externos. Após a iluminação por várias horas, o TRPL transloca-se no corpo celular onde é armazenado em um compartimento enriquecido com ER. .......

Discussão

A aplicabilidade das proteínas de fluorescência e a simplicidade da triagem por imagem DPP e microscopia de imersão em água da retina tem sido comprovadamente bem sucedida por muitos grupos¹². Estratégias semelhantes às apresentadas aqui têm sido utilizadas em diversas telas genéticas para detectar defeitos nos níveis de expressão de rodopsina, homeostase, organização da retina ou integridade celular com a ajuda de Rh1::eGFP 17,18,19,20,21.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo de centrífuga de 15 mL	Greiner Bio-One	188271
CO2 almofada de mosca anestésica	Flystuff	59-172
Lâmpada de luz fria (KL 1500 LCD)	Zeiss
Fiji/ImageJ	NIH
Microscópio de fluorescência com lâmpada UV, câmera, conjunto de filtros e software (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 azul edição)	Zeiss
(Lumilux T8, L 30W / 840, 4000 K, G13) < br / > [1750 Lux, Ee< / sub>470nm< / sup> = 298 µ W cm-2, Ee590nm = 215 µ W cm-2] e [760 Lux, Ee470nm = 173 µ W cm-2, Ee590nm = 147 µ W cm-2]	Pipeta de	Osram 4050300518039
(20-200 µ L)	Eppendorf
Object slide	Roth	0656.1
Placa de Petri (94 mm)	Greiner Bio-One	633102
Ponteiras de pipeta (200 µ L)	Labsolute	7695844
plasticina (Blu-Tack)	Bostik	30811745
microscópio estéreo (SMZ445)	Nikon
microscópio estéreo com lâmpada UV, câmera, conjunto de filtro e software (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12)	Leica

Tubo fluorescente laboratório