Quantificando o transporte de ferro através da placenta de camundongo in vivo usando isótopos de ferro não radioativos

Resumo

Este artigo demonstra como preparar e administrar ferro isotópico não radioativo ligado à transferrina para estudos de transporte de ferro na gravidez de camundongos. A abordagem para quantificar o ferro isotópico em compartimentos fetoplacentários também é descrita.

Resumo

O ferro é essencial para a saúde materna e fetal durante a gravidez, com aproximadamente 1 g de ferro necessário em humanos para sustentar uma gravidez saudável. A dotação fetal de ferro é totalmente dependente da transferência de ferro através da placenta, e as perturbações dessa transferência podem levar a resultados adversos na gravidez. Em camundongos, a medição dos fluxos de ferro através da placenta tradicionalmente dependia de isótopos de ferro radioativos, uma abordagem altamente sensível, mas onerosa. Os isótopos estáveis de ferro (⁵⁷Fe e ⁵⁸Fe) oferecem uma alternativa não radioativa para uso em estudos de gravidez em humanos.

Sob condições fisiológicas, o ferro ligado à transferrina é a forma predominante de ferro absorvida pela placenta. Assim, ⁵⁸Fe-transferrina foram preparados e injetados por via intravenosa em mães grávidas para avaliar diretamente o transporte placentário de ferro e contornar a absorção intestinal materna de ferro como uma variável de confusão. O ferro isotópico foi quantificado na placenta e nos tecidos embrionários de camundongos por espectrometria de massa plasmática indutivamente acoplada (ICP-MS). Esses métodos também podem ser empregados em outros sistemas de fisiologia ou doença de modelos animais para quantificar a dinâmica do ferro in vivo.

Introdução

O ferro é fundamental para vários processos metabólicos, incluindo crescimento e desenvolvimento, produção de energia e transporte de oxigênio¹. A manutenção da homeostase do ferro é um processo dinâmico e coordenado. O ferro é absorvido dos alimentos no duodeno e transportado ao redor do corpo na circulação ligada à transferrina da proteína de transporte de ferro (Tf). É utilizado por todas as células para processos enzimáticos, incorporado à hemoglobina em eritrócitos nascentes e reciclado de eritrócitos envelhecidos por macrófagos. O ferro é armazenado no fígado quando em excesso e perdido do corpo através de hemorragia ou descamação celular. A quantidade de ferro em circulação é o resultado do equilíbrio entre o consumo e o fornecimento de ferro, sendo este último rigidamente regulado pelo hormônio hepcidina (HAMP), regulador central da homeostase do ferro¹. A hepcidina funciona para limitar a biodisponibilidade de ferro no sangue, ocluindo ou induzindo ubiquitinação e degradando a ferroportina exportadora de ferro (FPN)². A redução da NPF funcional leva à diminuição da absorção dietética de ferro, sequestro de ferro no fígado e diminuição da reciclagem de ferro dos macrófagos¹.

A hepcidina é regulada pelo estado de ferro, inflamação, impulso eritropoiético e gravidez (revisada em ³). Dado que a homeostase do ferro é altamente dinâmica, é importante entender e medir o pool total de ferro e a distribuição e rotatividade de ferro. Estudos em animais tradicionalmente se baseavam em isótopos de ferro radioativos, uma abordagem altamente sensível, mas onerosa, para medir a dinâmica do ferro. Entretanto, em estudos mais recentes, incluindo o estudo aqui^apresentado4, isótopos de ferro estáveis não radioativos (⁵⁸Fe) são utilizados para medir o transporte de ferro durante a gestação 5,6,7,8,9. Isótopos estáveis são ferramentas valiosas para estudar o metabolismo de nutrientes (revisado em ¹⁰). O uso de isótopos estáveis de ferro em estudos em humanos demonstrou que i) a absorção de ferro aumenta no final da gestação^5,6, ii) a transferência de ferro dietético para o feto é dependente do status de ferro materno⁷, iii) o ferro heme ingerido maternalmente é mais prontamente incorporado pelo feto do que o ferro não-heme 8, e iv) a transferência de ferro para o feto está negativamente correlacionada com os níveis maternos de hepcidina ^{8, 9}. Esses experimentos mediram isótopos de ferro em soros ou sua incorporação em hemácias; no entanto, a medida do ferro incorporado isoladamente nas hemácias pode subestimar a verdadeira absorção de ferro⁹. No presente estudo, tanto o ferro heme quanto o ferro não heme são medidos nos tecidos.

