O presente protocolo descreve as diretrizes passo a passo para as técnicas de operação rnai em P. americana.
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Artigo de método
Aplicações de interferência de RNA na barata americana
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Baratas, uma praga sanitária, são espécies essenciais em estudos de desenvolvimento de insetos e metamórficos devido à sua fácil alimentação e características hemimetabólicas. Ao todo com sequências de genomas bem anotadas, essas vantagens fizeram da barata americana Periplaneta americana, um importante modelo de insetos hemimetados. Limitado pela escassez de estratégia de nocaute, o knockdown genético baseado em RNA eficaz (RNAi) torna-se uma técnica indispensável na pesquisa genética funcional da P. americana. O presente protocolo descreve as técnicas de operação RNAi em P. americana. O protocolo inclui (1) seleção do P. americana em estágios de desenvolvimento adequados, (2) preparação para a configuração da injeção, (3) injeção de dsRNA e (4) detecção de eficiência de knockdown genético. RNAi é uma poderosa ferramenta genética reversa em P. americana. A maioria dos tecidos P. americanas são sensíveis ao dsRNA extracelular. Sua simplicidade permite que os pesquisadores obtenham rapidamente fenótipos disfuncionais sob uma ou múltiplas injeções de dsRNA, permitindo que os pesquisadores usem melhor o P. americana para estudos de desenvolvimento e metamórficos.
Introdução
A interferência de RNA (RNAi), um mecanismo evolutivamente conservado, gradualmente se torna uma ferramenta essencial de reversão genética para inibir a expressão genética em muitos organismos1, uma vez que Andrew Fire e Craig Mello2 desenvolveram a estratégia de silêncio genético mediado por duplar (dsRNA). dsRNA é cortado em fragmentos de 21-23 nucleotídeos, pequenas RNAs interferentes (siRNAs), pela enzima Dicer em células para ativar a via RNAi. Em seguida, siRNAs são incorporadas ao complexo de silenciamento induzido pelo RNA (RISC), que casa o mRNA alvo, causa decote mRNA e, finalmente, resulta na perda da função g....
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Protocolo
A linha de P. americana foi inicialmente fornecida pelo Dr. Huiling Hao. Esta espécie tem sido mantida com endogamia por 30 anos9.
1. Incubação e alimentação de P. americana
- Colete oothecae fresco (imediatamente pós-colocação de ovos) de P. americana e incubar na incubadora escura a 25 °C e 60% de umidade por ~25 dias. Em seguida, aumente a temperatura e a umidade para 30 °C e 75% 3 dias antes do eclosão.
- Use uma peneira com abertura de 4 mm para separar as ninfas eclodidas da oothecae.
- Mantenha as ninfas em recipientes cilíndricos (12 cm de di....
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Resultados
A figura 1 mostra uma injeção bem sucedida. A seringa de microinjeção com uma agulha de micro diâmetro deve ser colocada horizontalmente no propulsor (Figura 1A). A agulha é inserida através da lacuna entre duas somitas abdominais horizontalmente contra a epiderme (Figura 1B). Certifique-se de que o líquido vai para o abdômen P. americana . O ângulo muito íngreme da agulha danificará os órgãos internos (
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Discussão
Este relatório descreveu uma estratégia metodológica passo a passo da RNAi em P. americana; note-se que também pode ser aplicado a outras baratas (Blattella germanica, por exemplo) e muitos outros insetos com pequenas alterações. No entanto, a eficiência de silenciamento genético da RNAi nem sempre é alta o suficiente, com uma desvantagem óbvia em comparação com a estratégia de nocaute genético13. O seguinte efeito residual do nível genético pode interferir com os fenótipos reais.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm conflitos de interesse.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (Grant No. 32070500, 31620103917, 31330072, e 31572325 à C.R., Sh.L.), pela Fundação de Ciência Natural da Província de Guangdong (Grant No. 2021B1515020044 e 2020A1515011267 a C.R.), pelo Departamento de Ciência e Tecnologia da Província de Guangdong (Grant No. 2019B090905003 e 2019A0102006), pelo Departamento de Ciência e Tecnologia de Guangzhou (Grant No. 202102020110), pelo Shenzhen Science and Technology Program (Grant No. KQTD20180411143628272 para Sh.L.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 701 N 10 µ L Syr (26s / 51/2) | Hamilton | PN: 80300 | |
| Incubadora | injeção Ningbo Jiangnan Instrument Factory | RXZ-380A-LED | Para incubação e alimentação de baratas |
| Bomba de microinjeção | Alcott Biotechnology | ALC-IP600 | Injeção |
| pTOPO-Blunt Cloning Kit | Aidlab Biotechnology | CV16 | para clonagem |
| de genes quantitativos Sistemas de PCR em tempo real | Bio-Rad | CFX Connect | Para análise de qRT-PCR |
| T7 RiboMAX Express RNAi System | Promega | P1700 | Para síntese de dsRNA, que contém Rnase A Solution (4 μ g/μ L), Acetato de Sódio, 3,0M (pH 5,2), Mistura de Enzimas, T7 Express, Água Livre de Nuclease, Tampão Express T7 2x, Cicladores Térmicos DNase Livres de RNase RQ1 |
| Bio-Rad | S1000 | Para amplificação de DNA |
Referências
- Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum: Parameters affecting the efficiency of RNAi. PloS One. 7 (10), 47431(2012).
- Fire, A., et al.
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Reimpressões e permissões
