Method Article

Visualização Simultânea da Dinâmica dos Microtúbulos Cruzados e Únicos In Vitro pela Microscopia TIRF

DOI:

10.3791/63377

⸱

February 18th, 2022

 ,  , 
1Molecular Biology, Massachusetts General Hospital, 2Department of Genetics, Harvard Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, um ensaio de reconstituição in vitro baseado em microscopia TIRF é apresentado para quantificar e comparar simultaneamente a dinâmica de duas populações de microtúbulos. Um método é descrito para visualizar simultaneamente a atividade coletiva de múltiplas proteínas associadas a microtúbulos em feixes de microtúbulos interligados e microtúbulos únicos.

Abstract

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Microtúbulos são polímeros de heterodimers αβ-tubulin que se organizam em estruturas distintas nas células. Arquiteturas e redes baseadas em microtúbulos geralmente contêm subconjuntos de matrizes de microtúbulos que diferem em suas propriedades dinâmicas. Por exemplo, na divisão de células, pacotes estáveis de microtúbulos transligados coexistem perto de microtúbulos dinâmicos não transligados. Estudos de reconstituição in vitro baseados em TIRF-microscopia permitem a visualização simultânea da dinâmica dessas diferentes matrizes de microtúbulos. Neste ensaio, uma câmara de imagem é montada com microtúbulos imobilizados pela superfície, que estão presentes como filamentos únicos ou organizados em feixes transligados. A introdução de tubulinas, nucleotídeos e reguladores de proteínas permite a visualização direta de proteínas associadas e de propriedades dinâmicas de microtúbulos unides e interligados. Além disso, mudanças que ocorrem à medida que microtúbulos únicos dinâmicos se organizam em pacotes podem ser monitorados em tempo real. O método descrito aqui permite uma avaliação sistemática da atividade e localização de proteínas individuais, bem como efeitos sinérgicos dos reguladores de proteínas em dois subconjuntos microtúbulos diferentes em condições experimentais idênticas, fornecendo assim insights mecanicistas que são inacessíveis por outros métodos.

Introduction

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Microtúbulos são biopolímeros que formam andaimes estruturais essenciais para múltiplos processos celulares, desde transporte intracelular e posicionamento de organela até divisão celular e alongamento. Para executar essas diversas funções, microtúbulos individuais são organizados em matrizes do tamanho de micron, como fusos mitotísticos, axônios ciliares, feixes neuronais, matrizes interfásicas e matrizes corticais vegetais. Um motivo arquitetônico onipresente encontrado nessas estruturas é um feixe de microtúbulos interligados ao longo de seus comprimentos1. Uma característica intrigante de várias estruturas baseadas em microtúbulos é a coexi....

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Protocol

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1. Prepare os reagentes

  1. Prepare buffers e reagentes conforme descrito na Tabela 1 e Tabela 2. Durante o experimento, mantenha todas as soluções no gelo, a menos que seja observado de outra forma.
SoluçãoComponentesDuração recomendada do armazenamentoAnotações
5X BRB80400 mM K-PIPES, 5 mM MgCl2, 5 mM EGTA, pH....

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Results

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O experimento descrito acima foi realizado usando microtubulos biotinilados biotinilados rotulados por 647 nm, microtubulas não biotiniladas com rótulo fluoreto, e mistura de tubulina solúvel com rótulo fluorólmico de 560 nm. Os microtúbulos foram cruzados pela proteína crosslinker PRC1 (rotulada por GFP). Após a gerada por feixes imobilizados e microtúbulos únicos (etapa 5.11), a câmara de imagem foi montada em um objetivo de óleo TIRF 100X 1.49 NA e visualizada nos canais de fluorescência de 560 nm e 647 nm. Microtúbul.......

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Discussion

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O experimento descrito aqui expande significativamente o escopo e a complexidade dos ensaios convencionais de reconstituição da microtúbula, que são tradicionalmente realizados em microtúbulos únicos ou em um tipo de matriz. O ensaio atual fornece um método para quantificar e comparar simultaneamente a atividade de MAP regulatório em duas populações, ou seja, microtúbulos únicos e pacotes interligados. Além disso, este ensaio permite o exame de dois tipos de feixes: aqueles que são pré-formados a partir de sementes estáv.......

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Disclosures

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Os autores não declaram interesses concorrentes.