Durante a gravidez, o ferro é necessário para suportar a expansão do volume de glóbulos vermelhos maternos e para a transferência através da placenta para apoiar o crescimento e desenvolvimento do feto¹¹. A dotação fetal de ferro é totalmente dependente do transporte de ferro através da placenta. Durante a gravidez humana 12 e roedor ^4,13, os níveis de hepcidina diminuem drasticamente, aumentando a disponibilidade de ferro plasmático para transferência para o feto.

Os fundamentos do transporte placentário de ferro foram inicialmente caracterizados nas décadas de 1950-70 usando traçadores radioativos (⁵⁹Fe e ⁵⁵Fe). Esses estudos determinaram que o transporte de ferro através da placenta é unidirecional 14,15 e que a transferrina diférrica é uma importante fonte de ferro para a placenta e o feto ^16,17. A compreensão atual do transporte placentário de ferro é mais completa, embora alguns dos principais transportadores de ferro e mecanismos regulatórios permaneçam desconhecidos. Os modelos de camundongos têm sido essenciais para a compreensão da regulação e do transporte de ferro¹⁸ porque os principais transportadores e mecanismos são notavelmente semelhantes. Tanto a placenta humana quanto a de camundongo são hemocoriais, ou seja, o sangue materno está em contato direto com o córion fetal¹⁹. No entanto, existem algumas diferenças estruturais notáveis.

O sincitiotrofoblasto é a camada celular placentária que separa a circulação materna e fetal e transporta ativamente ferro e outros nutrientes²⁰. Em humanos, o sincitiotrofoblasto é uma única camada de células fundidas. Em contraste, a placenta do rato consiste em duas camadas²¹ do sinciciotrofoblasto, Syn-I e Syn-II. No entanto, as junções gap na interface do Syn-I e do Syn-II permitem a difusão de nutrientes entre as camadas^22,23. Assim, essas camadas funcionam como uma única camada sincicial semelhante ao sinciciotrofoblasto humano. Semelhanças e diferenças adicionais entre placentas humanas e de camundongos são revisadas por Rossant e Cross²¹. O transporte placentário de ferro é desencadeado pela ligação do ferro-Tf do sangue materno ao receptor de transferrina (TfR1) localizado no lado apical do sincitiotrofoblasto²⁴. Essa interação induz a internalização ferro-Tf/TfR1 via endocitose mediada por clatrina²⁵. O ferro é então liberado da Tf no endossomo ácido²⁶, reduzido a ferro ferroso por uma ferrirredutase indeterminada e exportado do endossomo para o citoplasma por um transportador ainda a ser determinado. Como o ferro é acompanhado dentro do sincitiotrofoblasto também continua a ser descrito. O ferro é eventualmente transportado para o lado fetal pelo exportador de ferro, FPN, localizado na superfície basal ou voltada para o fecho do sincitiotrofoblasto (revisado em²⁷).

Para compreender como a regulação fisiológica e patológica da TfR1, FPN e hepcidina afeta o transporte placentário de ferro, isótopos estáveis de ferro foram utilizados para quantificar o transporte de ferro da circulação materna para a placenta e embrião in vivo⁴. Este trabalho apresenta os métodos de preparação e administração de transferrina isotópica de ferro em ratas prenhes, processamento de tecidos para ICP-MS e cálculo das concentrações de ferro em tecidos. O uso de isótopos estáveis de ferro in vivo pode ser adaptado para investigar a regulação e distribuição de ferro em diferentes modelos animais para investigar a regulação fisiológica e patológica do ferro.

Protocolo

Todos os protocolos e procedimentos experimentais em animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Universidade da Califórnia em Los Angeles.

1. Preparação de ⁵⁸Fe-Tf

NOTA: O protocolo usa ⁵⁸Fe; no entanto, um protocolo idêntico pode ser usado para ⁵⁷Fe. Qualquer isótopo pode ser usado e descartado como um produto químico de ferro padrão sem precauções adicionais.

1. ^Dissolver58 Fe em 12 N HCl a 50 μL de HCl/mg de ⁵⁸Fe.
   1. Adicione HCl ao metal no frasco para injetáveis de vidro fornecido pelo vendedor e substitua a tampa frouxamente. Para dissolver o ferro, aquecer a solução de ⁵⁸Fe/HCl a 60 °C durante 1 h. Se ainda não estiver dissolvido, deixe a solução durante a noite à temperatura ambiente no exaustor para se dissolver.
      NOTA: A solução dissolvida ^{de 58}Fe/HCl é de cor laranja-amarelada.
      Fe 3 O 4(s) + 8HCl(aq) → Fe(II)Cl 2(aq) + 2Fe(III)Cl_3(aq) + _4H 2 O
2. Oxidar qualquer Fe(^II)Cl₂ restante para gerar a solução de Fe^(III)Cl₃ .
   1. Aqueça a solução de ⁵⁸Fe/HCl a 60 °C com a tampa desligada para facilitar a oxidação.
   2. Adicionar 1 μL de 35% H 2 O₂por 50 μL de solução de ⁵⁸Fe/HCl para facilitar ainda mais a oxidação.
      Fe(^II)Cl_2(aq) + O 2 + 4HCl → 4Fe(^III)Cl_3(aq) + 2H₂ O
3. Preparar a solução de cloreto férrico (⁵⁸Fe^(III)Cl₃).
   1. Deixar a solução de cloreto férrico no exaustor a 60 °C com a tampa afastada para evaporar a amostra.
      NOTA: A evaporação pode demorar entre um e vários dias.
   2. Reconstituir 58 Fe(III)Cl 3 a 100 mM com H 2 O ultrapuro e calcular a quantidade de H 2 O ultrapuro necessária com base no peso inicial do metal utilizado no passo 1.1 (o peso molecular de ⁵⁸ Fe^(III)Cl₃ é 162.2).
4. Preparar 58 Fe(III)-nitrilotriacetato (NTA) incubando ⁵⁸Fe^(III)Cl 3 com NTA numa proporção molar de 1:5 na presença de 20 mM de NaHCO₃.
   1. Prepare NTA de 500 mM em 1 N NaOH.
   2. Prepare 5x tampão de carregamento de transferrina (0,5 M HEPES, pH 7,5; 0,75 M NaCl).
   3. Preparar 1 M NaHCO₃ em ultrapuro H₂O.
   4. A um tubo cónico de 15 ml, adicionar 150 μL de 100 mM 58 Fe(^III)Cl 3 solução (a partir do passo 1.3.2), 150 μL de 500 mM NTA preparados em 1 N NaOH, 480 μL de ultrapuro H₂O, 200 μL de ^5xtampão de carregamento de transferrina e 20 μL de 1 M de NaHCO₃ solução.
   5. Incubar a mistura durante 5 min à temperatura ambiente.
5. Carregue apo-Tf com 58 Fe^(III)-NTA para formar ⁵⁸Fe-Tf.
   NOTA: Este protocolo foi adaptado de McCarthy e Kosman²⁸.
   1. Dissolver 500 mg de apo-Tf em 4 mL de tampão de carga de 1x Tf.
   2. Ao tubo cónico de 15 ml no passo 1.4.4 contendo 1 ml da solução de ⁵⁸Fe^(III)-NTA, adicionar 4 ml de solução de apo-Tf.
      NOTA: Esta é uma proporção molar de 3:1 de ⁵⁸Fe-NTA com apo-Tf. Cada Tf contém 2 sítios de ligação Fe; O excesso ^{de 58}Fe-NTA foi adicionado para garantir que o Tf estivesse totalmente carregado.
   3. Para permitir a carga máxima de ⁵⁸Fe-NTA na apo-Tf, verifique se a solução está em pH 7,5 e ajuste o pH, se necessário, com NaHCO₃ ou HCl.
   4. Incubar durante 2,5 h à temperatura ambiente.
6. Remova o excesso não acoplado ⁵⁸Fe^(III)-NTA e liberado NTA.
   1. Transferir a solução de 58 Fe-Tf para uma coluna de corte de peso molecular (corte de 30 kDa) e centrifugar a ^2.500× g durante 15 min à temperatura ambiente.
   2. Lavar a coluna com 10 mL de tampão de carga de transferrina 1x e centrifugar a 2.500 × g por 15 min à temperatura ambiente. Repetir a lavagem e centrifugação, realizar uma lavagem salina com 10 mL de solução salina e centrifugar a 2.500 × g por 15 min à temperatura ambiente.
7. Calcular a concentração de ⁵⁸Fe-Tf.
   NOTA: Devido à adição do excesso de ⁵⁸Fe no passo 1.5.2, suponha que toda a transferrina é diférrica. Como 500 mg de apo-Tf foi usado, ~ 500 mg ⁵⁸Fe-Tf foi produzido na etapa 1.5.4.
   1. Medir o volume recuperado da centrifugação após a lavagem com solução salina na etapa 1.6.2.
   2. Divida 500 mg pelo volume recuperado para determinar a concentração (em mg/mL) da solução de ⁵⁸Fe-Tf.
8. Esterilizar a solução de ⁵⁸Fe-Tf utilizando um filtro de seringa de 0,22 μm; conservar a 4 °C até estarem prontas a utilizar.
   NOTA: ⁵⁸Fe-Tf solução foi utilizada entre 1 a 4 semanas após o preparo.