Acknowledgements

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Este trabalho foi apoiado por uma subvenção do NIH (nº 1DP2GM126894-01), e por fundos da Pew Charitable Trusts e da Smith Family Foundation para r.S. Os autores agradecem ao Dr. Shuo Jiang por sua contribuição para o desenvolvimento e otimização dos protocolos.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(±)-6-Hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-ácido carboxílico (Trolox)Sigma Aldrich238813
1,4-piperazinadietanossulfônico (PIPES)Sigma AldrichP6757
18x18 mm #1.5 lamínulas Microscopia Eletrônica Sciences63787
2-Mercaptoetanol (BME)Sigma AldrichM-6250
24x60 mm #1.5 lamínulasMicroscopia Eletrônica Sciences63793
405/488/560/647 nm Laser Quad Band ChromaTRF89901-NK
AcetonaSigma Aldrich320110
Adenosina 5'-trifosfato dissódico sal hidratado (ATP)Sigma AldrichA7699-5G
Avidin, NeutrAvidin® Proteína de ligação à biotina (sondas moleculares)Thermo Fischer ScientificA2666
Sonicador de banho: Limpador Branson 2800BransonCPX2800H
Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 11 x 34 mmBeckman-Coulter 
Tubos de Policarbonato para Parede Espessa Beckman Coulter, 8 x 34 mmBeckman-Coulter 
Biotina-PEG-SVA, MW 5.000Laysan Bio#Biotin-PEG-SVA-5000
Albumina de soro bovino (BSA)Sigma Aldrich2905
CatalaseSigmaAldrich C40
Corning LSE Mini Microcentrífuga, AC100-240VCorning6670
Toalhetes de Tarefas DelicadasKimtech34120
Ditiotreitol (DTT)GoldBioDTT10
Filtro de emissãoChromaET610/75m
Etanol (200-proof)Decon Labs2705
Ácido etilenoglicol tetracético (EGTA)Sigma Aldrich3777
Glicose OxidaseSigma AldrichG2133
GMPCPPJena Bioscience NU-405
Guanosina 5'-trifosfato de sódio hidratado (GTP)Sigma AldrichG8877
Hellmanex III detergente Sigma AldrichZ805939
, Tipo AFisher Scientific77010
Kappa-caseínaSigma AldrichC0406
LanolinaFisher ScientificS25376
Tecido de Limpeza de LentesThorLabsMC-5
Cloreto de Magnésio (MgCl2)Sigma AldrichM9272
Centrífuga deMetilcelulose Sigma AldrichM0512
Microfuge 16Beckman-Coulter A46474
, Vidro Branco Diamante, 25 x 75mm, 90° Bordas do Solo, BRANCO FrostedGlobe Scientific1380-50W
mPEG-Succinimidil Valerato, MW 5,000 Laysan Bio#NH2-PEG-VA-5K
Optima™ Ultracentrífuga de Mesa Max-XPBeckman-Coulter 
ParafinaFisher ScientificP31-500
PELCO Reverse (fechamento automático), Pinças FinasTed Pella5377-NM
Petrolato, BrancoFisher Scientific18-605-050
Limpador de Plasma, 115VHarrick PlasmaPDC-001
Hidróxido de Potássio (KOH)Sigma Aldrich221473
Bicarbonato de sódioSigma AldrichS6014
SacaroseSigma AldrichS7903
Thermal-Lok Banho de Calor Seco de 1 PosiçãoUSA Scientific2510-1101
Thermal-Lok Block para Tubos de 1.5 e 2.0 mLUSA Scientific2520-0000
Thermo Scientific™ Pierce™ Quebra de títulos™ Solução TCEP, pH neutro; 500mMThermo Fischer ScientificPI-77720
TIRF 100X NA 1.49 Objetiva de ÓleoNikonCFI Apocromat TIRF 100XC Microscópio TIRF de Óleo
NikonEclipse Ti
TLA 120.1 rotorBeckman-Coulter 
Rotor TLA 120.2Beckman-Coulter 
Proteína da tubulina (>99% pura): cérebro suínoCitoesqueletoT240
Proteína da tubulina (biotina):CitoesqueletoT333P
Proteína da tubulina (fluorescente HiLyte 647): cérebro suínoCitoesqueletoTL670M
Proteína da tubulina (X-rodamina): cérebro bovinoCitoesqueletoTL620M
VECTABOND® Reagente, Vetor de Adesão de Seção de TecidoBiolabsSP-1800-7
VWR® Incubadora de tamanho pessoal, 120 V, 50/60 Hz, 0,6 AVWR97025-630
343778343776Óleo de imersão Bancada Lâminas de Microscópio 393315362224357656 do cérebro suíno

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Subramanian, R., Kapoor, T. M. Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures. Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).
  2. Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. Stability properties of neuronal mic....

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TIRF MicroscopyMicrotubule DynamicsCrosslinked MicrotubulesSingle MicrotubulesIn Vitro ReconstitutionFluorescence ImagingMicrotubule BundlesProtein RegulatorsSurface ImmobilizationMicrotubule Organization

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