2. Configure gestações de camundongos cronometrados

1. Use camundongos fêmeas de 6 a 8 semanas de idade. Coloque os animais em uma dieta pobre em ferro (4 ppm de ferro) ou ração padrão (185 ppm de ferro) por 2 semanas antes do acasalamento e mantenha os animais nas respectivas dietas durante a gravidez.
2. Opção 01: Confirmar a gravidez por ganho de peso em E7.5.
   1. Configure várias gaiolas de reprodução. Para cada gaiola, combine 2 fêmeas com 1 macho durante a noite; o dia seguinte, quando os animais são separados, é considerado dia embrionário (E)0.5. Pesar as fêmeas em E7.5 para determinar se estão grávidas. Acasalar machos novamente com fêmeas que não ganharam peso.
      NOTA: No WT C57BL/6, um ganho de peso de 1 g em E7.5 é um bom indicador de gravidez. Este método garante que a implantação ocorreu dentro de um prazo específico de 16 horas, permitindo o tratamento síncrono de todos os animais que engravidaram durante o mesmo período de acasalamento.
3. Opção 02: Confirmar a gravidez por verificações de plugue.
   1. Combine 2 fêmeas com 1 macho e realize verificações diárias de plugue para determinar se a cópula ocorreu.
      NOTA: Este método pode resultar em gravidezes escalonadas, e a presença de um plugue não garante a gravidez.

3. Administrar ⁵⁸Fe-Tf por via intravenosa a ratas grávidas E17.5

1. Prepare ⁵⁸Fe-Tf da etapa 1.8 para injeção.
   1. Preparar solução ^{de 58}Fe-Tf a 35 mg/mL em solução salina; injetar 100 μL por rato.
   2. Encha uma seringa de insulina com 100 μL da solução de ⁵⁸Fe-Tf.
      NOTA: Cada dose contém 3,5 mg de 58 Fe-Tf humanos (5 μg de ⁵⁸Fe).
2. Anestesiar uma rata grávida usando isoflurano.
   1. Use um regulador de isoflurano com uma câmara.
   2. Use as seguintes configurações: 5% de isoflurano, 2 L/mL de O 2,₂ min.
   3. Confirme se o rato está anestesiado procurando falta de resposta a uma beliscão do dedo do pé.
   4. Aplique o lubrificante ocular na superfície do olho e coloque o rato numa almofada de aquecimento.
3. Injete lenta e cuidadosamente a solução ^{de 58}Fe-Tf no seio retroorbital.
4. Permitir que o rato se recupere da anestesia; não deixe o animal sozinho até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a retração esternal.
5. Seis horas após a injeção, eutanasiar E17.5 fêmeas grávidas por overdose de isoflurano.
   1. Realizar uma punção cardíaca para exsanguinar o rato como uma forma de eutanásia secundária.
   2. Prenda os pés para baixo com agulhas para estabilização.
6. Colete os fígados da placenta e do embrião.
   1. Usando pinça estéril e tesoura de dissecação, remova cuidadosamente o útero da rata grávida. Corte uma unidade fetal-placentária placentária, que compreende um único feto e placenta no saco amniótico cercado por uma porção do útero.
   2. Corte cuidadosamente o útero e o saco amniótico sem perturbar o feto e a placenta.
   3. Descasque o saco amniótico e remova o feto e a placenta.
   4. Corte o cordão umbilical.
   5. Limpe o feto e a placenta em uma limpeza de tarefas limpas para remover o excesso de líquido amniótico.
   6. Registre os pesos de toda a placenta.
   7. Corte cada placenta ao meio com uma lâmina de barbear, coloque cada metade em um tubo de 2,0 mL e congele rapidamente em nitrogênio líquido.
      NOTA: Como ^o58 Fe não requer precauções especiais de manuseio e descarte, metade da placenta pode ser usada para a medição do ⁵⁸Fe e a outra metade para quaisquer outras análises, incluindo a quantificação da expressão do receptor de transferrina (TFR1) e ferroportina (FPN) por western blotting e qPCR.
   8. Para coletar fígados embrionários, sacrifique o embrião: use uma lâmina de barbear para decapitar rapidamente o embrião.
      NOTA: No E17.5, todos os embriões no útero devem ser eutanasiados individualmente, mesmo que não sejam utilizados no estudo.
   9. Prenda o embrião para estabilização, deixando o abdômen exposto.
   10. Usando uma tesoura de dissecção, faça uma pequena incisão onde o cordão umbilical foi anexado, insira uma extremidade da tesoura de dissecção na incisão e realize um corte plano mediano em direção ao plano coronal de cerca de 1/4 de polegada. Em seguida, realize cortes planos transversais para expor o fígado fetal.
   11. Use fórceps para remover o fígado fetal.
   12. Registre os pesos de todo o fígado embrionário.
   13. Coloque os fígados embrionários inteiros em tubos de 2 mL e congele-os em nitrogênio líquido.
       NOTA: Alternativamente, apenas uma parte do fígado embrionário pode ser usada para a medição de ⁵⁸Fe, se análises adicionais forem desejadas. O uso de tubos de 2,0 mL permite uma melhor homogeneização tecidual do que tubos de 1,5 mL.
7. Conservar os tecidos indefinidamente a -80 °C.

4. Tecidos de processo para análise quantitativa de ferro por ICP-MS

1. Processe a placenta e os fígados fetais para a quantificação do ferro não-heme.
   1. Descongele as metades placentárias e fígados fetais inteiros e pese as metades placentárias (ver passo 3.6.12 para registar os pesos hepáticos fetais).
   2. Adicionar 400 μL de solução de precipitação proteica (HCl 0,53 N, TCA a 5,3%).
   3. Homogeneize o tecido usando um homogeneizador elétrico.
   4. Incubar as amostras a 100 °C durante 1 h.
   5. Arrefecer as amostras em água à temperatura ambiente durante 2 min.
   6. Abra as tampas para liberar a pressão e, em seguida, feche os tubos novamente.
   7. Centrífuga a 17.000 × g por 10 min à temperatura ambiente para detritos de tecido de pellets.
   8. Transfira cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo rotulado.
   9. Envie amostras para análise ICP-MS.
2. Processar a placenta e os fígados fetais para a quantificação do ferro heme.
   NOTA: Após a extração de ferro não heme na etapa 1, o ferro restante no pellet é predominantemente heme.
   1. Registar o peso de cada pellet a partir da etapa 4.1.7.
   2. Digerir os pellets em 10 mL de HNO₃ concentrado a 70% suplementado com 1 mL de 30% H 2 O₂
      NOTA: Consulte o núcleo ou centro da ICP-MS para otimizar o volume de HNO₃ para estudos específicos; o volume dependerá, em parte, do peso da amostra.
   3. Aquecer as amostras a 200 °C durante 15 minutos.
   4. Envie as amostras para análise ICP-MS.
      NOTA: Se a distinção entre fontes de ferro heme e não-heme não for necessária e apenas o ferro total for medido, o tecido inteiro pode ser digerido no HNO₃ como o primeiro passo.

5. Análise dos dados

NOTA: Os dados da ICP-MS foram fornecidos como concentrações de ⁵⁶Fe e ⁵⁸Fe em ng/mL ou mg, ppb (Tabela 1). ⁵⁶ anos Fe é o isótopo de ferro mais abundante na natureza, e sua medição reflete o acúmulo de ferro na placenta / embrião durante toda a gravidez, enquanto a medição ^{de 58}Fe reflete o ferro que foi transferido durante 6 h após a injeção.

1. Subtraia a abundância natural de 58 Fe (0,28% do Fe) dos valores medidos de ⁵⁸Fe.
2. Calcule o total de não-heme ⁵⁸Fe.
   1. Calcular o fígado embrionário total de ferro não-heme (ng) multiplicando primeiro a concentração de ferro (ng/mL) calculada na etapa 5.1 pelo volume (mL) durante o processamento inicial na etapa 4.1.2 para estimar o total ^{de 58}Fe.
   2. Calcular a quantidade de ferro em toda a placenta tomando o peso total da placenta medido no passo 3.6.6 e dividindo-o pelo peso da placenta processada no passo 4.1.1. Multiplique este valor pelo ferro não-heme total (ng) calculado no passo 5.2.1 para obter o teor total de nonheme ⁵⁸Fe da placenta.
3. Calcule o total de heme ⁵⁸Fe.
   1. Calcular o heme total ⁵⁸Fe multiplicando primeiro a concentração de ferro (ng/mg) calculada na etapa 5.1 pelo peso do pellet (em mg) medido na etapa 4.2.1.
   2. Em seguida, dividir o peso total da placenta medido na etapa 3.5.1 pelo peso do pellet de placenta medido na etapa 4.2.1. Multiplique este valor pelo ferro heme total (ng) calculado no passo 5.3.1 para obter o teor total de heme ⁵⁸Fe da placenta.
4. Somar os valores calculados de não-heme e heme ⁵⁸Fe para determinar o teor total de ferro para cada tecido.

Figura 1: Resumo visual das etapas do protocolo . (A) Preparação de ⁵⁸Fe-transferrina. (B) Administração in vivo de ⁵⁸Fe-transferrina. (C) Coleta e armazenamento de tecidos. (D) Processamento da placenta e do fígado embrionário para quantificação de espécies metálicas por ICP-MS. Abreviaturas: Fe = ferro; NTA = ácido nitrilotriacético; Tf = transferrina; PPS = solução de precipitação proteica; Sup = sobrenadante; TCA = ácido tricloroacético; ICP-MS = espectrometria de massa de plasma indutivamente acoplado. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

Um estudo anterior usando isótopos de ferro estáveis para medir o transporte de ferro demonstrou que a deficiência materna de ferro resultou na regulação negativa do exportador de ferro da placenta, FPN⁴. O FPN é o único exportador de ferro de mamíferos conhecido, e a ausência de FPN durante o desenvolvimento resulta em morte embrionária antes de E9,5²⁹. Para determinar se a diminuição observada na expressão de NPF se traduziu funcionalmente em diminuição do transporte plac...

Discussão

O ferro é importante para muitos processos biológicos, e seu movimento e distribuição dentro do corpo são altamente dinâmicos e regulados. Os isótopos estáveis de ferro fornecem uma alternativa consistente e conveniente aos isótopos radioativos para a avaliação da dinâmica da homeostase do ferro. Um passo crítico no protocolo é manter o controle de todos os pesos e volumes de tecido. O ferro é um elemento e, portanto, não pode ser sintetizado nem quebrado. Assim, se todos os pesos e volumes forem cuidadosamente registrad...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Filtro centrífugo ultra-15 Amicon Fe-58
Scientific	14-959-49B		15 mL
, centrífuga	Millipore	Sigma CLS430829
	75002432		Fisher
Scientific, Sorvall Legend RT
Limpadores de tarefas delicadas	Fisher Scientific	06-666
Dieta: deficiente em ferro (4 ppm de ferro)	Envigo Teklad	TD.80396
Dieta: ração padrão (185 ppm de ferro)	PicoLab	5053
Tesoura de dissecação com aresta	de corte de 30 mmVWR	25870-002
Fórceps de 4-1/2 polegadas de comprimento	McKesson	157-469
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
Homogeneizador, Bio-Gen PRO200	PROScientific	01-01200
Apo-transferrina humana (apo-Tf)	Celliance	4452-01	não está mais disponível, alternativa: Millipore 616419
Ácido clorídrico (HCl)	Fisher Scientific	A144S-500
Peróxido de hidrogênio (H2O2), solução de 35% em peso em água	Cole-Parmer	EW-88216-36
Seringas de insulina, BD Lo-Dose U-100	Fisher Scientific	14-826-79
Isoflurano	VETone	502017
Vaporizador de isoflurano	Summit Anesthesia Solutions
Bloco de calor metálico	Fisher Scientific
Tubo de microcentrífuga com tampa de rosca plana	VWR	16466-064
Tubos de microcentrífuga 1,5 mL de baixa retenção	Fisher Scientific	02-681-320
Tubos de microcentrífuga 2,0 mL de baixa retenção	Fisher Scientific	02-681-321
Unidade de filtro de seringa Millex-GP, 0.22 µ m, polietersulfona, 33 mm, esterilizado por gama	Millipore Sigma	SLGP033RS
ácido nitrilotriacético (NTA)	Agulha Sigma	72560-100G
25 G x 5/8 pol. hipodérmica de uso geral	Fisher Scientific	14-826AA
Tiras de pH, plástico pH5.0-9.0	Fisher Scientific	13-640-519
0.22 mm	VWR	55411-050
Balança (g)	Balança Mettler Toledo	PB1502-S
(mg)	Balança Mettler Toledo	XS204
Bicarbonato de sódio (NaHCO3)	Sigma	S5761-500G
Cloreto de sódio (NaCl)	Hidróxido	Fisher Scientific S671-3
(NaOH)	Fisher Scientific	SS266-1
Seringa estéril, ponta deslizante (1 mL)	Fisher Scientific	309659
Ácido tricloroacético (TCA)	Fisher Scientific	A322-500
Software
ImageLab	Bio-Rad
SigmaPlot	Systat